Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

تطور ال Published: July 30, 2017 doi: 10.3791/55272
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory

Summary

هنا، نحن نذكر المراحل المختلفة التي تنطوي عليها التنمية القائمة على المعرفة من ميكروسيكتيسيد فعالة، بما في ذلك العزلة وتحديد وفحص واختيار "الأنسب" الفطريات الممرضة للحشرات، ميتارهيزيوم أنيسوبلياي ، للسيطرة على الآفات الحشرية في الزراعة .

Abstract

وهناك قلق كبير عند تطوير ميكوسينتكتيديسيدس التجارية هو سرعة قتل مقارنة مع المبيدات الكيميائية. لذلك، العزلة والفحص لاختيار سريع المفعول، الفطريات حشرات شديدة الفطريات هي خطوات هامة. الفطريات الممرضة، مثل ميتارهيزيوم، بوفيريا، و نوموريا ، التي تعمل عن طريق الاتصال، هي أكثر ملاءمة من عصيات ثورينجينزيس أو نوكليوبوليهيدروسيس فيروس (نبف)، والتي يجب تناولها من قبل الآفات الحشرية. في هذا العمل، عزلنا 68 سلالة ميتارهيزيوم من الحشرات المصابة باستخدام طريقة تخفيف التربة والطعم. تم التعرف على العزلات عن طريق التضخيم وتسلسل المنطقة ITS1-5.8S-ITS2 و 26S ردينا. تم اختيار السلالة الأكثر شراسة من ميترهيزيوم أنيسوبلياي استنادا إلى تركيز قاتلة متوسط ​​(لك 50 ) والوقت (لوت 50 ) التي تم الحصول عليها في الاختبارات البيولوجية الحشرات ضد يرقات إي-إنستار هيليكوفيربا أرميجيرا.وقد تم الإنتاج الضخم من الأبواغ من سلالة مختارة مع التخمير الحالة الصلبة (سف) باستخدام الأرز كركيزة لمدة 14 يوما. تم استخراج الجراثيم من الكتلة الحيوية المتناثرة باستخدام 0.1٪ توين-80، وتم تحضير تركيبات مختلفة من الجراثيم. أجريت تجارب ميدانية للصيغ من أجل السيطرة على إصابة H. أرميجيرا في البازلاء الحمامة بواسطة تصميم العشوائية. وكانت مستويات السيطرة على العدوى التي تم الحصول عليها بالزيت والتركيبات المائية (78.0٪ و 70.9٪ على التوالي) أفضل من 63.4٪ التي تم الحصول عليها بالمبيدات الكيميائية.

Introduction

ومنذ إدخال مبيدات الآفات العضوية الكلورية في الأربعينات في الهند، زاد استخدام مبيدات الآفات بأكثر من 1 أضعاف، حيث لا تزال آفات المحاصيل تكلف بلايين الروبية 2 سنويا من حيث خسارة الغلة في الإنتاج الزراعي. ويشكل الاستخدام الواسع النطاق وغير الحكيم للمبيدات الاصطناعية تهديدا مستمرا للبيئة وصحة الإنسان 1 . ويؤدي الاستخدام العشوائي لمبيدات الآفات إلى بقايا التربة واستنزاف الحيوانات المفترسة للآفات. كما أنه بمثابة ضغط اختيار قوي لتغيير التركيب الجيني من السكان الآفات، مما يؤدي إلى تطوير المقاومة 1 . وعلى الرغم من الفوائد الهائلة للثورة الخضراء، التي تتطلب مدخلات عالية، مثل الأسمدة ومبيدات الآفات، لا تزال الآفات تشكل قيدا حيويا رئيسيا. وهناك تقدير عام للخسائر السنوية المسجلة في المحاصيل في الهند وفي جميع أنحاء العالم يبلغ 12 مليار دولار أمريكيإف "> 2 و 2،000 مليار دولار أمريكي 3 ، على التوالي.

وعندما تكون للمبيدات الكيميائية آثار ضارة عند استخدامها لمكافحة الآفات الحشرية، يصبح من الضروري البحث عن طرق بديلة سليمة بيئيا وموثوق بها واقتصادية ومستدامة. وتوفر المكافحة البيولوجية بديلا مناسبا وتشمل استخدام الطفيليات والحيوانات المفترسة ومسببات الأمراض الميكروبية 4 . الفطريات، على سبيل المثال، من المعروف أنها تصيب مجموعة واسعة من الآفات الحشرية، بما في ذلك ليبيدوبتيرانز، هيمينوبتيرانز، كولوبتيرانز، و ديبتيرانز، وغالبا ما يؤدي إلى إبيزوتيكس الطبيعية. وعلاوة على ذلك، على عكس عوامل مكافحة الحشرات البكتيرية والفيروسية الأخرى، فإن طريقة عمل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية هي عن طريق الاتصال 5 . هذه الفطريات تتكون من مجموعة غير متجانسة من أكثر من 100 جنسا، مع ما يقرب من 750 الأنواع المبلغ عنها بين الحشرات المختلفة. مسببات الأمراض الفطرية مهمة هي: س متارهيزيوم، البوفيرية الصورةص، نومورايا ريلي ، ليكانيسيليوم ليكاني ، و هيرسوتيلا سب.، على سبيل المثال لا الحصر 6 . M. أنيسوبلياي (ميتشنيكوف) سوروكين هو ثاني أكثر الفطريات الممرضة للحشرات المستخدمة على نطاق واسع في المكافحة الحيوية. ومن المعروف أن مهاجمة أكثر من 200 نوعا من الحشرات 7 .

في هذه الدراسة، يتم عرض مراحل مختلفة تشارك في التنمية القائمة على المعرفة من ميكوبيستيد باستخدام M. أنيسوبلياي . وهذا يشمل: 1) تحديد مصدر ( أي التربة أو الحشرات الميكوسيد) لممرضات الحشرات الفطرية، 2) تحديد الممرضات واختيارها، 3) استراتيجيات للحفاظ على طبيعتها الفوعة وفعاليتها في الفحص الحيوي للمختبر وفي الميدان، 4 ) صياغة فعالة من حيث التكلفة من البكتيريا العدوى، 5) تطوير فريدة من نوعها لمراقبة الجودة المعلمات لإعداد فادحة، و 6) التنقيب البيولوجي وإضافة القيمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل الفطريات الممرضة

  1. طريقة تخفيف التربة
    1. جمع عينات التربة والحشرات الميكوسيد من حقول المحاصيل المختلفة ( الجدول 1 ). عزل الفطريات الممرضة من عينات التربة باستخدام طريقة تخفيف التربة الطلاء 8 .
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تم جمع العينات من بيون (18 ° 31'13''N، 73 ° 51'24''E) و بولدانا (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E )، المناطق، مهاراشترا، الهند.
    2. وزن 10 غرام من كل عينة التربة وإضافتها بشكل منفصل إلى 90 مل من العقيمة 0.1٪ (ث / ت) توين -80.
    3. مزيج تماما من العينات باستخدام النمام المغناطيسي لمدة 60 دقيقة للافراج عن جراثيم التمسك جزيئات التربة.
    4. بعد الخلط، وانتشر 100- إلى 200 ميكرولتر قسامات من كل عينة على وسط انتقائي تحتوي على (ز / ل): الببتون، 10؛ الجلوكوز، 20؛ أجار، 18؛ الستربتومايسين، 0.6؛ التتراسيكلين، 0.05؛ مراكز الشباب الإصلاحيةلوهيكساميد، 0.05؛ و فود، 0.1 مل. الرقم الهيدروجيني 7.0 9 . احتضان لوحات في 28 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام.
    5. حدد و سوبولتشر الفردية المستعمرات سبورولاتينغ على نفس المتوسطة للحصول على الثقافات النقية.
  2. من الحشرات ميكوسيد
    1. جمع الحشرات ميكوسيد من الميدان.
      ملاحظة: من المرجح أن يصاب الجسم الفصلي اليرقات مع الفطريات الممرضة. مع عدوى بكتيرية أو فيروسية، الجسم الحشرات الميت لينة.
    2. جمع الحشرات الحية مع السلوك الشاذ، وضعف التنسيق، وحركات متشنج.
    3. الحفاظ على الحشرات حتى الموت ومن ثم نقلها إلى غرف رطبة لمزيد من الفطار و سبورولاتيون، إن وجدت، في 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر.
    4. يمزق الجراثيم من الجثث سبورولاتينغ على المتوسطة انتقائية المذكورة أعلاه والحصول على الثقافات النقية من خلال المزيد من زراعة فرعية 2-3 مرات على نفس المتوسط.
  3. طريقة الطعم
    1. فيقارورة (3.85 × 6.0 سم) تحتوي على 60 غرام من عينة التربة، إضافة 4 يرقات عثة الأرز ( كورسيرا سيفالونيكا ) والحفاظ على قارورة في 25 ± 2 درجة مئوية لمدة 14 يوما.
    2. بدوره قارورة رأسا على عقب كل يوم. بعد 14 يوما، شاشة عينات التربة لوجود ميكوسد يرقات عثة الأرز. عزل الفطريات الممرضة عن طريق تسليط الجراثيم من الجثث تنفخ على وسط انتقائي.
    3. بعد الحصول على الثقافات نقية، ونقل العزلات إلى أجار البطاطا سكر العنب (بدا) موانع واحتضان عند 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر لمدة 7 أيام للسماح سبورولاتيون. بعد سبورولاتيون، والحفاظ على الثقافات الأم في 8 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تحديد الفطريات الممرضة

  1. تحديد الفطريات الممرضة عن طريق مراقبة الخصائص المورفولوجية، ( أي حجم وشكل الجسيمات الجنسية وترتيب الجراثيم على كونيديوفوريس)؛ عزلات من 3 أجناس رئيسية، ميتارهيزيوم ، بيوف إريا ، و نومورايا ، يمكن تحديدها.
  2. لتحديد الجزيئات من سلالات ميتارهيزيوم ، استخراج الحمض النووي الجيني من الكتلة الحيوية ميسيليال باستخدام مجموعة العزلة الحمض النووي. اتبع تعليمات الشركة الصانعة (راجع جدول المواد ). التحقق من جودة الحمض النووي الجيني من خلال إجراء الكهربائي على هلام الاغاروز 0.8٪.
    1. ير-تضخيم منطقة ITS1-5.8S-ITS2 و 26S ردينا. استخدام الحمض النووي الجيني كقالب، مع ITS1 إلى الأمام (تسغتاغاكتغغ) و ITS4 عكس (تكتسغكتاتاتاتغك) الاشعال 10 .
    2. هلام أزل وتنقية أمبليكونس حجم المتوقع باستخدام مجموعة استخراج هلام. اتبع تعليمات الشركة الصانعة (راجع جدول المواد ). تحديد أمبليكون المنقى وتسلسل.
    3. قراءة وتحرير تسلسل باستخدام البرنامج وإجراء بحث بلاست من تسلسل النوكليوتيدات في نسبي مكتبة البيانات بنك الجينات لتحليل التماثل وثيقة= "كريف"> 11.
    4. إيداع تسلسل المعزولات التي تم تحديدها من قبل الممرضات إلى قاعدة بيانات بنك الجينات الوطنية نسبي لاسترداد أرقام الانضمام.

3. فحص ميترهيزيوم يعزل ضد H. أرميجيرا

  1. تربية الحشرات
    1. إنشاء ثقافة أولية من H. أرميجيرا من خلال جمع اليرقات الصحية والخشرات من الحشرات من الميدان.
    2. للتربية، وتنمو اليرقات بشكل فردي في قارورة البولي بروبيلين العقيمة (3.85 × 6.0 سم، سعة 50 مل) تحتوي على قطع من البامية تطهيرها مع 0.5٪ (V / V) هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقيقة 12 .
    3. جمع البيض الحشرات وضعت خلال تربية سطح تعقيمها مع 0.5٪ (V / V) هيبوكلوريت الصوديوم.
    4. الحفاظ على اليرقات في 25 ± 2 درجة مئوية و 65 ± 5٪ ر.
  2. بيوساي الحشرات
    ملاحظة: ل بيوساي الحشرات، وإنتاج الجراثيم،ودراسات الأداء الميداني، واستخدمت الثقافات الفرعية الأولى من سلالات ميتاريزيوم من ميكروسد H. أرميجيرا اليرقات، ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. للحشرات الحيوية الحشرات، واستخدام يرقات الثالث-إنستار من H. أرميجيرا .
    2. تراجع مجموعة من اليرقات 30 في ثلاث مرات على حدة في تعليق بوغ 10 مل من العزلات ميتارهيزيوم (1 × 10 7 الجراثيم / مل، ما لم يذكر خلاف ذلك؛ الجدوى> 90٪) لمدة 5 ثوان.
    3. بعد العلاج، ونقل كل يرقة على حدة إلى منفصلة، ​​قارورة معقمة لتجنب أكل لحوم البشر. إلى كل قارورة، إضافة رطبة ورقة مرشح ماتمان رقم 1 وقطعة من البامية تطهيرها كعلف. تغيير الورق والأعلاف في أيام بديلة.
    4. الحفاظ على اليرقات في 25 ± 2 درجة مئوية، 65 ± 5٪ ر، و 16: 8 ضوء: الظلام لمدة 14 يوما أو حتى يموتون.
    5. نقل اليرقات الميتة إلى لوحات بتري معقمة تحتوي على مسحات القطن رطبة والاحتفاظ بها في 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر لمدة 3-7 أيام للسماح الميسليا وبوغتشكيل، بالقرب، ال التعريف، كادافيرز.
    6. للرقابة، وعلاج مجموعة من 30 اليرقات في ثلاث نسخ مع 0.1٪ (ث / ت) توين-80 في الماء المقطر المعقم.
    7. إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ باستخدام معلقات بوغ الطازجة. جمع وتجميع البيانات عن الوفيات في المئة من ثلاث تجارب للحصول على القيم المتوسطة. حساب نسبة الوفيات المصححة باستخدام صيغة آبوت 13 .
    8. إجراء التجارب باستخدام تصميم تصميم كتلة كاملة العشوائية (رسيبد)، مع كل معاملة تحتوي على مجموعة من 30 اليرقات في ثلاث نسخ. استنادا إلى نسبة الوفيات ضد H. أرميجيرا ، حدد العزلات ميتارهيزيوم لمزيد من فحص أفضل العزلة للإنتاج التجاري.
    9. حدد العزلات مما يدل على> 90٪ وفيات ضد H. أرميجيرا يرقات الثالث-إنستار.
      ملاحظة: تم اختيار 12 عزلة.
    10. تحديد لوت 50 من هذه العزلات وحدد العزلات مظاهرةتصنيف أسرع قتل (في وقت أقل).
      ملاحظة: هنا، تم اختيار 5 عزلات من 12 عزلة أقوى.
    11. تحديد القيم 50 لك من العزلات المحددة باستخدام أربعة تركيزات مختلفة (أي 1 × 10 3 ، 1 × 10 5 ، 1 × 10 7 ، و 1 × 10 9 الجراثيم / مل) من تعليق بوغ.
    12. تحديد لك 50 من العزلات ميتاريزيوم ضد يرقات إي-إنستار من H. أرميجيرا لزيادة إمكانية تحديد الفرق في الفوعة من العزلات مع ارتفاع معدلات الوفيات التي قد لا يتم الكشف عنها إذا تم استخدام جرعة واحدة فقط.

4. إنتاج جراثيم ميتارهيزيوم عزل لدراسات الأداء الميداني

  1. إنتاج جراثيم ميتارهيزيوم بواسطة سف
    1. ل سف، وإعداد اللقاح عن طريق إضافة 2 × 10 7 الجراثيم من العزلات ميتاريزيوم ل200 مل من يبغ (0.3٪ استخراج الخميرة، 0.5٪ الببتون، و 1.0٪، الجلوكوز) المتوسطة. احتضان القوارير عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (180 دورة في الدقيقة) لمدة 48 ساعة.
    2. لانتاج كميات كبيرة من الجراثيم عن طريق سف، واستخدام الأرز كركيزة ما لم يذكر خلاف ذلك.
    3. ل سف، وملء أكياس الأوتوكلاف (نوع / 14 مع مرشح ميكروفنتيد واحد من 0.5 ميكرون؛ 2 كجم سعة؛ 64 × 36 سم) مع 2 كجم من الأرز. إضافة 1000 مل من الماء المقطر إلى الأرز في الحقائب وينقع بين عشية وضحاها 14 . الأوتوكلاف أكياس مع الأرز غارقة في 121 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة 15 .
    4. تطعيم أكياس مع 48-h القديم اللقاح العضلي (10٪ اللقاح، 200 مل ل 2 كجم من الأرز) واحتضان عند 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر لمدة 14 يوما.
    5. حصاد الجراثيم عن طريق استخراج السائل باستخدام 0.1٪ توين -80. لهذا، إضافة محتويات الحقيبة إلى 0.1٪ توين -80 (3 لتر لكل 1 كجم من الأرز)، وتخلط جيدا، وفصل الجراثيم من السائل عن طريق الطرد المركزي، وجافة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 يوما. < / لى>
    6. بدلا من ذلك، تجفيف الحقائب التي تحتوي على الأرز مع الجراثيم وبعض ميسيليا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام للحد من محتوى الرطوبة (<20٪). حصاد الأبواغ باستخدام حاصدة ميكو أو فيبرو-المغربل.
  2. دراسات الجدوى
    1. تحديد الجدوى في المئة من الجراثيم المحصودة باستخدام أساليب مختلفة 15 . لهذا، وإعداد تعليق بوغ في 0.1٪ (ث / ت) توين-80 وضبط العد إلى 1 × 10 3 الجراثيم / مل.
    2. نشر تعليق بوغ (0.1 مل) على لوحات بدا في ثلاث نسخ واحتضان عند 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر لمدة 72 ساعة.
    3. عد يدويا المستعمرات معزولة وتحديد مجموع عدد قابل للتطبيق للعينة المعنية.
  3. بوغ معدل الترسيب
    1. لجرعة موحدة، مطلوب تعليق بوغ متجانسة. تحديد معدلات الترسيب بوغ لعزلات ميتارهيزيوم كما هو موضح"كريف"> 16. تحقق من معدلات الترسيب من الأبواغ في 0.2 M كبريتات الأمونيوم و 0.1٪ توين -80.
    2. ضبط عدد من تعليق بوغ إلى ~ 7 × 10 7 الجراثيم / مل للحصول على الامتصاصية الأولية من 0.6 في 540 نانومتر. السماح لل كوفيتس للوقوف دون عائق لمدة 6 ساعات للجراثيم لتسوية.
    3. سجل الامتصاصية لمدة تصل إلى 6 ساعات. التعبير عن معدل الترسيب في المئة وحساب الوقت اللازم ل 50٪ الترسيب (ست 50 ). كرر التجربة ثلاث مرات باستخدام تعليق بوغ الطازجة.

5. دراسات الأداء الميداني لقدرة M. أنيسوبلياي مختارة عزل للسيطرة H. أرميجيرا في حمامة البازلاء

  1. مسحوق بلان صياغة M. أنيسوبلياي M 34412 الجراثيم
    1. إعداد 2.5-5٪ مسحوق مسحوق قابل للبلل عن طريق خلط الجراثيم مع التلك.
    2. ضبط العد القابل للحياة النهائي (تفك) إلى 1 × 10 12 سبوريس لكل كيلوجرام من صياغة.
  2. دراسات الأداء الميداني لل M. أنيسوبلياي M 34412 الجراثيم
    1. لدراسات الأداء الميداني لقدرة M. أنيسوبلياي مختارة العزلة للسيطرة على H. أرميجيرا الإصابة في البازلاء حمامة، واستخدام رسيبد مع أربعة مكررات.
      ملاحظة: هنا، يؤدى في المهاتما فول كروشي فيديابيث (مكف)، راهوري (19.3927 ° شمالا، 74.6488 ° ه).
    2. استخدام اثنين من تركيبات رذاذ مختلفة، ووضع النفط من الجراثيم (5 × 10 12 الجراثيم / 3 لتر من الديزل: زيت عباد الشمس، 7: 3) ووضع مائي في توين 80 (0.1٪). رذاذ تركيبة الزيت بخاخ منخفض الحجم (أولف) بخاخ (70 دقيقة، 3 لتر / هكتار) التركيب المائي بخاخ حقيبة (5 × 10 12 جراثيم، 500 لتر / هكتار).
      ملاحظة: هنا، تم تسجيل السكان اليرقات قبل يوم واحد من الرش و 3 و 7 أيام بعد تطبيق كل رذاذ على 5 النباتات التي تم اختيارها عشوائيا. وكان مجموع السكان ررانسفورمد إلى الجذر التربيعي لل n + 1 للتحليل الإحصائي.
      1. وفقا للممارسات الزراعية لمحصول البازلاء الحمامة، وإجراء الرش الأول بين 10 و 15 د بعد وضع البيض و 2 مرات أكثر مع فترة 14 يوما. إجراء الرش بين 16:00 حتي 18:00 ح إست. مراقبة اتجاه الرياح، وإذا لزم الأمر، واستخدام الستائر القماش لتجنب الانجراف من الجراثيم إلى المؤامرات المجاورة.
    3. للمقارنة، رش المبيدات الكيميائية مع اليد ضغط حقيبة بخاخ اليد.
    4. تحديد استمرار اللقاح في الميدان من خلال جمع اليرقات . أرميجيرا 0، 3، 5، 7، و 14 يوما بعد الرش.
    5. إبقاء هذه اليرقات تحت الملاحظة لمدة 14 يوما وبعد الموت، ونقلها إلى قارورة بلاستيكية تحتوي على ورقة مرشح رطبة. احتضان في 25 ± 2 درجة مئوية و 70 ± 10٪ ر لمراقبة الفطريات.
    6. تحديد استمرار اللقاح على السكان اليرقات على أساس ص بيانات الوفيات من اليرقات التي تم جمعها من الحقل بعد الرش.
    7. تقييم الدراسات الميدانية على أساس فعالية في المئة 17 ، الضرر جراب في المئة، ونسبة العائد 18 .
      ملاحظة: هنا، تم تسجيل البيانات الخاصة بالمعلمات مثل درجة الحرارة والرطوبة وسرعة الرياح (كم / ساعة) وأشعة الشمس (h) والأمطار (مم) والأيام الممطرة والتبخر (مم) أغريكولتشر ونيفرزيتي (مهاتما فول كروشي فيديابيث، راهوري، 19.3927 ° ش، 74.6488 ° ه).
  3. برنامج املزارعني التشاركي
    1. حدد عدد المزارعين للمحاكمات التجريبية. توريد بذور حمامة البازلاء (بسمر - 736) جنبا إلى جنب مع الأسمدة للمزارعين.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، شارك 20 مزارعا. القرية: ديولالي برافارا، (19.473 ° ش 74.6 ° ه).
    2. استخدام نفس تركيبات الرش وعدد من الرش كما في الخطوة 5.2.
تيل "> 6. تأثير على الكائنات غير المستهدفة

  1. مراقبة تأثير رذاذ ميكوسكتيسيد، إن وجدت، على أوراق البازلاء حمامة.
  2. جمع المفصليات مسكن التربة والحشرات يسكن ورقة 1 يوم بعد كل معاملة في المؤامرات غير المعالجة وفي المؤامرات تعامل مع M. أنيسوبلياي .
  3. جمع المفصليات التي تعيش في التربة مع مصائد الفخاخ في غضون 24 ساعة بعد العلاج وجمع الحشرات التي يسكنها ورقة مع شبكة الاجتياح في الصباح بعد العلاج ( أي حوالي 15-18 ساعة بعد العلاج).
  4. إبقائها بشكل فردي في صناديق بلاستيكية اسطوانية بأقطار 3.5 سم وارتفاعات 4.0 سم. تحقق من الحشرات يوميا للعدوى وتغذية لهم الطعام المناسب.
  5. تسجيل وجود M. أنيسوبلياي ، إذا كان على الإطلاق، وعزل الفطر.

7. تحديد معايير الجودة السيطرة

  1. تحقق بقاء الجراثيم عن طريق قياس إنبات بوغ على بدا في 28 درجة. C.
  2. قياس إهاب الأنشطة انزيم المهينة، مثل الكيتيناز، الكيتين ديستيلاز، الشيتوزاناس، البروتيني، و ليباز، التي تنتج في يبغ وكيتين وسائل الإعلام، كما هو موضح في وقت سابق 15 .
  3. تحديد نسبة الوفيات من H. أرميجيرا في المختبر الحيوي 15 .
  4. استخدام علامات الجزيئية، مثل نمط ير-رفلب من شيتيناسيس ( شيت 1 ، 2 ، و 4 ) والبروتياز ( Pr1A ) الجينات، وسمات الفوعة ل M. أنيسوبلياي .
    1. استخراج الحمض النووي الجيني من الكتلة الحيوية ميسليا باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي 15 . PCR-تضخيم Chit1 وChit2 شظايا الجينات باستخدام الحمض النووي الجيني كقالب، مع أزواج التمهيدي Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) وChit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). ل Chit4 ، استخدم زوج التمهيدي Chit4F / Chit4R (أتغكاغاكاكتاك / كتغاتك غتكتاغتغ).
    2. لتضخيم الجين Pr1A، استخدم الزوج التمهيدي METPR2 و METPR5 (أغتاغكاغكاغغك / تسكاكتغغسغسغ).
    3. أداء الهضم تقييد 19 من الجينات Chit1 مع BsaJI، BstUI، وScrFI. من الجين Chit2 مع ألوي، HpyCH4IV، وHpyCH4V، ومن الجين Chit4 مع BstUI، HaeIII، ومبوا. لهضم الجين Pr1A ، استخدم رساي ، ددي ، و مسبي 20 .
    4. مراقبة التقييد طول جزء شظية تعدد الأشكال (رفلب) نمط على 1.5٪ هلام الاغاروز عن طريق الكهربائي لكل جين لمعظم سلالات فظيعة (> 90٪ وفيات)؛ وهذا يمكن أن تستخدم علامة الفوعة لاختيار M. أنيسوبلياي .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلال التحقيقات، تم عزل سلالات مختلفة من ميتارهيزيوم، بوفيريا، نومورايا بطرق عزل مختلفة (لا تظهر البيانات) 6 ، 14 كما تم العثور على سلالات ميتارهيزيوم لتكون أكثر فعالية في السيطرة على H. أرميجيرا ، الآفات المروعة في البقول 6 ، 14 ، واستهدفت العزلات الأخرى لعزل سلالات ميتارهيزيوم من حقول المحاصيل والحشرات المختلفة ( الجدول 1 ). وقد تم تحديد مجموع 68 عزلة ميتارهيزيوم التي تم الحصول عليها من قبل الخصائص الثقافية والمورفولوجية و إيتس 1-5.8S-إيتس 4 التسلسل. واستنادا إلى <90٪ من الوفيات من H. أرميجيرا في الاختبارات البيولوجية المختبرية، تم اختبار 12 العزلات ميتارهيزيوم أخرى لإنتاج بوغ، وقابلية البقاء، لك 50 ، لوت 50 ، و ست 50 . ويصف الجدول 2 البياناتل 3 عزلات محتملة، M34311، M34412، و M81123؛ وقد وجد أن M34412 هو العزلة الأفضل أداء.

ومن بين الركائز التي تم اختبارها، مثل الأرز والذرة الرفيعة والذرة والقمح، دعم الأرز أقصى قدر من التبخر في حالة عزلات ميتاريزيوم (60-75 غرام من الجراثيم / كغ، 4-4.4 × 10 10 جراثيم / جم من مسحوق بوغ) .

خلال التجربة الميدانية للسيطرة على H. أرميجيرا في البازلاء الحمامة، تم الحصول على 78.0٪ و 70.9٪ إفكاسيز مع النفط M. أنيسوبلياي M34412 والتركيبات المائية، على التوالي . تم العثور على تلف القرون في M. أنيسوبلياي قطع الأراضي التي تم إنشاؤها لتكون أقل (8.76٪) مما كانت عليه في قطع السيطرة غير المعالجة (23.63٪) والمؤامرات المعالجة كيميائيا (10.24٪). وكان متوسط ​​الغلة (q / هكتار) في السيطرة غير المعالجة 7.31 ف / هكتار، وهو أقل من ذلك بعد العلاج M. أنيسوبلياي M34412 (14.04 ف / هكتار). أعطى العلاج بالکیماویات عائد قدره 12.78 ف / ھکتار ( الجدول 3 ).

وأظهرت الملاحظات المسجلة للأعراض السمية النباتية أن أي علاجات أظهرت تأثير السمية النباتية على محصول البازلاء حمامة بعد 3 بخاخ من صياغة M. أنيسوبلياي . ومن أصل 57 من المفصليات التي تم تجميعها في التربة (الصراصير الحقلية والعناكب) لم يصب أي منهم. من أصل 590 جمعت مفصليات المفصليات المأهولة بالسكان، وجد أن اثنين من الأفراد من النظام هيتيروبتيرا (= 0.3٪ من المفصليات التي تم جمعها) مصابة بالعدوى أنيسوبلياي ( الجدول 4 ). لا العناكب ولا كوتسينليدس استسلم للفطر.

التربة (58 عزلة)
عزل رقم ا & قتصاص عدد العزلات
M1311، M1322، M1333، M2104، M2305، M2416، M2427، M2508، M42014، M45115، M45216، M45317، M79120، M79221، M79322 طماطم 15
M3419، M34210، M34311، M34412، M34513، M171264 التفاحة 6
M81123، M91124، M91225، M91326، M91528، M91427، M91629، M91730، M91831، M91932، M111145 قصب السكر 11
M101133، M101234، M101335، M101436، M101537، M101638، M101739، M101840، M101941، M102042، M102143، M102244 برنجال 12
M51118، M51219 بامية 2
M131150، M141151، M141252، M151153 حمامة البازلاء 4
M121146، M121247، M121348، M121449 الحمص 4
M183365 قطن 1
M193166 جاوار 1
المضيف الحشرات (10 عزلات)
M16255، M16356، M16457، M16558، M16659 الحمامة البازلاء دهني دهني 5
M16154، M16760 سوغاركين-ميلي، جرثوم 2
M16861 أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، غارغان-وايت، غروب 1
M16962 قصب السكر-خنفساء 1
M161063 سوغاركين-بيريلا بيربوسيلا 1

الجدول 1. أصل سلالات ميتاريزيوم . تم عزل 68 سلالة ميتارهيزيوم من حقول المحاصيل المختلفة (58 سلالة) والحشرات ميكوسيد من حقول المحاصيل (10 سلالات).

عزل الغلة (ز / كغ من الأرز) بقاء (٪) 50 إن T80 (h) لك 50 (x 103 جراثيم / مل) لوت 50 (أيام) معدل الوفيات (٪)
متوسط ​​± سد متوسط ​​± سد (حد فيدوسيال) (حد فيدوسيال) (حد فيدوسيال)
M34311 60.00 ± 2.64a 92.00 ± 2.64a 2.47 (2.26-2.69) 2 (0.4-10.3) 3.5 (3.2-3.7) 96.67
M34412 67.00 ± 3.46b 97.00 ± 1.73a 2.3 (2.11-2.52) 1.4 (0.1-1.9) 3.3 (3.0-3.6) 96.67
M81123 75.00 ± 3.60c 93.00 ± 1.73a 2.65 (2.43-2.90) 5.7 (1.2-26.7) 3.3 (3.1-3.6) 95.56
الأرقام التي تليها نفس الرسالة داخل العمود لا تختلف إحصائيا.
ست 50 ، الوقت اللازم لترسيب الجراثيم 50٪ في 0.1٪ (ث / ت) توين 80.
الأرقام التي تليها نفس الرسالة داخل العمود لا تختلف إحصائيا. سد، الانحراف المعياري. T80، توين 80 (0.1٪، ث / ت).
لك 50 ، متوسط ​​تركيز قاتلة من الأبواغ محسوبة لتسبب 50٪ من الوفيات من H. أرميجيرا بعد 14 يوما.
لوت 50 ، متوسط ​​الوقت القاتل من الجراثيم محسوبة لتسبب 50٪ من الوفيات من H. أرميجيرا .

الجدول 2. اختيار ثلاث عزلات ميتاريزيوم الأفضل أداء. H. أرميجيرا 3 أردي -instar اليرقات.

فيلد تريال $
علاج او معاملة ٪ فعالية * العائد (ف / هكتار)
مائي M. أنيسوبلييه M34412 (5X 10 12 جراثيم / هكتار) 500L 70.93 ± 4.19 14.04
صياغة النفط ( M. أنيسوبلياي ) (5x10 12 الجراثيم / هكتار) 3 لتر 78.02 ± 4.61 15.53
المبيدات الكيميائية / ممارسات المزارعين (2 مل / لتر، 500 لتر / هكتار) 63.43 ± 0.85 12.78
مراقبة غير المعالجة - 7.31
محاكمة تجريبية في (برنامج المزارعين التشاركية) $$
علاج او معاملة ٪ الضرر قرنة العائد (ف / هكتار)
الصيغة المائية ( M. أنيسوبلياي )؛ المساحة 4.2 هكتار 15.9 ± 1.26 10.75
صياغة النفط ( M. أنيسوبلياي )؛ مساحة 0.4 هكتار 17.74 12.5
ممارسات المزارعين؛ المنطقة 11 ه 22.72 ± 3.37 7.55
المحاصيل المروية
$ تصميم كتلة العشوائية
* بعد هندرسون وتيلتون (1955)
# هانبف، H. أرميجيرا نوكليوبوليههدروفيروس
$$ Nوكان عدد المزارعين الذين شاركوا في محاكمات المظاهرة 20. وقد تم تزويد بذور البازلاء الحمضية (بسمر - 736) جنبا إلى جنب مع الأسمدة للمزارعين. القرية: ديولالي برافارا، تال. Rahuri. حي. آناغار (مس)
(19.473 ° ش 74.6 ° ه)

الجدول 3. الأداء الميداني للسلالة الأنوسوبليية M. (M34412) ضد H. أرميجيرا . تم مقارنة فعالية تركيبات مختلفة من M. أنيسوبياي مع العلاجات الكيميائية مبيدات الآفات ضد الإصابة H. أرميجيرا في البازلاء الحمامة في ظل الظروف الميدانية.

معامل الحقل 1 الحقل 2 الحقل 3
حجم القطعة (م) 12 × 17 10 × 10 10 × 15
مكررات 2 2 2
# أرثروبودس من الفخاخ بيتفال اختبارها 20 22 15
٪ مصابة ب M. أنيسوبلياي (الفخاخ بيتفال) ND ND ND
# أرثروبودس من الاجتياح صافي جمع اختبارها 193 171 226
٪ مصابة مع M. أنيسوبلياي (جمع شبكة الاجتياح) ND ND 0.9
ند، لم يتم الكشف عنها
الحقل 1، كلية الزراعة، بيون؛ المجال 2، منظمة غير حكومية 1، تولابور، بيون؛ فيلد 3، نجو 2، آلاندي، بيون.
"> الجدول 4. تأثيرات علاجات أنيسوبلياي على المفصليات غير المستهدفة، وقد سجلت الملاحظات في ثلاثة مجالات مختلفة في اثنين من المكررين، ولم يكن هناك تأثير على أي من الحشرات غير المستهدفة التي تم جمعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلال 1880s، وقد بذلت المحاولة الأولى لاستخدام ميتارهيزيوم للسيطرة على خنافس الخنفساء، أنيسوبليا أوسترياكا، وبنجر السكر كورك، كليونيس بونكتيفنتريس 21 . في هذا البروتوكول، كان واحدا من الشروط المسبقة لعزل سلالة فظيعة، سواء من التربة أو من الحشرات المصابة. في الواقع، وغيرها من المعالم، مثل لك 50 ، لوت 50 ، و ست 50 ، ساهمت بشكل كبير في فعالية من حيث التكلفة للمنتج 22 ، 23 . من أجل تحسين إنتاج بوغ، كان التوازن الدقيق بين عدد من الأبواغ، وقابليتها للحياة، والفوعة هو الحفاظ على 24 .

وبما أن الزراعة هي منتج كبير الحجم ومنخفض التكلفة، فإن إدراك الجودة، وقبول المستخدمين النهائيين، ومدة صلاحية الجراثيم هي الشواغل الرئيسية. خصوصية المضيف هي مفيدة لتجنب الآثار غير المستهدفة= "كريف"> 14. تجنب تكرار التكاثر الفرعي على المتوسط ​​الاصطناعي والمرور العرضي من خلال المضيف الحشرات حافظ على فوعة وفعالية جراثيم ميتارهيزيوم في مجال 22 . النهج المقدم له قيود: إعداد أكثر فعالية عندما يكون مستوى عتبة الاقتصادية ~ 2-3 يرقات لكل نبات، وإنبات بوغ هو في أقصى حد في وجود الرطوبة العالية ودرجات الحرارة المنخفضة نسبيا.

هنا، إعداد الفطرية فعال بعد الاتصال، في حين أن البكتيرية (بت) والاستعدادات الفيروسية (-HaNPV) فعالة فقط عند هضمها. وفيما يتعلق بمعلمات مراقبة الجودة، بالإضافة إلى جدوى الجراثيم، ولأول مرة، فقد اقترح أن علامات البيوكيميائية والجزيئية على أساس أنشطة انزيم مهيجة بشرة وأنماط تقييد الهضم محددة من نفس جينات الإنزيم يمكن أن تضمن فعالية في المجال. نوعية كونتر(أ) بقاء الجراثيم، يقاس على أنه إنبات بوغ (يجب أن يكون> ​​90٪ على المساعد الشخصي الرقمي بعد 16 ساعة عند 28 درجة مئوية و 70-80٪ ر). (ب) وفيات في المئة من H. أرميجيرا (ينبغي أن يكون> ​​90٪، مع 1 × 10 7 الجراثيم في المختبر الحيوي)؛ (ج) نشاط الكيتيناز في وسط الكيتين بعد 72 ساعة (ينبغي أن يكون> ​​3.5 × 10 -3 U / مل). و (د) نمط ير-رفلب من الجينات الكيتيناز. وقد وصفت هذه المخطوطة أساسا البروتوكولات، من عزل الفطريات الممرضة للحشرات إلى توليد بيانات فعالية ضد الآفات المستهدفة في هذا المجال. هذا هو واحد من الشروط المسبقة لتسجيل أي صياغة مبيدات الآفات البيولوجية مع المجلس المركزي لمبيدات الحشرات في الهند، وفي نهاية المطاف، للتسويق.

سلسلة من التجارب المفصلة هنا سوف تكون مفيدة لتطوير ميكروسيكتيسيد المحتملة. وعلاوة على ذلك، بعد استخراج الجراثيم، ويمكن استخدام النفايات الكتلة الحيوية ميسيليال لتعزيز نمو النبات أو لعزل الشيتوزان أو البوليمرات الجلوكوزامين لتطبيقات الرعاية الصحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويقر المؤلفون بمساهمة المتعاونين من برنامج التعاون بين الهند وسويسرا في مجال التكنولوجيا الحيوية (إسب) التابع لإدارة التكنولوجيا الحيوية في نيودلهي والوكالة السويسرية للتنمية والتعاون في برن بسويسرا. ومن المسلم به مساهمات طلاب المشروع والموظفين المشاركين في تطوير ميكروسيكتيسيد، بما في ذلك فاندانا غورماد، بالافي نهار، بريا ياداف، شوكلانجي كولكارني، مانيشا كابور، سانتوش تشافان، رافيندرا فيدهات، شامالا ماني، و أبهيجيت لاند. إيكب و سغت شكر لجنة المنح الجامعية والهند ومجلس البحوث العلمية والصناعية (كسير)، الهند، على التوالي، للزمالات البحث. تعترف وزارة الدفاع والتنمية بدعم مجلس البحوث الصناعية والعلمية، نيودلهي لبرنامج العلماء الفخري. ويعرب المؤلفون عن امتنانهم لإدارة التكنولوجيا الحيوية في نيودلهي بالهند للدعم المالي المقدم في إطار برنامجي إسبب و سبيري. ونحن ممتنون لالمراجعين للمدخلات الخاصة بهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Hi-Media RM666 Reagent
Ammonium sulphate  Thomas Baker 11645 Reagent
DNA analyzer  Applied biosystem ABI prism 3730   Instrument
DNA islation kit Qiagen 69104 Reagent
Dodine Sigma 45466 Reagent
Gel extraction kit Qiagen 28604 Reagent
Glucose Hi-Media GRM077 Reagent
Knapsac sparyer Kaypee HY-16L (1004) Instrument
Peptone Hi-Media RM006-500G Reagent
Polypropylene vials  Laxbro SV-50 Plasticware
Potato dextrose agar (PDA)  Hi-Media M096-500G Reagent
Tween-80 SRL 28940 Reagent
Ultra low volume sparyer Matabi INSECDISK Instrument
Unicorn-bags  Unicorn UP-140024-SMB Autoclavalbe bag for SSF
Yeast extract Hi-Media RM027-500G Reagent
Chromas 2.1 software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  2. Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
  3. Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
  4. van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
  5. Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
  6. Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
  7. Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
  8. Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
  9. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  10. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
  11. Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
  12. Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
  13. Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
  14. Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
  15. Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
  16. Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
  17. Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
  18. Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
  19. Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
  20. Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
  21. McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
  22. Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
  23. Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
  24. Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).

Tags

العلوم البيئية، العدد 125، بيوساي الحشرات،
تطور ال<em&gt; ميتاريزيوم أنيسوبلياي</em&gt; باعتباره ميكوسكتيسيد: من العزلة إلى الأداء الميداني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tupe, S. G., Pathan, E. K.,… More

Tupe, S. G., Pathan, E. K., Deshpande, M. V. Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance. J. Vis. Exp. (125), e55272, doi:10.3791/55272 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter