Detta manuskript beskriver ett experimentellt tillvägagångssätt för att morfologiskt och biokemiskt karakterisera hästocyter. Specifikt illustrerar föreliggande arbete hur man samlar omogena och mogna hästocyter genom ultraljudstyrd äggupphämtning (OPU) och hur man undersöker kromosomsegregation, spindelmorfologi, global histonacetylering och mRNA-uttryck.
Fältet assisterad reproduktion har utvecklats för att behandla infertilitet hos kvinnor, följeslagare och hotade arter. I hästen tillåter assisterad reproduktion också framställning av embryon från högpresterande utan att avbryta sin idrottskarriär och bidrar till en ökning av antalet föl från marer av högt genetiskt värde. Det nuvarande manuskriptet beskriver de förfaranden som används för att samla omogna och mogna oocyter från hästjuvarier med hjälp av äggplockning (OPU). Dessa oocyter användes sedan för att undersöka förekomsten av aneuploidi genom att anpassa ett protokoll som tidigare utvecklats i möss. Speciellt märktes kromosomerna och centromererna av metafas II (MII) -ocyter fluorescens och räknades på sekventiella fokalplaner efter konfokal lasermikroskopskanning. Denna analys avslöjade en högre incidens i aneuploiditetsfrekvensen när omogna oocyter uppsamlades från folliklarna och mognades in vitro jämfört medIn vivo. Immunostaining för tubulin och den acetylerade formen av histon fyra vid specifika lysinrester avslöjade också skillnader i den meotiska spindelens morfologi och i det globala mönstret av histonacetylering. Slutligen undersöktes uttrycket av mRNA som kodar för histon-deacetylaser (HDAC) och acetyltransferaser (HAT) genom omvänd transkription och kvantitativ PCR (q-PCR). Inga skillnader i det relativa uttrycket av transkript observerades mellan in vitro och in vivo mogna oocyter. I överensstämmelse med en allmän tystnad av transkriptionsaktiviteten under oocytmognad kan analysen av det totala transkriptionsmängden endast avslöja mRNA-stabilitet eller nedbrytning. Dessa resultat tyder på att andra översättnings- och posttranslationella regler kan påverkas.
Sammanfattningsvis beskriver den föreliggande studien ett experimentellt tillvägagångssätt för att morfologiskt och biokemiskt karakterisera hästocyten, en ceLl typ som är extremt utmanande att studera på grund av låg tillgänglighet i provet. Det kan dock utöka vår kunskap om reproduktiv biologi och infertilitet hos monovulatoriska arter.
Ett brett spektrum av assisterade reproduktionstekniker har utvecklats för att behandla infertilitet hos kvinnor, följeslagare och utrotningshotade arter. Ett av de vanligaste förfarandena i kliniska inställningar är hämtning av metafas II (MII) -stage-oocyter från äggstocksfolliklarna genom ultraljudstyrd transvaginal aspiration, upptagning av ägg (OPU) 1 . Dessa oocyter befruktas sedan in vitro (IVF), med det resulterande embryot (erna) implanterade i en mottagare uterus. MII-stegen (mogna) oocyter hämtas efter administrering av exogena gonadotropiner. Denna behandling är dock associerad, hos vissa patienter, med utvecklingen av ovarie hyperstimuleringssyndrom (OHSS) 2 .
Att utnyttja den inre förmågan hos fullvuxna, omogna oocyter (GV-scenen) för att spontant återuppta meioser, när de en gång är isolerade från deras folliklar, är det möjligt att erhålla mogna oocyter utan adminisGonadotropin 3 . Denna procedur kallas oocyt in vitro mognad (IVM) och representerar en mindre läkemedelsinriktad, billigare och mer patientvänlig inställning till assisterad reproduktiv teknik. Emellertid är framgången med embryonutveckling med in vitro- mättade oocyter generellt lägre än hos in vivo mogna oocyter 4 , 5 . En möjlig förklaring är att in vitro- mogna oocyter påverkas mer av fel i kromosomsegregation, och den resulterande aneuploidin försvårar normal embryonal utveckling 6 .
Förstå den molekylära grunden för kromosomal miss-segregering under IVM skulle i slutändan avslöja den fulla potentialen i denna teknik. I den här venen användes det experimentella tillvägagångssättet för att undersöka de morfologiska och biokemiska egenskaperna hos in vitro- malda oocyter jämfört med in vivo maturEd oocyter beskrivs här 7 , 8 . Specifikt illustreras procedurerna för OPU hos omogna och mogna oocyter och IVM hos omogna oocyter med användning av vuxna och naturligt cyklande hästar som en experimentell modell. Därefter används immunfluorescens och bildanalys för att undersöka kromosomsegregation, spindelmorfologi och det globala mönstret av histonacetylering på dessa gameter. Slutligen beskrivs ett protokoll med omvänt transkription och kvantitativ PCR för analys av mRNA-uttryck.
Jämfört med gnagodjurmodeller tillåter hästar inte genetisk manipulation, är mindre lätt att manipulera, och kräver dyrt underhåll. Emellertid får denna modell ett stort intresse för studien av oocytmognad 9 , 10 på grund av likheten med mänsklig äggstocksfysiologi 11 , 12 </ Sup>. Vidare har utvecklingen av tillförlitliga protokoll för IVM-IVF i hästen ett väsentligt ekonomiskt intresse, eftersom det skulle möjliggöra en ökning av antalet föl från marer med högt genetiskt värde.
En av begränsningarna för att utföra experiment på oocyter, särskilt i monovulatoriska arter, är det begränsade provets tillgänglighet. Denna gräns har övervinnats här genom att justera ett tillvägagångssätt, tidigare utvecklat i möss, till hästocyter 13 , 14 för att utföra kromosomräkning som minimerar provförlusten (se diskussionen för jämförelse med andra tillgängliga tekniker). Vidare har ett triple-fluorescensfärgningsprotokoll optimerats för att utföra flera analyser på samma prov, och q-PCR-analyser utfördes endast på pooler med endast 2 oocyter.
Sammantaget beskriver den föreliggande studien ett experimentellt tillvägagångssätt som syftar till att morfologiskt och biokemiskt chaRacterize hästen oocyt, en celltyp som är extremt utmanande att studera på grund av låg tillgänglighet. Det kan emellertid expandera vår kunskap om reproduktiv biologi och infertilitet hos monovulatoriska arter.
Trots att IVM har utförts på hästar i över 20 år 16 , vet vi inte om oocyten kan vara ursprunget till embryonal aneuploidi, vilket har föreslagits för människor 17 . Anledningen är förmodligen att beredningen av oocytspridningar för kromosomräkning resulterar i avsevärd provförlust. Med detta i åtanke genomfördes en undersökning av metoderna för undersökning av fel i kromosomsegregation för att söka efter den lämpligaste tekniken för att applicera p?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Fabrice Vincent för supporten med laserscanning-konfokal mikroskopi (LSCM) , och Philippe Barrière och Thierry Blard för att utföra daglig ultraljud ovariescanning och hCG-injektion. Detta arbete stöddes delvis av projektet "Regione Sardegna och Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (bidrag nr 26096200 till AML). "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" gemenskap (kontrakt 2012 till FF), FP7-PEOPLE-2011-CIG, forskningsförvaltningsbyrån (REA) "Pro-Ovum" (bidrag nr 303640 till VL) Och av doktorandskolan för jordbruk och veterinärmedicin, medfinansierad av Europeiska socialfonden, sektors operativt program för mänsklig resursutveckling 2007-2013 (kontrakt nr POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 till IM). In vivo- oocytkollektionen finansierades av Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
incubator | Heraeus | BB6060 | |
monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |