Summary
Her rapporterer vi de ulike stadiene som er involvert i den kunnskapsbaserte utviklingen av et effektivt mycoinsekticid, inkludert isolering, identifisering, screening og utvelgelse av "best-fit" entomopathogenic sopp, Metarhizium anisopliae , for bekjempelse av skadedyr i landbruket .
Abstract
En stor bekymring når man utvikler kommersielle mycoinsekticider er drepehastigheten i forhold til kjemiske insektmidler. Derfor er isolasjon og screening for utvelgelsen av en hurtigvirkende, svært virulent entomopatogen sopp viktige trinn. Entomopatogene sopp, som Metarhizium, Beauveria og Nomurea , som virker ved kontakt, er bedre egnet enn Bacillus thuringiensis eller nukleopolyhedrosisvirus (NPV), som må inntas av insektsskade. I det nåværende arbeidet isolerte vi 68 Metarhizium- stammer fra infiserte insekter ved hjelp av en jordfortynning og agn-metode. Isolatene ble identifisert ved amplifikasjon og sekvensering av ITS1-5.8S-ITS2 og 26S rDNA-regionen. Den mest virulente stammen av Metarhizium anisopliae ble valgt ut fra median dødelig konsentrasjon (LC 50 ) og tid (LT 50 ) oppnådd i insekt bioassays mot III-instar larver av Helicoverpa armigera.Masseproduksjonen av sporer ved den valgte stammen ble utført med fast-tilstandsfermentering (SSF) ved bruk av ris som et substrat i 14 dager. Sporer ble ekstrahert fra sporulert biomasse ved bruk av 0,1% tween-80, og forskjellige formuleringer av sporer ble fremstilt. Feltforsøk av formuleringene for kontroll av en H. armigera- angrep i duetter ble utført ved randomisert blokkdesign. Infestasjonskontrollnivåene oppnådd med olje og vandige formuleringer (henholdsvis 78,0% og 70,9%) var bedre enn 63,4% oppnådd med kjemisk pesticid.
Introduction
Fra innføringen av organiske kloridoksidmidler i 1940-tallet i India, har bruken av plantevernmidler økt mange ganger 1 , med avlinger skadedyr som fortsatt koster milliarder rupees 2 årlig når det gjelder avkastningstap i landbruksproduksjon. Den utbredt og ikke-judicious bruk av syntetiske plantevernmidler er en kontinuerlig trussel mot miljøet og menneskers helse 1 . Den diskriminerende bruken av plantevernmidler fører til rester i jorda og uttømming av naturlige skadedyr. Den tjener også som et kraftig utvalgstrykk for å endre den genetiske sminke av en skadedyrsbestandighet, noe som fører til utvikling av resistens 1 . Til tross for de enorme fordelene med den grønne revolusjonen, som krevde høye innganger, som gjødsel og plantevernmidler, fortsetter skadedyrene å være en stor biotisk begrensning. Et generelt estimat av registrerte årlige avlinger i India og verdensomspennende er USD 12 milliarderEf "> 2 og USD 2000 milliarder 3 , henholdsvis.
Når kjemiske plantevernmidler har skadelige virkninger når de brukes til å bekjempe skadedyr, blir det viktig å søke etter alternative metoder som er økologisk lydige, pålitelige, økonomiske og bærekraftige. Biologisk kontroll gir et egnet alternativ og inkluderer bruk av parasitter, rovdyr og mikrobielle patogener 4 . Svampe, for eksempel, er kjent for å infisere et bredt spekter av insekt skadedyr, inkludert lepidopterans, hymenopterans, coleopterans og dipterans, som ofte resulterer i naturlige epizootier. I motsetning til andre bakterielle og virale insektsreguleringsmidler, er virkemåten for insektspatogene sopp også ved kontakt 5 . Disse soppene omfatter en heterogen gruppe på over 100 genera, med ca. 750 arter rapportert blant forskjellige insekter. De viktige sopppatogene er: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii, og Hirsutella sp., for å nevne noen 6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin er den nest mest brukte entomopatogene sopp i biokontroll. Det er kjent å angripe over 200 arter av insekter 7 .
I denne studien presenteres forskjellige stadier involvert i kunnskapsbasert utvikling av et mykopeptid ved bruk av M. anisopliae . Dette inkluderer: 1) identifisering av en kilde ( dvs. jord eller mykosekt insekter) for virulent entomopatogener, 2) entomopatogenidentifikasjon og -valg, 3) strategier for å opprettholde sin virulente natur og effektivitet i laboratorie bioassay og i feltet 4 ) Den kostnadseffektive formuleringen av smittsomme propagler, 5) utviklingen av unike kvalitetskontrollparametere for virulent preparering, og 6) bioprospektering og verdiskaping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Entomopathogene Svampe
- Jordfortynningsmetode
- Samle jordprøver og mycosed insekter fra forskjellige avlinger felt ( Tabell 1 ). Isoler entomopatogene sopp fra jordprøver ved hjelp av jordfortynningsplateringsmetoden 8 .
Merk: I denne studien ble det oppsamlet prøver fra Pune (18 ° 31'13'N, 73 ° 51'24''E) og Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Distrikt, Maharashtra, India. - Veid 10 g av hver jordprøve og legg dem separat til 90 ml steril 0,1% (w / v) Tween-80.
- Bland prøvene forsiktig ved hjelp av en magnetomrører i 60 minutter for å frigjøre sporene festet til jordpartikler.
- Etter blanding sprer 100 til 200 μl alikvoter fra hver prøve på selektivt medium inneholdende (g / L): pepton, 10; Glukose, 20; Agar, 18; Streptomycin, 0,6; Tetracyklin, 0,05; cycLohexamid, 0,05; Og dodin, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Inkubér platene ved 28 ° C i 3-7 dager.
- Velg og subkultur de individuelle sporulerende koloniene på samme medium for å oppnå rene kulturer.
- Samle jordprøver og mycosed insekter fra forskjellige avlinger felt ( Tabell 1 ). Isoler entomopatogene sopp fra jordprøver ved hjelp av jordfortynningsplateringsmetoden 8 .
- Fra mycosed insekter
- Samle mycosed insekter fra feltet.
Merk: En hard larvallegeme er sannsynligvis smittet med entomopatogen sopp. Med bakteriell eller viral infeksjon er den døde insekt kroppen myk. - Samle levende insekter med unormal oppførsel, dårlig koordinering og rykkete bevegelser.
- Hold insektene til døden og overfør dem deretter til fuktige kamre for ytterligere mykose og sporulering, hvis noe, ved 28 ° C og 70-80% RH.
- Spor sporene fra sporulerende kadavene på det ovennevnte selektive medium og oppnå rene kulturer ved ytterligere subkultivering 2-3 ganger på samme medium.
- Samle mycosed insekter fra feltet.
- Agn metode
- I enHetteglass (3,85 x 6,0 cm) som inneholder 60 g jordprøve, tilsett 4 rismalarver ( Corcyra cephalonica ) og hold hetteglassene ved 25 ± 2 ° C i 14 dager.
- Vri hetteglassene opp ned hver dag. Etter 14 dager, skjerm jordprøver for nærvær av mycosed rismoth larver. Isoler entomopatogen sopp med strekende sporer fra sporulerende kadavere på selektivt medium.
- Etter å ha oppnådd rene kulturer, overfør isolatene til pelletsdektrose agar (PDA) skråninger og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 7 dager for å tillate sporulering. Følg sporulering, vedlikehold moderkulturer ved 8 ° C til bruk.
2. Identifikasjon av Entomopathogenic Svampe
- Identifisere entomopatogene sopp ved å observere morfologiske egenskaper, ( dvs. aseksuell spore størrelse og form og arrangement av sporer på conidiophores); Isolater av 3 hovedgenera , Metarhizium , Beauv Eria og nomuraea , kan identifiseres.
- For molekylær identifisering av Metarhizium- stammer, ekstraher det genomiske DNA fra mycelbiomassen ved bruk av et DNA-isolasjonskit; Følg produsentens instruksjoner (se Materialebordet ). Kontroller kvaliteten på genomisk DNA ved å utføre elektroforese på en 0,8% agarosegel.
- PCR-amplifiserer ITS1-5.8S-ITS2 og 26S rDNA-regionen. Bruk genomisk DNA som en mal, med ITS1 fremover (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) og ITS4 revers (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primere 10 .
- Gel-eluere og rense amplikonene med forventet størrelse, ved hjelp av et gelekstraksjonssett; Følg produsentens instruksjoner (se Materialebordet ). Kvantifiser den rensede amplikon og sekvensen.
- Les og rediger sekvensene ved hjelp av programvaren og utfør et BLAST-søk av nukleotidsekvensene i NCBI GenBank databibliotek for å analysere nærliggende homologi= "Xref"> 11.
- Sette inn sekvensene av identifiserte entamopatogene isolater til NCBI GenBank-databasen for å hente tiltaksnummerene.
3. Screening av Metarhizium Isolates Against H. Armigera
- Insekt oppdrett
- Etablere den første kulturen av H. armigera ved å samle sunn larver og pupper av insektet fra feltet.
- For oppdrett, dyrk larverne individuelt i sterile polypropylenhetteglass (3,85 x 6,0 cm, 50 ml kapasitet) som inneholder okra desinfiseres med 0,5% (volum / volum) natriumhypokloritt i 10 min 12 .
- Samle insektseggene som legges under oppdrett, og steriliser dem med 0,5% (volum / volum) natriumhypokloritt.
- Opprettholde larver ved 25 ± 2 ° C og 65 ± 5% RH.
- Insekter bioassay
Merk: For insekt bioassay, produksjon av sporer,Og feltprestasjonsstudier ble de første subkulturer av Metarhizium- stammer fra mycosed H. armigera larver brukt, med mindre annet er angitt.- For insekt bioassays, bruk III-instar larver av H. armigera .
- Dypp et sett med 30 larver i tre eksemplarer individuelt i en 10-ml sporesuspensjon av Metarhizium isolater (1 x 10 7 sporer / ml, med mindre annet er nevnt; levedyktighet> 90%) i 5 s.
- Etter behandling, overfør hver larver individuelt til et separat sterilt hetteglass for å unngå kannibalisme. Til hvert hetteglass legger du til fuktig Whatmann filterpapir nr. 1 og et stykke desinfisert okra som mat. Endre papiret og mate på alternative dager.
- Hold larver ved 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH og 16: 8 lys: mørke i 14 dager eller til de dør.
- Overfør de døde larver til sterile petriplater med fuktig bomullspinne og hold dem ved 28 ° C og 70-80% RH i 3-7 dager for å tillate mycelia og sporeFormasjon over cadavers.
- For en kontroll, behandle et sett med 30 larver i tre eksemplarer med 0,1% (w / v) Tween-80 i sterilt destillert vann.
- Utfør alt eksperiment i triplikat ved å bruke tilberedte spore suspensjoner. Samle og lag dataene på prosent dødelighet fra tre eksperimenter for å få gjennomsnittsverdier. Beregn den korrigerte prosentdødeligheten ved å bruke Abbotts formel 13 .
- Utfør forsøkene ved hjelp av en randomisert komplett blokkdesign (RCBD), med hver behandling som inneholder et sett med 30 larver i tre eksemplarer. Basert på prosent dødelighet mot H. armigera , velg Metarhizium isolater for ytterligere screening av det beste isolatet for kommersiell produksjon.
- Velg isolatene som demonstrerer> 90% dødelighet mot H. armigera III-instar larver.
Merk: Her ble 12 isolater valgt. - Bestem LT 50 av disse isolatene og velg isolatene demonstrVurdering av den raskeste drapet (på kort tid).
Merk: Her ble 5 isolater valgt fra de 12 mest potente isolatene. - Bestem LC 50- verdiene for de utvalgte isolatene ved hjelp av fire forskjellige konsentrasjoner (dvs. 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 og 1 × 10 9 sporer / ml) sporesuspensjon.
- Bestem LC 50 av metarhiziumisolatene mot III-instarlarver av H. armigera for å øke muligheten til å identifisere forskjellen i virulens av isolater med høy dødelighetsverdier som kan gå uoppdaget dersom bare en enkeltdose brukes.
4. Produksjon av sporer av en metarhiziumisolat for feltprestasjonsstudier
- Produksjon av metarhiziumsporer av SSF
- For SSF, klargjør inokulumet ved å tilsette 2 x 10 7 sporer av Metarhizium- isolatene til200 ml YPG (0,3% gjærekstrakt, 0,5% pepton og 1,0%, glukose) medium. Inkubér kolber ved 28 ° C med risting (180 rpm) i 48 timer.
- For masseproduksjon av sporer av SSF, bruk ris som substrat, med mindre annet er nevnt.
- For SSF, fyll autoklavposer (type / 14 med et enkelt mikroventilfilter på 0,5 μm, 2 kg kapasitet, 64 × 36 cm) med 2 kg ris. Tilsett 1000 ml destillert vann til risen i posene og suge over natten 14 . Autoklaver posene med fuktet ris ved 121 ° C i 45 minutter 15 .
- Inokuler posene med 48-h gammelt mycel-inokulum (10% inokulum, 200 ml for 2 kg ris) og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 14 dager.
- Høst sporene ved væskeutvinning ved bruk av 0,1% Tween-80. Til dette må du legge til innholdet av posen til 0,1% Tween-80 (3 liter per 1 kg ris), bland grundig, separer sporene fra væsken ved sentrifugering og tørk ved 37 ° C i 2 dager. < / Li>
- Alternativt tørker du posene som inneholder ris med sporer og litt mycelia ved 37 ° C i 2 dager for å redusere fuktinnholdet (<20%). Høst sporene ved hjelp av en mykosøster eller vibro-sifter.
- Lønnsomhetsstudier
- Bestem prosentvis levedyktighet for de høstede sporer ved å bruke forskjellige metoder 15 . For dette lagre spore suspensjonene i 0,1% (w / v) Tween-80 og juster tellingen til 1 x 10 3 sporer / ml.
- Spor sporesuspensjonene (0,1 ml) på PDA-plater i triplikat og inkuber ved 28 ° C og 70-80% RH i 72 timer.
- Telt manuelt de isolerte koloniene og bestem det totale levedyktige antall for den respektive prøven.
- Spore sedimentasjon rate
- For en jevn dosering kreves den homogene sporesuspensjonen; Bestemme spore sedimentasjon rate for Metarhizium isolater som beskrevet"Xref"> 16. Kontroller sedimentasjonshastighetene til sporer i 0,2 M ammoniumsulfat og 0,1% Tween-80.
- Juster telling av sporesuspensjon til ~ 7 x 10 7 sporer / ml for å oppnå en innledende absorbans på 0,6 ved 540 nm. La kuvetterne stå uforstyrret i 6 timer for sporer å bosette seg.
- Ta opp absorbansen i opptil 6 timer. Express sedimenteringshastigheten i prosent og beregne tiden som kreves for 50% sedimentering (ST 50 ). Gjenta forsøket tre ganger ved å bruke nytilberedte spore suspensjoner.
5. Feltresultatstudier av evnen til utvalgte M. anisopliae Isolere for å kontrollere H. armigera i Pigeon Peas
- Hettbar pulverformulering av M. anisopliae M 34412 sporer
- Klargjør 2,5-5% fuktbar pulverformulering ved å blande sporer med talkum.
- Juster sluttgjennomsnittet (TVC) til 1 x 10 12 spoRes per kg formulering.
- Feltprestasjon studier av M. anisopliae M 34412 sporer
- For feltprestasjonsstudier av evnen til det valgte M. anisopliae- isolatet for å kontrollere H. armigera- angrep i duetterter, bruk en RCBD med fire replikasjoner.
Merk: Her utføres ved Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Bruk to forskjellige sprayformuleringer, en oljeformulering av sporer (5 x 10 12 sporer / 3 liter diesel: solsikkeolje, 7: 3) og en vandig formulering i Tween-80 (0,1%). Spray oljepreparatet med en ultra-lav volum (ULV) sprøyte (70 min, 3 liter / ha) den vandige formuleringen med en ryggsprøyter (5 x 10 12 sporer, 500 L / ha).
Merk: Her ble larvpopulasjonene registrert en dag før sprøyten og 3 og 7 dager etter påføring av hver spray til 5 tilfeldig valgte planter. Den totale befolkningen var tOmformet til kvadratroten av n + 1 for statistisk analyse.- I henhold til landbrukspraksis for duenærbeskjæringen, utfør den første sprøyten mellom 10 og 15 d etter egglegging og 2 ganger med 14-dagers intervall. Utfør sprøytingen mellom kl. 16.00 og 18.00. Overvåk vindretningen og bruk om nødvendig klutgardiner for å unngå sporing av sporer til nærliggende tomter.
- Til sammenligning spray de kjemiske insektsmedisinene med en håndkompresjons knapsack sprøyte.
- Bestem inokulumets utholdenhet i feltet ved å samle H. armigera larver 0, 3, 5, 7 og 14 dager etter sprøyting.
- Hold disse larverne under observasjon i 14 dager og etter døden, overfør dem til et plastflaske med fuktig filterpapir. Inkuber ved 25 ± 2 ° C og 70 ± 10% RH for å observere mykose.
- Bestem persistensen av inokulumet på larvalpopulasjonen basert på p Utvoksende dødelighetsdata av larver samlet fra feltet etter sprøyting.
- Evaluer feltstudiene på grunnlag av prosent effekt 17 , prosent pod skade og prosent utbytte 18 .
Merk: Dataene for parametrene, som temperatur, fuktighet, vindhastighet (km / h), solskinn (h), nedbør (mm), regnværsdager og fordamping (mm) ble registrert under en prøveperiode på en Landbruksuniversitet (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- For feltprestasjonsstudier av evnen til det valgte M. anisopliae- isolatet for å kontrollere H. armigera- angrep i duetterter, bruk en RCBD med fire replikasjoner.
- Farmers Participatory Program
- Velg antall bønder for demonstrasjonsforsøkene. Tilfør duftens frø (BSMR - 736) sammen med gjødsel til bøndene.
Merk: I denne studien var 20 bønder involvert. Landsby: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Bruk samme sprayformuleringer og antall sprøyter som i trinn 5.2.
- Velg antall bønder for demonstrasjonsforsøkene. Tilfør duftens frø (BSMR - 736) sammen med gjødsel til bøndene.
- Vær oppmerksom på effekten av mycoinsecticidspray, om noen, på duenæren.
- Samle jordboende leddyr og bladbeboende insekter 1 dag etter hver behandling i ubehandlede tomter og i tomter behandlet med M. anisopliae .
- Samle jordbunns leddyr med fallgruver fett innen 24 timer etter behandling og samle de bladbeboende insekter med et feie nett om morgenen etter behandlingen ( dvs. ca. 15-18 timer etter behandling).
- Hold dem individuelt i sylindriske plastbokser med diametre på 3,5 cm og høyder på 4,0 cm. Sjekk insekter daglig for infeksjon og mate dem med riktig mat.
- Registrer tilstedeværelsen av M. anisopliae , hvis i det hele tatt, og isoler soppen.
7. Identifisering av kvalitetskontrollparametere
- Kontroller sporbarheten ved å måle spore-spiring på PDA ved 28 °; C.
- Måle skjel nedbrytende enzymaktivitet, for eksempel chitinase og kitin-deacetylase, kitosanase, protease og lipase produsert i YPG og chitin-media, som beskrevet tidligere 15.
- Bestem dødeligheten av H. armigera i et laboratorie bioassay 15 .
- Bruk molekylære markører, som et PCR-RFLP-mønster av kitinaser ( Chit 1 , 2 og 4 ) og protease ( Pr1A ) -gener, som virulensegenskaper for M. anisopliae .
- Ekstraher det genomiske DNA fra myceliebiomassen ved å bruke et DNA-isolasjonskit 15 . PCR-amplifiserer Chit1- og Chit2 -genfragmentene ved bruk av genomisk DNA som en mal, med primerpar Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) og Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). For Chit4 , bruk primerparet Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- For amplifikasjonen av Pr1A-genet, bruk METPR2- og METPR5-primerparet (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Utfør begrensningsfordøyelsen 19 av Chit1- genet med BsaJI , BstUI og ScrFI ; av den Chit2 genet med Alul, HpyCH4IV, og HpyCH4V, og av den Chit4 genet med BstUI, Haelll, og Mbol. For fordøyelsen av Pr1A- genet, bruk RsaI , Ddel og MspI 20 .
- Følg restriktionsfragmentlengdepolymorfismen (RFLP) mønster på 1,5% agarosegel ved elektroforese for hvert gen for de fleste virulente stammer (> 90% dødelighet); Dette kan brukes som en virulensmarkør for valg av M. anisopliae .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under undersøkelsene ble forskjellige stammer av Metarhizium, Beauveria og Nomuraea isolert ved forskjellige isolasjonsmetoder (data ikke vist) 6 , 14 Da Metarhizium- stammer ble funnet å være mer effektive ved kontroll av H. armigera , et fryktelig skadedyr i pulser 6 , 14 , Ble ytterligere isolasjoner rettet mot å isolere metarhiziumstammer fra forskjellige avlinger og insekter ( tabell 1 ). Totalt oppnådd 68 Metarhizium isolater ble identifisert av kulturelle og morfologiske egenskaper og ved ITS 1-5,8S-ITS 4-sekvensering. Basert på> 90% dødeligheten av H. armigera i laboratorie bioassays ble 12 Metarhizium isolater ytterligere testet for sporproduksjon , levedyktighet, LC 50 , LT 50 og ST 50 . Tabell 2 beskriver dataeneFor 3 potensielle isolater, M34311, M34412 og M81123; M34412 ble funnet å være den beste utførelsen av isolat.
Blant de testede substratene, som ris, sorghum, mais og hvete, støttet ris maksimal sporulering i tilfelle Metarhizium- isolater (60-75 g sporer / kg, 4-4,4 x 10 10 sporer / g sporpulver) .
Under feltprøven for kontroll av H. armigera i duerter ble det oppnådd 78,0% og 70,9% effektiviteter med henholdsvis M. anisopliae M34412 olje og vandige formuleringer . Podskaden i M. anisopliae- behandlede tomter ble funnet å være mindre (8,76%) enn i de ubehandlede kontrollplottene (23,63%) og de kjemisk behandlede plottene (10,24%). Gjennomsnittlig utbytte (q / ha) i den ubehandlede kontrollen var 7,31 q / ha, som var mindre enn den etter M. anisopliae M34412 behandling (14,04 q / ha). Behandling med kjemikalie ga et utbytte på 12,78 q / ha ( tabell 3 ).
Observasjonene som ble registrert for fytotoksisitetssymptomer viste at ingen behandlinger viste en fytotoksisk effekt på duftens beskjære etter 3 sprøyter av M. anisopliae formulering. Av 57 samlet jordbypedyredyr (feltkrekler og edderkopper) ble ingen infisert. Av 590 samlet baldakinbefolkning leddyr, ble to personer av rekkefølgen Heteroptera (= 0,3% av de samlede arthropodene) funnet å være smittet med M. anisopliae ( Tabell 4 ). Verken edderkopper eller kokcinellider bukket under svampen.
| Jord (58 isolater) | ||
| Isoler nr. | Avling | Antall isolater |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomat | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Vanilje eple | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Sukkerrør | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | Brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Pigeon ert | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | kikert | 4 |
| M183365 | Bomull | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Insektverten (10 isolater) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Pigeon-ert-fett snittorm | 5 |
| M16154, M16760 | Sugarcane-mealy bug | 2 |
| M16861 | Sukkerrør-hvit grub | 1 |
| M16962 | Sugarcane-bille | 1 |
| M161063 | Sugarcane-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabell 1. Opprinnelse av Metarhizium- stammer. De 68 Metarhizium- stammene ble isolert fra forskjellige avlinger (58 stammer) og mycosed insekter fra avlingene (10 stammer).
| Isolere | Utbytte (g / kg ris) | Levedyktighet (%) | LC 50 (x 103 sporer / ml) | LT 50 (dager) | Dødelighet (%) | |
| Gjennomsnitt ± SD | Gjennomsnitt ± SD | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92.00 ± 2.64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67.00 ± 3.46b | 97.00 ± 1.73a | 2,3 (2,1-2,52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96,67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93.00 ± 1.73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3,3 (3,1-3,6) | 95,56 |
| Tall etterfulgt av samme bokstav i kolonnen er ikke statistisk forskjellig. | ||||||
| ST 50 , tid som er nødvendig for sedimentering av 50% sporer i 0,1% (vekt / volum) Tween 80. | ||||||
| Tall etterfulgt av samme bokstav i kolonnen er ikke statistisk forskjellig. SD, Standardavvik. T80, Tween 80 (0,1%, vekt / volum). | ||||||
| LC 50 , den mediane dødelige konsentrasjonen av sporer beregnet for å forårsake 50% dødelighet av H. armigera etter 14 dager. | ||||||
| LT 50 , gjennomsnittlig dødelig tid for sporer beregnet for å forårsake 50% dødelighet av H. armigera . | ||||||
Tabell 2. Utvalg av tre best-performing Metarhizium isolater. H. armigera 3 rd- instar larver.
| Feltforsøk $ | ||
| Behandling | % Effektivitet * | Utbytte (q / ha) |
| Vandig M. anisopliae M34412 (5x10 12 sporer / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14.04 |
| Oljepreparat ( M. anisopliae ) (5 x 10 12 sporer / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15.53 |
| Kjemisk plantevernmiddel / Farmers praksis (2ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12.78 |
| Ubehandlet kontroll | - | 7,31 |
| Demonstrasjonsprøve i (Farmers Participatory Program) $$ | ||
| Behandling | % Pod skade | Utbytte (q / ha) |
| Vandig formulering ( M. anisopliae ); Areal 4,2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10.75 |
| Oljepreparasjon ( M. anisopliae ); Areal 0,4 ha | 17.74 | 12,5 |
| Farmers praksis; Område 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Vannet avling | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Etter Henderson og Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nukleopolyhedrovirus | ||
| $$ NUmber av bønder involvert i demonstrasjonsforsøkene var 20. Duftens frø (BSMR - 736) ble levert sammen med gjødsel til bøndene. Landsby: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19.473 ° N 74.6 ° E) | ||
Tabell 3. Feltytelse av M. anosopliae (M34412) stamme mot H. armigera . Effektene av forskjellige formuleringer av M. anisopiae ble sammenlignet med kjemiske pesticidbehandlinger mot H. armigera- infestasjon i duerter under feltbetingelser.
| Parameter | Felt 1 | Felt 2 | Felt 3 |
| Plottestørrelse (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| gjentak | 2 | 2 | 2 |
| # Leddyr fra fallgruvefeller testet | 20 | 22 | 15 |
| % Infisert med M. anisopliae (fallgruvefeller) | ND | ND | ND |
| # Leddjeder fra feie netto samling testet | 193 | 171 | 226 |
| % Infisert med M. anisopliae (feie netto samling) | ND | ND | 0.9 |
| ND, Ikke oppdaget Felt 1, Agricultural College, Pune; Felt 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Felt 3, NGO 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av 1880-årene ble det første forsøk på å bruke Metarhizium til å kontrollere scarabbeen , Anisoplia austriaca og sukkerroerkurculio, Cleonis punctiventris 21 . I denne protokollen var en av forutsetningene å isolere en virulent stamme, enten fra jorden eller fra infiserte insekter. Faktisk bidro andre parametere, for eksempel LC 50 , LT 50 og ST 50 , betydelig til kostnadseffektiviteten til produktet 22 , 23 . For optimalisering av sporeproduksjonen ble en delikat balanse mellom antall sporer, levedyktighet og virulens opprettholdt 24 .
Ettersom landbruket er et produkt med høy volum og lavpris, er kvaliteten, oppfatningen av sluttbrukere og holdbarheten til sporer de største bekymringene. Vertspesifikitet er fordelaktig for å unngå ikke-mål-effekter= "Xref"> 14. Unngåelse av gjentatt subkultur på kunstig medium og sporadisk passasje gjennom insekts- verten opprettholdt virulensen og effektiviteten av Metarhizium- sporer i feltet 22 . Den presenterte tilnærmingen har begrensninger: Preparatet er mer effektivt når det økonomiske terskelnivået er ~ 2-3 larver per plante, og spore-spiring er maksimalt i nærvær av høy fuktighet og relativt lave temperaturer.
Her er sopppreparatet effektivt etter kontakt, mens bakterielle (Bt) og virale preparater (-HaNPV) bare er effektive når de spises. Når det gjelder kvalitetskontrollparametere, har det for første gang vært foreslått at biokjemiske og molekylære markører basert på kutikknedbrytende enzymaktiviteter og spesifikke begrensningsfordøyelsesmønstre av de samme enzymgener kan sikre effektivitet i feltet. Kvalitets-kontrOl parametere foreslått er: a) sporbarhet, målt som spore spiring (bør være> 90% på PDA etter 16 timer ved 28 ° C og 70-80% RH); (b) prosent dødelighet av H. armigera (bør være> 90%, med 1 x 10 7 sporer i laboratoriet bioanalysen); (C) kitinaseaktiviteten i kitinmediet etter 72 timer (bør være> 3,5 x 10-3 U / ml); Og (d) PCR-RFLP-mønsteret av kitinase-gener. Dette manuskriptet har i det vesentlige beskrevet protokollene, fra isolering av en entomopatogen sopp til generering av effektdata mot målet skadedyr i feltet. Dette er en av betingelsene for å registrere noen biopesticidformulering med det sentrale insektsmiddelstyret i India og til slutt for kommersialisering.
Serien av eksperimenter som er beskrevet her vil være nyttig for utviklingen av et potensielt mycoinsekticid. Videre, etter ekstraksjon av sporer, kan avfallsmytelbiomassen brukes tilPlantevækstfremmende eller for isolering av kitosan eller glukosaminpolymerer for helseprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner bidrag fra samarbeidspartnere fra det bioteknologiske instituttets indo-sveitsiske samarbeid i bioteknologi (ISCB), Institutt for bioteknologi, New Delhi og Det sveitsiske agenturet for utvikling og samarbeid, Bern, Sveits. Bidragene fra prosjektstuderende og ansatte involvert i utviklingen av mycoinsekticidet, inkludert Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane og Abhijeet Lande, er anerkjent. EKP og SGT takker universitetsbidragskommisjonen, India og Forskningsrådet (CSIR), India, henholdsvis, for forskningsstipendier. MVD anerkjenner støtten fra Rådet for industriell og vitenskapelig forskning, New Delhi for Emeritus Scientist Scheme. Forfatterne er takknemlige for Institutt for bioteknologi, New Delhi, India for økonomisk støtte under ISCB og SBIRI-programmene. Vi er takknemlige forAnmeldere for sine innganger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
