Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

פיתוח של Published: July 30, 2017 doi: 10.3791/55272
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory

Summary

כאן אנו מדווחים על השלבים השונים המעורבים בפיתוח המבוסס על ידע של קוטל חיטוי יעיל, כולל הבידוד, הזיהוי, ההקרנה וההבחנה של הפטרייה האנטומופתוגנית ה"מתאימה ביותר ", Metarhium anisopliae , לשליטה על מזיקים לחרקים בחקלאות .

Abstract

החשש העיקרי בעת פיתוח mycoinsecticides מסחרי הוא מהירות להרוג לעומת זה של חומרי הדברה כימיים. לכן, בידוד והקרנה לבחירת פטרייה אנטומפטוגנית מהירה ופורחת, הם צעדים חשובים. פטריות אנטומופתוגניות, כגון Metarhium, Beauveria ו- Nomurea , אשר פועלות על ידי מגע, מתאימות יותר ל- Bacillus thuringiensis או ל- nucleopolyhedrosis (NPV), אשר יש לבלוע את הדברה. בעבודה הנוכחית, אנו מבודדים 68 זנים Metarhizium מ חרקים נגועים באמצעות דילול הקרקע שיטת הפיתיון. הבידוד זוהו על ידי הגברה ורצף של ה- ITS1-5.8S-ITS2 ו- 26S rDNA האזור. זן ארסי ביותר של metishizium anisopliae נבחר על בסיס ריכוז קטלני חציון (LC 50 ) ואת הזמן (LT 50 ) שהושגו bioassays חרק נגד III-instar הזחלים של Helicoverpa armigera.הייצור ההמוני של נבגים על ידי הזנים שנבחרו בוצע עם תסיסה במצב מוצק (SSF) באמצעות אורז כמצע במשך 14 ימים. נבגים הוצאו מן ביומסה ספורטיבית באמצעות 0.1% tween-80, ניסוחים שונים של נבגים הוכנו. ניסויים שדה של ניסוחים עבור שליטה של H. Armigera infestation ב יונים אפונה בוצעו על ידי בלוק אקראי העיצוב. רמות הבקרה של השד שהתקבלו עם שמן ותרכובות מימיות (78.0% ו -70.9%, בהתאמה) היו טובות יותר מאשר 63.4% שהושגו עם חומרי הדברה כימיים.

Introduction

מן ההקדמה של חומרי הדברה אורגנוכלורין ב 1940s בהודו, השימוש בחומרי הדברה גדל רבים לקפל 1 , עם מזיקים היבול עדיין עולה מיליארדי רופי 2 בשנה במונחים של אובדן התשואה בייצור החקלאי. השימוש הנרחב והלא-מושכל של חומרי הדברה סינתטיים הוא איום מתמשך על הסביבה ועל בריאות האדם 1. השימוש ללא הבחנה בחומרי הדברה מוביל לשאריות בקרקע ולדלדול של טורפים טבעיים. היא משמשת גם כבחירת לחץ חזקה לשינוי ההרכב הגנטי של אוכלוסיית הדברה, המוביל להתפתחות ההתנגדות 1 . למרות היתרונות העצומים של המהפכה הירוקה, שדרשה תשומות גבוהות, כמו דשנים וחומרי הדברה, המזיקים ממשיכים להיות אילוצים ביוטיים גדולים. אומדן כללי של ההפסדים השנתיים שנצברו בהודו ובעולם הוא 12 מיליארד דולרEf "> 2 ו -2,000 מיליארד דולר 3 , בהתאמה.

כאשר חומרי הדברה כימיים יש השפעות מזיקות כאשר נעשה שימוש כדי לשלוט מזיקים חרקים, זה הופך להיות הכרחי לחפש שיטות חלופיות כי הם מבחינה אקולוגית, אמין, חסכוני, בר קיימא. בקרה ביולוגית מציעה חלופה ראויה כוללת השימוש טפיל, טורפים, ופתוגנים מיקרוביאלי 4. פטריות, למשל, ידועים להדביק מגוון רחב של מזיקים חרקים, כולל lepidopterans, hymenopterans, coleopterans, דיפטרנים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך אפיזוטיקה טבעית. יתר על כן, שלא כמו סוכני בקרת חרקים ויראליים אחרים, מצב הפעולה של פטריות חרקים פתוגניים הוא על ידי מגע 5 . פטריות אלה מהווים קבוצה הטרוגנית של למעלה מ -100 סוגים, עם כ -750 מינים המדווחים בין חרקים שונים. הפתוגנים החשובים הם: Metarhizium sp., Beauveria sעמ ', Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii , ו Hirsutella sp., עד כמה שם 6 . M. Anisopliae (Metchnikoff) Sorokin הוא הפטרייה האנטומופתוגנית השנייה הנפוצה ביותר בביוקונטר. זה ידוע לתקוף מעל 200 מינים של חרקים 7 .

במחקר זה, שלבים שונים המעורבים בפיתוח מבוסס ידע של mycopesticide באמצעות M. anisopliae מוצגים. זה כולל: 1) זיהוי של מקור ( כלומר, אדמה או חרקים mycosed) עבור entomopathogens ארסיות, 2) זיהוי אנטומפטוגן ובחירה, 3) אסטרטגיות כדי לשמור על הטבע האלים שלהם ואת יעילות bioassay במעבדה בתחום, 4 ) ניסוח חסכוני של propagules זיהומיות, 5) פיתוח של פרמטרים ייחודיים בקרת איכות להכנה ארסית, ו 6) bioprospecting ותוספת ערך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של פטריות אנטומופתוגניות

  1. שיטת דילול הקרקע
    1. איסוף דגימות קרקע חרקים mycosed מ שדות יבולים שונים ( טבלה 1 ). לבודד את פטריות entomopathogenic מ דגימות קרקע באמצעות שיטת ציפוי דילול קרקע 8 .
      הערה: במחקר זה, דגימות נאספו פונה (18 ° 31'13''N, 73 ° 51'24''E) ו בולדנה (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) מחוזות, מהרשטרה, הודו.
    2. לשקול 10 גרם של כל מדגם אדמה ולהוסיף אותם בנפרד 90 מ"ל של 0.1% סטרילית (w / v) Tween-80.
    3. מערבבים היטב את דגימות באמצעות סטירר מגנטי במשך 60 דקות כדי לשחרר את הנבגים דבקות חלקיקי אדמה.
    4. לאחר ערבוב, להפיץ 100-100 μL aliquots מכל מדגם על מדיום סלקטיבי המכיל (g / L): peptone, 10; גלוקוז, 20; אגר, 18; סטרפטומיצין, 0.6; טטרציקלין, 0.05; CycLohexamide, 0.05; ו dodine, 0.1 מ"ל; PH 7.0 9 . לדגור את הצלחות על 28 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים.
    5. בחר ו subculture הפרט בודדים מושבות על המדיום אותו כדי להשיג תרבויות טהורות.
  2. מ חרקים mycosed
    1. לאסוף את חרקים mycosed מן השדה.
      הערה: גוף הזחל קשה צפוי להיות נגוע פטריות אנטומופתוגני. עם זיהום חיידקי או ויראלי, הגוף חרק מת רך.
    2. איסוף חרקים חיים עם התנהגות חריגה, תיאום לקוי, תנועות מזויפות.
    3. שמור את החרקים עד המוות ולאחר מכן להעביר אותם לתאי לחות נוספת מיקוזה ו sporulation, אם בכלל, ב 28 ° C ו 70-80% RH.
    4. הפרד את הנבגים מן גופות sporulating על המדיום סלקטיבי הנ"ל ולקבל תרבויות טהור על ידי subculturing נוספת 2-3 פעמים על המדיום אותו.
  3. שיטת הפיתיון
    1. בבקבוקון (3.85 x 6.0 ס"מ) המכיל 60 גרם של מדגם קרקע, מוסיפים 4 זחלי עש אורז ( Corcyra cephalonica ) ולשמור את בקבוקונים ב 25 ± 2 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 14 ימים.
    2. הפוך את צלוחיות במהופך כל יום. לאחר 14 ימים, המסך דגימות קרקע לנוכחות של זחלי עש אורז mycosed. לבודד את פטריות entomopathogenic ידי הפצת נבגים מ sporulating cadavers על בינוני סלקטיבי.
    3. לאחר קבלת תרבויות טהורות, להעביר את מבודד כדי אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) slants ו דגירה על 28 מעלות צלזיוס 70-80% RH במשך 7 ימים כדי לאפשר sporulation. בעקבות sporulation, לשמור על תרבויות האם ב 8 מעלות צלזיוס עד השימוש.

2. זיהוי של פטריות אנטומופתוגניות

  1. זיהוי פטריות אנטומופתוגניות על ידי התבוננות במאפיינים מורפולוגיים ( כלומר, גודל נבגים וצורה לא מינית והסדר הנבגים על הקונידיופורים); מבודד של 3 סוגים עיקריים, Metarhium , Beauv Eria, ו Nomuraea , ניתן לזהות.
  2. עבור זיהוי מולקולרי של זנים Metarhium , לחלץ את הדנ"א הגנומי מן הביומסה מיסליות באמצעות ערכת בידוד DNA; בצע את הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים ). בדוק את איכות הדנ"א הגנומי על ידי ביצוע אלקטרופורזה על 0.8% agarose ג'ל.
    1. PCR, להגביר את ITS1-5SS-ITS2 ו 26S rDNA האזור. השתמש DNA גנומי כתבנית, עם ITS1 קדימה (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ו ITS4 הפוך (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primers 10 .
    2. ג 'ל elute ו לטהר את amplicons בגודל צפוי באמצעות ערכת מיצוי ג' ל; בצע את הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים ). לכמת את amplicon מטוהרים רצף.
    3. לקרוא ולערוך את sequences באמצעות התוכנה ולבצע חיפוש BLAST של רצפים נוקליאוטידים בספריית נתונים GNBank NCBI לנתח את homology קרוב= "Xref"> 11.
    4. הפקדת רצפים של מבודד entamopathogenic מזוהה למסד הנתונים NCBI GenBank כדי לאחזר את מספרי ההצטרפות.

3. הקרנה של מבודדי המטארהיזיום כנגד ח 'ארמיגרה

  1. גידול חרקים
    1. להקים את התרבות הראשונית של H. Armigera על ידי איסוף זחלים בריאים וגלמים של החרק מהשדה.
    2. עבור גידול, לגדל את הזחלים בנפרד בצנצנות פוליפרופילן סטרילי (3.85 x 6.0 ס"מ, 50 מ"ל קיבולת) המכילים חתיכות של במיה מחטאת עם 0.5% (v / v) hypochlorite נתרן במשך 10 דקות 12 .
    3. איסוף ביצים חרקים הניח במהלך גידול ו-לעקר אותם עם 0.5% (v / v) hypochlorite נתרן.
    4. לשמור על הזחלים ב 25 ± 2 מעלות צלזיוס 65 ± 5% RH.
  2. ביו-חרקים חרקים
    הערה: עבור bioassay חרקים, את הייצור של נבגים,ומחקרים בתחום השדה, נעשה שימוש בתת-התרבויות הראשונות של זני מטארהזיום מזחלי ה .
    1. עבור bioassays חרקים, להשתמש III-instar הזחלים של H. Armigera .
    2. טובלים קבוצה של 30 הזחלים בשלושה עותקים בנפרד לתוך ההשעיה נבג 10 מ"ל של מבודד Metarhium (1 x 10 7 נבגים / מ"ל, אלא אם כן צוין אחרת, הכדאיות> 90%) במשך 5 s.
    3. לאחר הטיפול, להעביר כל זחל בנפרד על בקבוקון סטרילי נפרד, כדי למנוע קניבליזם. לכל בקבוקון, להוסיף נייר מסנן Whatmann מסנן מס '1 וגם חתיכת הבמיה לחיטוי כמו להאכיל. שנה את הנייר ואת ההזנה בימים חלופיים.
    4. שמור את הזחלים ב 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 65 ± 5% RH, ו 16: 8 אור: כהה במשך 14 ימים או עד שהם מתים.
    5. מעבירים את הזחלים המתים צלחות פטרי סטרילי המכיל לחות כותנה לחות ולשמור אותם על 28 מעלות צלזיוס 70-80% RH במשך 3-7 ימים כדי לאפשר מיסליה נבגהיווצרות על הגופות.
    6. עבור שליטה, לטפל קבוצה של 30 זחלים בשלושה עותקים עם 0.1% (w / v) Tween-80 במים מזוקקים סטרילי.
    7. לנהל את כל הניסוי בשלושה עותקים באמצעות מתלים נבג מוכן טרי. איסוף מאגר הנתונים על תמותה אחוז משלושה ניסויים כדי לקבל ערכים ממוצעים. חישוב תמותה אחוז מתוקן באמצעות הנוסחה של אבוט 13 .
    8. בצע את הניסויים באמצעות תכנון אקראי להשלים בלוק שלם (RCBD) פריסה, עם כל טיפול המכיל קבוצה של 30 זחלים בשלושה עותקים. בהתבסס על התמותה אחוז נגד H. Armigera , בחר מבודד Metarhizium להקרנה נוספת של בידוד הטוב ביותר לייצור מסחרי.
    9. בחר את מבודד הוכחת> 90% תמותה נגד H. Armigera III-instar הזחלים.
      הערה: כאן נבחרו 12 בודדים.
    10. לקבוע את LT 50 של מבודד אלה לבחור את הפגמים להפגיןדירוג ההרג המהיר ביותר (בפחות זמן).
      הערה: כאן, 5 בודדים נבחרו מתוך 12 מבודד חזק ביותר.
    11. לקבוע את ערכי LC 50 של הבידוד שנבחרו באמצעות ארבעה ריכוזים שונים (כלומר, 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 , ו 1 × 10 9 נבגים / מ"ל) של ההשעיה נבג.
    12. לקבוע את LC 50 של מבודד Metarhium נגד זחלים III-instar של H. Armigera כדי להגדיל את האפשרות לזהות את ההבדל של ארסיות של מבודדים עם ערכי תמותה גבוהים שעשויים ללכת unetected אם רק מנה אחת משמש.

4. ייצור של נבגים של Metarhizium מבודדים עבור ביצועי שדה מחקרים

  1. ייצור של נבגים Metarhizium ידי SSF
    1. עבור SSF, להכין את inoculum על ידי הוספת 2 x 10 7 נבגים של מבודד metarhizium ל200 מ"ל של YPG (0.3% תמצית שמרים, 0.5% פפטון, ו 1.0%, גלוקוז) בינוני. דגירה את צלוחיות ב 28 ° C עם רועד (180 סל"ד) במשך 48 שעות.
    2. לייצור המוני של נבגים על ידי SSF, השתמש אורז כמו המצע אלא אם כן צוין אחרת.
    3. עבור SSF, למלא שקיות החיטוי (סוג / 14 עם מסנן microvented יחיד של 0.5 מיקרומטר, 2 ק"ג קיבולת, 64 × 36 ס"מ) עם 2 ק"ג של אורז. מוסיפים 1,000 מ"ל של מים מזוקקים לאורז בשקיות ולטבול לילה 14 . החיטוי השקיות עם האורז ספוג על 121 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות 15 .
    4. לחסן את התיקים עם inoculum mycelial 48-h (10% inoculum, 200 מ"ל עבור 2 ק"ג של אורז) ו דגירה על 28 מעלות צלזיוס 70-80% RH במשך 14 ימים.
    5. קציר את הנבגים על ידי מיצוי נוזלי באמצעות 0.1% Tween-80. לשם כך, מוסיפים את תוכן השקית ל- 0.1% Tween-80 (3 ליטר לכל 1 ק"ג אורז), מערבבים היטב, מפרידים בין הנבגים על ידי צנטריפוגה ויובשים ב -37 מעלות צלזיוס למשך יומיים. / Li>
    6. לחלופין, יבש את התיקים המכילים אורז עם נבגים וכמה מיסליה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי להפחית את תכולת לחות (<20%). קציר את הנבגים באמצעות מקצרה- myco או vibro-sifter.
  2. מחקרי הכדאיות
    1. לקבוע את הכדאיות אחוז של נבגים שנקטפו בשיטות שונות 15 . לשם כך, להכין את השענות נבג ב 0.1% (w / v) Tween-80 ולהתאים את הספירה 1 × 10 3 נבגים / מ"ל.
    2. מורחים את השעונים נבג (0.1 מ"ל) על צלחות כף יד בשלוש ו דגירה על 28 מעלות צלזיוס 70-80% RH עבור 72 שעות.
    3. באופן ידני לספור את המושבות מבודדים לקבוע את המספר הכולל קיימא עבור המדגם בהתאמה.
  3. שיעור שקיעת נבגים
    1. עבור מנון אחיד, ההשעיה נבג הומוגני נדרש; לקבוע את שיעורי שקיעה נבג עבור מבודד metarhizium כמתואר"Xref"> 16. בדוק את שיעורי שקיעה של נבגים ב 0.2 M אמוניום סולפט ו 0.1% Tween-80.
    2. התאם את ספירת ההשעיה נבג ~ 7 × 10 7 נבגים / מ"ל ​​כדי לקבל ספיגה הראשונית של 0.6 ב 540 ננומטר. אפשר cuvettes לעמוד באין מפריע במשך 6 שעות עבור נבגים להתיישב.
    3. הקלט את ספיגת עד 6 שעות. להביע את שיעור שקיעת אחוזים ולחשב את הזמן הדרוש 50% שקיעה (ST 50 ). חזור על הניסוי שלוש פעמים באמצעות השערות נבג מוכן טרי.

5. שדה ביצועים מחקרים על יכולתו של מ ' נבחרת Anisopliae מבודדים לשלוט H. Armigera ב פיג' י peas

  1. אבקת רטוב ניסוח של מ 'anisopliae M 34412 נבגים
    1. הכן את 2.5-5% אבקת wableable ניסוח על ידי ערבוב נבגים עם טלק.
    2. התאם את ספירת קיימא הסופי (TVC) ל 1 x 10 12 ספומ"ל לכל ק"ג של ניסוח.
  2. שדה מחקרים של מ 'אניסופליה M 34412 נבגים
    1. עבור מחקרים בביצועי שדה על יכולתו של מ 'anisopliae הנבחר לבודד לשלוט H. armigera התפשטות אפונה יונה, השתמש RCBD עם ארבע סיבוכים.
      הערה: כאן, בביצוע מהטמה Phole Krush Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
    2. השתמש שני ניסוחים שונים ריסוס, ניסוח שמן של נבגים (5 x 10 12 נבגים / 3 ליטר של דיזל: שמן חמניות, 7: 3) ו ניסוח מימית Tween-80 (0.1%). ריססו את נוסחת השמן עם מרסס נפח נמוך במיוחד (ULV) 70 דקות, 3 ליטר / חה) ניסוח מימי עם תרסיס תרמיל (5 x 10 12 נבגים, 500 L / חה).
      הערה: כאן, אוכלוסיות הזחל נרשמו יום לפני הרסס ו 3 ו -7 ימים לאחר היישום של כל תרסיס ל -5 צמחים שנבחרו באופן אקראי. סך כל האוכלוסייה היה tRansformed לשורש הריבועי של n + 1 לניתוח סטטיסטי.
      1. על פי שיטות חקלאיות של יונה אפונה יבול, לבצע את הריסוס הראשון בין 10 ל 15 ד לאחר הטלת ביצה 2 פעמים יותר עם מרווח של 14 יום. בצע את הריסוס בין 16:00 ו 18:00 h IST. לפקח על כיוון הרוח, אם יש צורך, להשתמש בווילונות בד כדי למנוע סחף של נבגים למגרשים שכנים.
    3. לשם השוואה, לרסס את חומרי הדברה כימיים עם תרסיס יד תרמיל דחיסה.
    4. לקבוע את ההתמדה של inoculum בשדה על ידי איסוף H. הזחלים armigera 0, 3, 5, 7, 14 ימים לאחר הריסוס.
    5. שמור את הזחלים האלה תחת תצפית במשך תקופה של 14 ימים לאחר המוות, להעביר אותם בקבוקון פלסטיק המכיל נייר מסנן לח. דגירה על 25 ± 2 מעלות צלזיוס 70 ± 10% RH להתבונן מיקוזה.
    6. לקבוע את ההתמדה של inoculum על האוכלוסייה הזחל מבוסס על p נתונים תמותה ercent של הזחלים שנאספו מהשדה לאחר ריסוס.
    7. להעריך את מחקרי השדה על בסיס יעילות באחוזים 17 , אחוז נזקי התרמיל ותשואה באחוזים 18 .
      הערה: כאן, הנתונים עבור הפרמטרים, כגון טמפרטורה, לחות, מהירות רוח (קמ"ש), אור שמש (h), גשמים (מ"מ), ימי גשם, אידוי (מ"מ), נרשמו במהלך משפט האוניברסיטה החקלאית (Mahatma Phule Kushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
  3. תוכנית השתתפות של חקלאים
    1. בחר את מספר החקלאים לניסויי ההפגנה. לספק את זרעי אפונה יונה (BSMR - 736) יחד עם דשן לחקלאים.
      הערה: במחקר זה השתתפו 20 חקלאים. כפר: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E).
    2. השתמש באותם ריסוס פורמולציות ומספר תרסיסים כמו בשלב 5.2.
Tle "> 6. השפעה על אורגניזמים שאינם ממוקדים

  1. שים לב להשפעה של תרסיס Mycoinsecticide, אם בכלל, על יונה אפונה משאיר.
  2. לאסוף את arthropods מגורים קרקע חרקים מאכל עלים 1 יום לאחר כל טיפול בחלקות לא מטופלות ועל מגרשים מטופלים עם מ 'anisopliae .
  3. לאסוף את פרוקי רגליים עם מלכודות מלכודת בתוך 24 שעות לאחר הטיפול לאסוף את חרקים מאכל עלים עם רשת לטאטא בבוקר לאחר הטיפול ( כלומר, כ 15-18 שעות לאחר הטיפול).
  4. שמור אותם בנפרד קופסאות פלסטיק גלילי בקוטר של 3.5 ס"מ וגבהים של 4.0 ס"מ. בדוק את החרקים מדי יום עבור זיהום להאכיל אותם עם האוכל המתאים.
  5. הקלט את נוכחותו של מ 'anisopliae , אם בכלל, לבודד את הפטרייה.

7. זיהוי פרמטרים לבקרת איכות

  1. בדוק את הכדאיות נבג על ידי מדידת נביטה נבג על מחשבי כף יד ב 28 °; ג.
  2. למדוד cuticle משפיל פעילות אנזים, כגון chitinase, chitin deacetylase, chitosanase, פרוטאז, ו ליפאז, המיוצר בתקשורת YPG ו chitin, כפי שתואר קודם לכן 15 .
  3. לקבוע את אחוז התמותה של H. Armigera ב bioassay מעבדה 15 .
  4. השתמש סמנים מולקולריים, כגון דפוס PCR-RFLP של Chitinases ( Chit 1 , 2 , 4 ) ו פרוטאז ( Pr1A ) גנים, כמו תכונות ארסיות עבור מ 'anisopliae .
    1. לחלץ את הדנ"א הגנומי מן ביומסה מיסליה באמצעות ערכת בידוד DNA 15 . PCR-להגביר את שברי הגן Chit1 ו Chit2 באמצעות הדנ"א הגנומי כתבנית, עם זוגות פריימר Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) ו Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). עבור Chit4 , השתמש בצמד פריימר Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
    2. עבור הגברה של הגן Pr1A, השתמש METPR2 ו METPR5 זוג פריימר (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
    3. בצע את עיכול הגבלה 19 של הגן Chit1 עם BsaJI, BstUI, ו ScrFI; של הגן Chit2 עם AluI, HpyCH4IV, ו HpyCH4V, ושל הגן Chit4 עם BstUI, HaeIII, ו MboI. לעיכול של הגן Pr1A , השתמש RSAI , DdeI , ו MSPI 20 .
    4. לבחון את אורך מגביל אורך פולימורפיזם (RFLP) דפוס על ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה עבור כל גן עבור זנים ארסיים ביותר (> 90% תמותה); זה יכול לשמש סמן ארס עבור הבחירה של M. anisopliae .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך החקירות, זנים שונים של Metarhium, Beauveria, ו Nomuraea היו מבודדים על ידי שיטות בידוד שונים (נתונים לא מוצגים) 6 , 14 כמו זנים Metarhizium נמצאו להיות יעיל יותר בשליטה H. Armigera , מזיק אימה של קטניות 6 , 14 , בידוד נוסף נועדו לבודד זנים Metarhium מ שדות יבולים שונים חרקים ( טבלה 1 ). סך של 68 מבודד metarhizium שהושגו זוהו על ידי המאפיינים התרבותיים המורפולוגיים ועל ידי ITS 1-5S-ITS 4 רצף. בהתבסס על תמותת 90% של H. Armigera במערכות ביו-מעבדה, 12 מבודדים של מטארהיזיום נבדקו עוד יותר עבור ייצור נבגים, כדאיות, LC 50 , LT 50 ו- ST 50 . טבלה 2 מתארת ​​את הנתוניםעבור 3 מבודדים פוטנציאליים, M34311, M34412 ו- M81123; M34412 נמצאה הבידוד הטוב ביותר.

בין המצעים שנבדקו, כגון אורז, דורה, תירס וחיטה, אורז תמך את המקסימום במקרה של מבודד Metarhium (60-75 גרם של נבגים / ק"ג, 4-4.4 x 10 10 נבגים / גרם של אבקה נבג) .

במהלך ניסוי השדה עבור השליטה של H. Armigera ב אפונה יונה, 78.0% ו 70.9% יעילות הושגו עם M. Anisopliae M34412 שמן וניסוחים מימיים, בהתאמה . הנזק שנגרם למרפסות המטופלות ב- M. Anisopliae נמצא פחות (8.76%) מאשר בחלקות הבקרה הלא מטופלות (23.63%) ובמקומות שטופלו כימית (10.24%). התשואה הממוצעת (Q / ha) בבקרה הלא מטופלת הייתה 7.31 q / h , שהייתה נמוכה יותר מאשר לאחר טיפול M34412 MIS41212 (14.04 q / ha). הטיפול בחומרים כימיים נתן תשואה של 12.78 q / חה ( טבלה 3 ).

התצפיות שנרשמו עבור סימפטומים phytotoxicity עולה כי שום טיפולים הראו השפעה phytotoxic על יבול אפונה יונה לאחר 3 תרסיסים של ניסוח מ 'anisopliae . מתוך 57 פרוקי רגליים (קרקרים ועכבישים), אף אחד מהם לא נדבק. מתוך 590 שאריות פרוטות שאובחנו על ידי חופה, נמצאו שני אנשים של הסדר Heteroptera (= 0.3% של פרוקי הרגליים שנאספו) נגועים ב- M. Anisopliae ( טבלה 4 ). עכבישים וקוצ'ינלידים לא נכנעו לפטרייה.

קרקע (58 מבודד)
בידוד מס ' יְבוּל מספר בודדים
M1211, M311, M1322, M1334, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 עגבנייה 15
M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 תפוח 6
M91528, M91528, M91428, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 קנה סוכר 11
M101133, M101139, M101739, M101234, M101941, M102042, M102143, M1001244, M101739, M101739, M101739, M101834, M101941, M102042, M102244 ברינג'ל 12
M51118, M51219 בַּמיָה 2
M131150, M141151, M141252, M151153 יונה אפונה 4
M121146, M121247, M121348, M121449 חומוס 4
M183365 כותנה 1
M193166 ג'אוואר 1
מארח חרקים (1)0 בודדים)
M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 תולעת יונה אפונה 5
M16154, M16760 סויה קני סוכר 2
M16861 קשקשת לבנה 1
M16962 חיפושית סוכר 1
M161063 קנקן סוכר - פירילה 1

טבלה 1. מקור זני מטרהזיום . 68 מטריזיום זנים היו מבודדים משדות יבולים שונים (58 זנים) וחרקים micosed מ שדות היבול (10 זנים).

לְבוּדֵד תשואה (g / kg אורז) יכולת הקיום (%) 50 ב T80 (h) LC 50 (x 103 נבגים / מ"ל) LT 50 (ימים) תמותה (%)
ממוצע ± SD ממוצע ± SD (גבול פידוסיאלי) (גבול פידוסיאלי) (גבול פידוסיאלי)
M34311 60.00 ± 2.64a 92.00 ± 2.64a 2.47 (2.26-2.69) 2 (0.4-10.3) 3.5 (3.2-3.7) 96.67
M34412 67.00 ± 3.46b 97.00 ± 1.73a 2.3 (2.11-2.52) 1.4 (0.1-1.9) 3.3 (3.0-3.6) 96.67
M81123 75.00 ± 3.60c 93.00 ± 1.73a 2.65 (2.43-2.90) 5.7 (1.2-26.7) 3.3 (3.1-3.6) 95.56
מספרים המופיעים באות זהה בתוך העמודה אינם שונים מבחינה סטטיסטית.
ST 50 , הזמן הנדרש עבור שקיעה של 50% נבגים ב 0.1% (w / v) Tween 80.
מספרים המופיעים באות זהה בתוך העמודה אינם שונים מבחינה סטטיסטית. SD, סטיית תקן. T80, Tween 80 (0.1%, w / v).
LC 50 , הריכוז הקטלני החציוני של נבגים מחושב כדי לגרום לתמותה 50% של H. Armigera לאחר 14 ימים.
LT 50 , חציון הזמן הקטלני של נבגים מחושב לגרום לתמותה 50% של H. Armigera .

טבלה 2. בחירה של שלושה מבודדים הטוב ביותר מבודד Metarhium . H. armigera 3 rd -instar זחלים.

משפט שדה $
יַחַס % יעילות* תשואה (q / ha)
מימית anisopliae M34412 (5x 10 12 נבגים / חה) 500L 70.93 ± 4.19 14.04
ניסוח שמן ( מ 'anisopliae ) (5x 10 12 נבגים / חה) 3 L 78.02 ± 4.61 15.53
חומרי הדברה כימיים / תרגילי חקלאים (2 מ"ל / ל ', 500 ליטר / חה) 63.43 ± 0.85 12.78
בקרה לא מטופלת - 7.31
משפט הדגמה ב (תוכנית השתתפות של חקלאים) $$
יַחַס נזק לפוד תשואה (q / ha)
ניסוח מימי ( מ 'anisopliae ); שטח 4.2 חה 15.9 ± 1.26 10.75
ניסוח נפט ( מ 'anisopliae ); שטח 0.4 חה 17.74 12.5
חקלאים בפועל; אזור 11ha 22.72 ± 3.37 7.55
מיובש
$ עיצוב בלוקים אקראיים
* אחרי הנדרסון וטילטון (1955)
# HNPV, ח ארמיגר
$$ Nמספר החקלאים המעורבים בניסויי ההפגנה היה 20. זרעי אפונה (BSMR - 736) סופקו יחד עם דשנים לחקלאים. כפר: דולי פרבארה, טל. רהורי. Dist. A'Nagar (MS)
(19.473 ° N 74.6 ° E)

טבלה 3. ביצועי שדה של M. anosopliae (M34412) זן נגד H. Armigera . היעילות של ניסוחים שונים של M. Anisopiae הושוו עם טיפולים בחומרי הדברה כימיים נגד H. Armigera infestation ב אפונה יונה בתנאי השטח.

פָּרָמֶטֶר שדה 1 שדה 2 שדה 3
גודל המגרש (m) 12 x 17 10 x 10 10 x 15
משכפל 2 2 2
# ארטרופודים מלכודות מלכודות נבדקו 20 22 15
% נגוע עם מ 'anisopliae (מלכודות מלכודת) ND ND ND
# Arthropods מתוך אוסף נטו לטאטא נבדק 193 171 226
% נגוע מ 'anisopliae (אוסף נטו לטאטא) ND ND 0.9
ND, לא זוהה
שדה 1, מכללת החקלאות, פונה; שדה 2, NGO 1, טולפור, פונה; שדה 3, ארגון לא ממשלתי 2, אלנדי, פונה.
טבלה 4. השפעות טיפולי M. anisopliae על פרוקי רגליים שאינם ממוקדים , התצפיות נרשמו בשלושה תחומים שונים בשני משכפולים, ולא נמצאה השפעה על אף אחד מהחרקים שאינם נגזרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך 1880s, נעשה ניסיון ראשון להשתמש Metarhium כדי לשלוט חיפושית חרפושית, Anisoplia austriaca, ואת סלק סוכר curculio, Cleonis punctiventris 21 . בפרוטוקול זה, אחד התנאים המוקדמים היה לבודד זן ארסי, או מהקרקע או מחרקים נגועים. ואכן, פרמטרים אחרים, כגון LC 50 , LT 50 ו- ST 50 , תרמו באופן משמעותי ליעילות העלות של המוצר 22 , 23 . עבור אופטימיזציה של ייצור נבג, איזון עדין בין מספר נבגים, הכדאיות, ואת ארסיות היה לשמור על 24 .

כמו החקלאות הוא נפח גבוה בעלות נמוכה המוצר, תפיסת איכות, קבלה על ידי משתמשי הקצה, חיי מדף של נבגים הם החששות העיקריים. סגוליות המארח היא יתרון כדי למנוע תופעות שאינן היעד= "Xref"> 14. הימנעות מתת-התרבויות חוזרות ונשנות על מדיום מלאכותי ומעבר מזדמן דרך מארח החרקים שמרה על ארעיותם ויעילותם של נבגי המטריזיום בשדה 22 . הגישה המוצגת יש מגבלות: ההכנה היא יעילה יותר כאשר רמת הסף הכלכלי הוא ~ 2-3 הזחלים לכל צמח, הנביטה נבגים הוא לכל היותר בנוכחות של לחות גבוהה בטמפרטורות נמוכות יחסית.

הנה, ההכנות פטרייתי יעיל לאחר מגע, בעוד חיידקי (Bt) ותכשירים ויראליים (-HaNPV) יעילים רק כאשר מתעכל. לגבי פרמטרים של בקרת איכות, בנוסף לכדאיותם של הנבגים, הוצע לראשונה כי סמנים ביוכימיים ומולקולריים המבוססים על פעילות אנזימים משפילים, ועל דפוסי עיכול ספציפיים של אותם גנים אנזימיים יכולים להבטיח יעילות השדה. איכות contrפרמטרים OL המוצעים הם: (א) הכדאיות נבג, נמדדת נביטה נבגים (צריך להיות> 90% על מחשבי כף יד לאחר 16 שעות ב 28 ° C ו 70-80% RH); (ב) אחוז התמותה של H. Armigera (צריך להיות> 90%, עם 1 x 10 7 נבגים במעבדה ביו-אסאית); (ג) פעילות chitinase במדיום chitin לאחר 72 שעות (צריך להיות> 3.5 x 10 -3 U / mL); ו (ד) דפוס PCR-RFLP של גנים chitinase. כתב היד הזה תיאר למעשה את הפרוטוקולים, מהבידוד של פטרייה אנטומופתוגנית ועד יצירת נתוני יעילות נגד הדברה המטרה בשדה. זהו אחד התנאים המוקדמים כדי לרשום כל ניסוח biopesticide עם המועצה המרכזית קוטל חרקים של הודו, ובסופו של דבר, עבור מסחור.

סדרה של ניסויים המפורטים כאן יהיה שימושי לפיתוח של mycoinsecticide פוטנציאל. יתר על כן, לאחר החילוץ של נבגים, ביומסה פסולת מיסלרי יכול לשמשקידום צמחים או לבידוד של chitosan או גלוקוזאמין פולימרים עבור יישומי בריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים על תרומתם של משתפי הפעולה של שיתוף הפעולה ההודו-שוויצרי בביוטכנולוגיה (ISCB) של המחלקה לביוטכנולוגיה, ניו דלהי והסוכנות השוויצרית לפיתוח ושיתוף פעולה, ברן, שוויץ. תרומתם של תלמידי הפרויקט והצוות המעורבים בפיתוח המיקוטין, כולל ונדנה גורמה, פלבי נהאר, פרייה ידב, שוקלנגי קולקרני, מנישה קאפור, סאנטוש שוואן, רבינדרה וידהאטה, שמאלה מאנה ואבהיג'יט לנדה. EKP ו SGT תודה ועדת מענקים האוניברסיטה, הודו המועצה המדעית והתעשייתית מחקר (CSIR), הודו, בהתאמה, עבור מלגות מחקר. MVD מודה על התמיכה של המועצה המדעית והמחקר המדעי, ניו דלהי עבור תוכנית המדען אמריטוס. המחברים מודים למחלקה לביוטכנולוגיה, ניו דלהי, הודו על התמיכה הכספית תחת ISCB ו SBIRI תוכניות. אנו אסירי תודהסוקרים עבור התשומות שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Hi-Media RM666 Reagent
Ammonium sulphate  Thomas Baker 11645 Reagent
DNA analyzer  Applied biosystem ABI prism 3730   Instrument
DNA islation kit Qiagen 69104 Reagent
Dodine Sigma 45466 Reagent
Gel extraction kit Qiagen 28604 Reagent
Glucose Hi-Media GRM077 Reagent
Knapsac sparyer Kaypee HY-16L (1004) Instrument
Peptone Hi-Media RM006-500G Reagent
Polypropylene vials  Laxbro SV-50 Plasticware
Potato dextrose agar (PDA)  Hi-Media M096-500G Reagent
Tween-80 SRL 28940 Reagent
Ultra low volume sparyer Matabi INSECDISK Instrument
Unicorn-bags  Unicorn UP-140024-SMB Autoclavalbe bag for SSF
Yeast extract Hi-Media RM027-500G Reagent
Chromas 2.1 software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  2. Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
  3. Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
  4. van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
  5. Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
  6. Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
  7. Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
  8. Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
  9. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  10. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
  11. Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
  12. Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
  13. Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
  14. Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
  15. Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
  16. Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
  17. Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
  18. Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
  19. Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
  20. Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
  21. McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
  22. Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
  23. Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
  24. Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).

Tags

מדעי הסביבה גליון 125 ביו-חרקים חרקים, התסיסה התסיסה של מצב מוצק
פיתוח של<em&gt; מטריציום anisopliae</em&gt; כמקוטלת חיידקים: מהבידוד לביצועי שדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tupe, S. G., Pathan, E. K.,… More

Tupe, S. G., Pathan, E. K., Deshpande, M. V. Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance. J. Vis. Exp. (125), e55272, doi:10.3791/55272 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter