Summary
Burada, tarımdaki böcek zararlılarının kontrolü için "en uygun" entomopatojenik mantar Metarhizium anisopliae'nin izolasyonu, belirlenmesi, taranması ve seçimi de dahil olmak üzere etkin bir mikozinsektisid'in bilgi temelli gelişiminde farklı aşamaları bildiriyoruz .
Abstract
Ticari mycoinsecticides geliştirirken önemli bir endişe, kimyasal insektisitlere kıyasla öldürme hızıdır. Bu nedenle, hızlı etkili, oldukça öldürücü, entomopatojenik bir mantar seçimi için izolasyon ve tarama önemlidir. Temas halinde hareket eden Metarhizium, Beauveria ve Nomurea gibi entomopatojen mantarlar, böcek zararlıları tarafından alınması gereken Bacillus thuringiensis veya nucleopolyhedrosis virüsünden (NPV) daha uygundur. Mevcut çalışmada, toprakta seyreltme ve yem yöntemi kullanarak enfekte böceklerden 68 Metarhizium suşunu izole ettik . İzolatlar, ITS1-5.8S-ITS2 ve 26S rDNA bölgesinin amplifikasyonu ve sekanslanması ile tanımlandı. En zararsız Metarhizium anisopliae türü, Helicoverpa armigera'nın III instar larvalarına karşı böcek biyolojik tahlillerinde elde edilen ortalama öldürücü konsantrasyon (LC 50 ) ve zaman (LT 50 ) temel alınarak seçilmiştir .Seçilen suş tarafından sporların seri olarak üretilmesi, 14 gün süreyle pirinç kullanılarak bir katı hal fermantasyonu (SSF) ile gerçekleştirildi. Sporlanan spor kütlesi spor ortamından% 0.1 tween 80 kullanılarak ekstrakte edildi ve sporların farklı formülasyonları hazırlandı. Güvercin bezelyelerinde bir H. armigera istila kontrolü için formülasyonların saha denemeleri randomize blok tasarımı ile gerçekleştirildi. Yağ ve sulu formülasyonlar ile elde edilen istila kontrol seviyeleri (sırasıyla% 78.0 ve% 70.9) kimyasal pestisit ile elde edilen% 63.4'ten daha iyi idi.
Introduction
Hindistan'da 1940 yılında organik klorlu pestisit tanıtımı itibaren pestisit kullanımı ekin zararlıları hala tarımsal üretimde verim kaybı açısından yıllık rupi 2 milyarlarca mal olan, birçok kat 1 artmıştır. Sentetik pestisitlerin yaygın ve bilinçli kullanılmaması, çevreye ve insan sağlığına sürekli bir tehdittir 1 . Pestisitlerin ayrımsız kullanımı, topraktaki kalıntılara ve doğal zararlı yırtıcı hayvanların tükenmesine yol açar. Aynı zamanda, haşere popülasyonunun genetik yapısını değiştiren, direnç gelişmesine yol açan güçlü bir seçim basıncı olarak işlev görür 1 . Gübreler ve böcek zehirleri gibi yüksek girdileri gerektiren yeşil devrimin büyük yararlarina ragmen zararlılar büyük biotik kısıtlama olmaya devam ediyor. Hindistan ve dünya genelinde kaydedilen yıllık mahsul kayıplarının genel bir tahmini 12 milyar ABD dolarıdırEf "> 2 ve 2 milyar ABD dolar> 3'tür .
Kimyasal böcek ilacı böcek zararlılarını kontrol etmek için kullanıldığında zararlı etkilere sahip olduğunda, ekolojik açıdan sağlam, güvenilir, ekonomik ve sürdürülebilir alternatif yöntemler aramak zorunlu hale gelir. Biyolojik kontrol, uygun bir alternatif sunar ve parazitler, predatörler ve mikrobik patojenler 4 içerir . Örneğin fungusların, lepidopteranlar, hymenopteranlar, coleopteranlar ve dipteranlar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede böcek zararlılarını enfekte ettiği bilinir ve çoğu zaman doğal epizootiklere neden olur. Bundan başka, diğer bakteriyel ve viral böcek kontrol maddelerinden farklı olarak, böcek patojen mantarların etki biçimi temasla olur 5 . Bu mantarlar, farklı böcekler arasında yaklaşık 750 tür bildirilen, 100'den fazla cinsiyete sahip heterojen bir gruptan oluşur. Önemli mantar patojenler: Metarhizium sp., Beauveria ss., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii ve Hirsutella sp., 6 birkaç isim. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin, biyokontrolde en çok kullanılan ikinci entomopatojen mantaktandır. 200 böcek türüne 7 saldırı düzenlendiği bilinmektedir 7 .
Bu çalışmada M. anisopliae kullanan bir mikropestiditin bilgi temelli gelişiminde yer alan farklı aşamalar sunulmuştur. Bu, şunları içerir: 1) bir kaynak tanımlanması (örn, virülan entomopatojenlerin, 2) entomopatojene tanımlanması ve seçimi için, toprak ya da mycosed böcekler) ya da, 3) stratejileri, laboratuar, biyo deneme içinde ve bu alanda 4 Virütik doğası ve etkinliğini sağlamak için ) Enfektif propagüllerin maliyet-etkin formülasyonu, 5) zararlı preparasyon için eşsiz kalite kontrol parametrelerinin geliştirilmesi ve 6) biyolojik inceleme ve katma ilavesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Entomopatojenik Mantarların İzolasyonu
- Toprak seyreltme yöntemi
- Farklı mahsul alanlarından toprak numunelerini ve bitkisel böcekleri toplayın ( Tablo 1 ). Toprak seyreltme kaplama yöntemi 8 kullanarak toprak numunelerinden entomopatojen mantarları izole edin.
Not: Bu çalışmada, Pune'dan (18 ° 31'13''N; 73 ° 51'24'') ve Buldana'da (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Ilçeleri, Maharashtra, Hindistan. - Her toprak örneğinden 10 g tartın ve bunları 90 ml steril% 0.1 (w / v) Tween-80'e ayrı ayrı ilave edin.
- Toprak parçacıklarına yapışan sporları serbest bırakmak için numuneleri 60 dakika boyunca manyetik bir karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın.
- Karıştırıldıktan sonra, her bir numuneden 100 ila 200 uL'lik bölümler, (g / L) içeren seçici ortam üzerine yayılır: pepton, 10; Glukoz, 20; Agar, 18; Streptomisin, 0.6; Tetrasiklin, 0.05; cycLoheksamid, 0.05; Ve dodin, 0.1 mL; PH 7.0 9 . Plakaları 28 ° C'de 3-7 gün inkübe edin.
- Saf kültürler elde etmek için aynı ortamdaki bireysel sporlaşan kolonileri seçin ve altkültür edin.
- Farklı mahsul alanlarından toprak numunelerini ve bitkisel böcekleri toplayın ( Tablo 1 ). Toprak seyreltme kaplama yöntemi 8 kullanarak toprak numunelerinden entomopatojen mantarları izole edin.
- Kasık böceklerinden
- Sahadaki mikroskobik böcekleri toplayın.
Not: Sert larval bir vücuda muhtemelen entomopatojenik mantar bulaşmış olabilir. Bakteri veya virüs enfeksiyonu ile ölü böcek vücudu yumuşaktır. - Anormal davranış, kötü eşgüdüm ve sarsıntılı hareketlerle canlı böcekleri toplayın.
- Ölene kadar böcekleri tutun ve daha sonra 28 ° C ve% 70-80 RH'de daha fazla mikoz ve sporülasyon için nemli odacıklara aktarın.
- Sporları sporüle edici kadavrandan yukarıda bahsedilen seçici ortam üzerine çizin ve aynı ortamda 2-3 kez daha alt kültürleyerek saf kültürler elde edin.
- Sahadaki mikroskobik böcekleri toplayın.
- Bait yöntemi
- İçinde60 g toprak örneği içeren şişe (3.85 x 6.0 cm), 4 adet pirinç güvesi larvası ( Corcyra cephalonica ) ekleyin ve ampulleri 25 ± 2 ° C'de 14 gün süreyle saklayın.
- Şişeleri ters çevirin her gün. 14 gün sonra, toprak örneklerinde, mızraklı pirinç güvesi larvalarının varlığı açısından tarama yapın. Seçici ortamda sporüle edici kadavraklardan sporlar çizerek entomopatojenik mantarları izole edin.
- Saf kültürler elde ettikten sonra izolatları patates dekstroz agar (PDA) eğimlerine aktarın ve sporülasyona izin vermek için 28 ° C'de ve% 70-80 RH'de 7 gün inkübe edin. Sporlamayı takiben, ana kültürleri kullanıma kadar 8 ° C'de muhafaza edin.
2. Entomopatojenik Mantarların Tanımlanması
- Morfolojik özelliklerini gözlemleyerek, entomopatojenik mantarları tanımlayın ( örn., Eşeysiz spor boyutu ve şekli ile sporların konidyoforlar üzerindeki düzenlenmesi); 3 ana cins izolatı, Metarhizium , Beauv Eria ve Nomuraea , tespit edilebilir.
- Metarhizium suşlarının moleküler tanımlanması için bir DNA izolasyon kiti kullanarak misel biyokütlenin genomik DNA'sını çıkarın; Üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). % 0.8 agaroz jel üzerinde elektroforez uygulayarak genomik DNA'nın kalitesini kontrol edin.
- ITS1-5.8S-ITS2 ve 26S rDNA bölgesinin PCR ile çoğaltılması. Genetik DNA'yı şablon olarak kullanın, ITS1 ileri (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ve ITS4 ters (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primerlerle 10 .
- Jel-elute ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak beklenen boyut amplikonları saflaştırmak; Üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Saflaştırılmış amplikon ve sekansı nicelleştirin.
- Yazılımı kullanarak dizileri okuyun ve düzenleyin ve yakın homolojiyi analiz etmek için NCBI GenBank veri kitaplığında nükleotid dizilerinin BLAST araması yapın= "Xref"> 11.
- Erişim numaralarını almak için tanımlanmış entamopatojenik izolatların dizilerini NCBI GenBank veritabanına yatırın.
3. Metarizyum İzolatlarının H. armigera'ya Karşı Taranması
- Böcek yetiştirme
- Tarladan böceklerin sağlıklı larva ve pupalarını toplayarak H. armigera'nın ilk kültürünü oluşturun.
- Yetiştirme için, 10 dakika için 12 (3.85 x 6.0 sm 50 ml kapasiteli) steril polipropilen şişelerde ayrı ayrı% 0.5 ile dezenfekte bamya parçalarını ihtiva eden (h / h) sodyum hipoklorit larvası yetiştirme.
- Yetiştirme sırasında döşenen böcek yumurtalarını toplayın ve% 0.5 (h / h) sodyum hipoklorit ile yüzey sterilize edin.
- Larvaları 25 ± 2 ° C ve% 65 ± 5 RH'de muhafaza edin.
- Böcek biyolojik tahlil
Not: Böcek biyolojik tahlilinde, sporların üretimi,Ve tarla performansı araştırmalarında, aksi belirtilmedikçe, mycosed H. armigera larvalarından Metarhizium suşlarının ilk alt kültürleri kullanılmıştır.- Böcek biyolojik tahlilleri için, H. armigera'nın III instar larva'larını kullanın .
- 5 saniye için, tek tek Metarhizium izolatların (canlılık>% 90, 1 x 10 7 spor / aksi belirtilmedikçe, mL) içindeki bir 10-mL spore süspansiyonu içine üç kopya halinde 30 larva bir dizi batırın.
- Tedaviden sonra, yamyamlıktan kaçınmak için her larva ayrı ayrı, steril bir şişeye ayrı ayrı aktarılmalıdır. Her bir şişeye nemli Whatmann filtre kağıdı No.1 ve yem olarak dezenfekte edilmiş bir bamya ekleyin. Kağıtları değiştirin ve alternatif günlerde besleyin.
- Larvaları 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH ve 16: 8 ışıkta karanlık olarak 14 gün boyunca veya ölene kadar tutun.
- Ölü larvaları, nemli pamuklu çubuk içeren steril Petri plakalarına aktarın ve 3-6 gün boyunca 28 ° C'de ve% 70-80 RH'de muhafaza ederek mikseri ve sporu sağlayınKadavra üzerinde oluşum.
- Bir kontrol için steril damıtılmış su içinde% 0.1 (w / v) Tween-80 ile üçlü bir grup 30 larva tedavi edin.
- Tüm deneyleri taze hazırlanmış spor süspansiyonlarını kullanarak üçer defa uygulayın. Ortalama değerleri elde etmek için üç deneyden yüzde mortalite verileri toplayın ve havuzlayın. Abbott'un formülünü kullanarak düzeltilmiş yüzde ölüm oranını hesaplayın 13 .
- Denemeleri, her muamele üçlü olarak 30 larvanın bir setini içeren randomize tam blok tasarımı (RCBD) düzeni kullanarak gerçekleştirin. H. armigera'ya karşı yüzde ölüm oranına dayanarak, ticari üretim için en iyi izolatın daha fazla taranması için Metarhizium izolatlarını seçin.
- H. armigera III instar larvalarına karşı>% 90 mortalite gösteren izolatları seçin.
Not: Burada, 12 izolat seçildi. - Bu izolatların LT 50 değerlerini belirleyin ve izolat demonst'u seçinEn hızlı öldürmeyi derecelendirin (daha kısa sürede).
Not: Burada, en güçlü 12 izolattan 5 izolat seçildi. - Seçilen izolatların LC 50 değerlerini spor süspansiyonunun dört farklı konsantrasyonu (örn. 1 x 10 3 , 1 x 10 5 , 1 x 10 7 ve 1 x 10 9 spor / mL) kullanarak belirleyin.
- Tek bir doz kullanıldığında saptanamayacak kadar yüksek mortalite değerlerine sahip izolatların virülansındaki farkı tanımlama imkânını artırmak için Metarizyum izolatlarının LC 50'sini H. armigera'nın III talent larvalarına karşı belirler.
4. Alan Performansı Çalışmaları İçin Bir Metarhizium İzolatının Sporlarının Üretilmesi
- SSF tarafından Metarhizium sporlarının üretimi
- SSF için, inokulumu Metarhizium izolatlarının 2 x 10 7 sporunu ekleyerek hazırlayın.200 mL YPG (% 0.3 maya ekstraktı,% 0.5 pepton ve% 1.0 glikoz) ortamı. Şişeleri 28 ° C'de çalkalayarak (180 dev / dak) 48 saat inkübe edin.
- Sporların SSF tarafından seri olarak üretilmesi için, aksi belirtilmediği sürece pirinci bir substrat olarak kullanın.
- SSF için, 2 kg pirinçle otoklav torbalarını (tip / 14, 0.5 μm'lik tek bir mikroventli filtre ile; 2 kg kapasiteli; 64 x 36 cm) doldurun. Çantalardaki pirincin içine 1.000 mL damıtılmış su ilave edin ve gece boyunca 14 ° C'de bekletin. 45 dakika için 15 121 ° C'de batırılmış pirinç çanta otoklava.
- Çantaları 48 saat yaşlı miselyum aşı ile (% 10 inokülum, 2 kg pirinç için 200 mL) inoküle edin ve 28 ° C'de ve% 70-80 RH'de 14 gün boyunca inkübe edin.
- Sporları% 0.1 Tween-80 kullanarak sıvı ekstraksiyonu ile hasat edin. Bunun için torbanın içeriğini% 0.1 Tween-80'e (1 kg pilav başına 3 L) ilave edin, iyice karıştırın, sporları santrifüjleyerek sıvıdan ayırın ve 2 gün boyunca 37 ° C'de kurutun. < / Li>
- Alternatif olarak, nem içeriğini (<% 20) azaltmak için, pilav içeren poşetleri sporlar ve bazı miselyum ile 37 ° C'de 2 gün kurutun. Mikro biçerdöver veya titreşimli elek kullanarak sporları toplayın.
- Canlılık çalışmaları
- Farklı yöntemleri kullanarak hasat edilen sporların canlılık yüzdelerini belirleyin 15 . Bunun için, spor süspansiyonlarını% 0.1 (w / v) Tween-80'de hazırlayın ve sayımı 1 x 10 3 spor / mL'ye ayarlayın.
- Spor süspansiyonlarını (0.1 mL) üç kez PDA plakalarına yayın ve 72 saat boyunca 28 ° C ve% 70-80 RH'de inkübe edin.
- İzole edilmiş kolonileri manuel olarak sayın ve ilgili numunenin toplam canlı sayımını belirleyin.
- Spor çökelme hızı
- Tekdüze bir dozaj için, homojen spor süspansiyonu gereklidir; Tarif edildiği gibi Metarhizium izolatlarının spor çökme oranlarını belirleyebilir"Xref"> 16. Sporların 0.2 M amonyum sülfat ve% 0.1 Tween-80'deki sedimentasyon hızlarını kontrol edin.
- 540 nm'de 0.6 bir başlangıç emicilik elde etmek için yaklaşık 7 x 10 7 spor / mL'ye spor süspansiyonu sayısını ayarlar. Sporların yerleşmesi için küvetler 6 saat boyunca rahatsız edilmemelidir.
- Emicili 6 saate kadar kaydedin. Sedimentasyon oranını yüzde cinsinden ifade edin ve% 50 sedimantasyon için gereken süreyi hesaplayın (ST 50 ). Deneyi, taze hazırlanmış spor süspansiyonlarını kullanarak üç kez tekrarlayın.
5. Seçilmiş M. anisopliae İzolatının Güvercin Bezelye'lerinde H. armigera'ya Kontrol Yeteneğinin Alan Performansı Çalışmaları
- M. anisopliae M 34412 sporlarının ıslanabilir toz formülasyonu
- Sporları talk ile karıştırarak% 2.5-5 ıslanabilir toz formülasyonunu hazırlayın.
- Son canlı sayımı (TVC) 1 x 10 12 spoya ayarlayınFormülasyonun kilogramı başına res.
- M. anisopliae M 34412 sporlarının tarla performansı çalışmaları
- Seçilen M. anisopliae izolatının güvercin bezelye suyunda H. armigera istilasını kontrol etme becerisinin saha performansı araştırmaları için, dört kez tekrarlanan bir RCBD kullanın.
Not: Burada, Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri'de (19.3927 ° N, 74.6488 ° E) gerçekleştirildi. - İki farklı sprey formülasyonu, spor yağ formülasyonu (5 x 10 12 spor / 3 L dizel: ayçiçek yağı, 7: 3) ve Tween 80'de sulu bir formülasyon (% 0.1) kullanın. Yağ formülasyonunu süngerli formülasyona sırt çantalı bir püskürtücü (5 x 10 12 spor, 500 L / ha) ile ultra düşük hacimli (ULV) püskürtücülerle (70 dak; 3 L / ha) püskürtün.
Not: Burada, larval popülasyonlar spreyden bir gün önce ve her spreyin uygulanmasından 3 ve 7 gün sonra rasgele seçilen 5 bitkiye kaydedildi. Toplam nüfus tIstatistiksel analiz için n + 1 kareköğüsüne ransformed.- Güvercin bezelye mahsülünün tarımsal uygulamalarına göre, ilk yumurta döşeme işleminden 10 ve 15 gün sonra ve 14 gün aralıklarla 2 kez daha püskürtün. Püskürtmeyi 16:00 ila 18:00 saatleri arasında gerçekleştirin. Rüzgar yönünü izleyin ve sporların bitişik arazilerde sürüklenmesini önlemek için gerekirse bez perdeleri kullanın.
- Karşılaştırma yapmak için, kimyasal böcek öldürücüleri bir el sıkıştırmalı püskürtücüyle püskürtün.
- Püskürtmeden sonra 0, 3, 5, 7 ve 14. günlerdeki H. armigera larvalarını toplayarak alandaki inokülumun ısrarını belirleyin.
- Bu larvaları 14 gün süreyle gözlem altında tutun ve ölümden sonra, nemli filtre kağıdını içeren bir plastik şişeye aktarın. Mikozu gözlemlemek için 25 ± 2 ° C'de ve% 70 ± 10 RH'de inkübe edin.
- Larva popülasyonu üzerindeki inokülumun p'ye dayanılarak kalıcılığını belirleyin Püskürtme sonrası tarladaki larvaların ölüm verileri.
- Yüzde etkinlik 17 , yüzde gözenek hasarı ve yüzde verimi 18 ile alan çalışmalarını değerlendirin.
Not: Burada, sıcaklık, nem, rüzgar hızı (km / s), güneş ışığı (h), yağış (mm), yağışlı günler ve buharlaşma (mm) gibi parametreler için veriler bir deneme süresince Tarım üniversitesi (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- Seçilen M. anisopliae izolatının güvercin bezelye suyunda H. armigera istilasını kontrol etme becerisinin saha performansı araştırmaları için, dört kez tekrarlanan bir RCBD kullanın.
- Çiftçilerin katılım programı
- Gösterim denemeleri için çiftçilerin sayısını seçin. Güvercin bezelye tohumlarını (BSMR - 736) çiftçilere gübre ile birlikte tedarik edin.
Not: Bu çalışmada 20 çiftçi katılmıştır. Köy: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Adım 5.2'deki ile aynı sprey formülasyonlarını ve sprey sayısını kullanın.
- Gösterim denemeleri için çiftçilerin sayısını seçin. Güvercin bezelye tohumlarını (BSMR - 736) çiftçilere gübre ile birlikte tedarik edin.
- Güvercin bezelye yapraklarında varsa mycoinsecticide sprey etkisine dikkat edin.
- Muamele edilmemiş parsellerdeki ve M. anisopliae ile işlem gören parsellerdeki her muameleden 1 gün sonra toprakta yaşayan eklembacaklıları ve yaprak içinde yaşayan böcekleri toplayın.
- Tedaviden 24 saat sonra çukurluk tuzakları olan toprakta yaşayan eklem bacaklı toplayın ve tedaviyi takiben sabahı yaprak içinde yaşayan böcekleri bir tarama ağıyla toplamayın ( yani, muameleden yaklaşık 15-18 saat sonra).
- Tek tek silindir plastik kutularda tutun. Çubuk çapları 3,5 cm ve yüksekliği 4,0 cm'dir. Günlük böcekleri enfeksiyon açısından kontrol edin ve uygun gıdalarla besleyin.
- M. anisopliae'nin varlığını kaydedin ve eğer mantarın izole edilmesi.
7. Kalite kontrol parametrelerinin tanımlanması
- PDA'daki spor çimlenmesinin 28 ° C'de ölçülmesiyle spor canlılığını kontrol edinC.
- Daha önce tarif edildiği gibi 15 , YPG ve kitin ortamında üretilen kütinaz, kitin deasetilaz, kitozanaz, proteaz ve lipaz gibi kütikül degradasyon enzim aktivitelerini ölçün.
- Laboratuvar biyolojik tahlilinde H. armigera'nın ölüm yüzdesini belirleyin 15 .
- M. anisopliae'nin virulans öznitelikleri olarak, PCR-RFLP paterninde Chitinases ( Chit 1 , 2 ve 4 ) ve proteazın ( Pr1A ) genleri gibi moleküler işaretleyicileri kullanın.
- DNA izolasyon kiti 15 kullanarak mikroskobik biyolojik kütleden genomik DNA'yı çıkarın. Chit1 ve Chit2 gen parçalarını Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) primat çiftleri ve Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA) ile şablon olarak genomik DNA kullanarak amplifiye edin. Chit4 için Chit4F / Chit4R primer çifti kullanın (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Pr1A geninin amplifikasyonu için, METPR2 ve METPR5 primer çifti (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG) kullanın.
- Chit1 geninin 19 sınırlama sindirimini BsaJI , BstUI ve ScrFI ile gerçekleştirin ; AluI, HpyCH4IV ve HpyCH4V, ve BstUI, Haelll ve MboI ile Chit4 geninin Chit2 geninin. Pr1A geninin hazmı için Rsal, DdeI ve MspI 20 kullanımı.
- En öldürücü suşlar için her bir gen için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde kısıtlama fragmanı uzunluğu polimorfizm (RFLP) örneğini izleyin (>% 90 mortalite); Bu, M. anisopliae'nin seçimi için bir virulans markörü olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Araştırmalar sırasında, Metarhizium, Beauveria ve Nomuraea çeşitli tipleri Metarhizium suşları gibi, 14, H. armigera, pals 6 korkunç vebası, 14 kontrol daha etkili olduğu tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir) 6, çeşitli izolasyon yöntemleri ile izole edilmiştir , Farklı tarlalardan ve böceklerden Metarhizium suşlarını izole etmek için daha fazla izolasyon hedeflenmiştir ( Tablo 1 ). Elde edilen toplam 68 Metarhizium izolatı kültürel ve morfolojik özellikler ve ITS 1-5.8S-ITS 4 dizilemesi ile tanımlandı. Laboratuar biyolojik tahlillerindeki H. armigera'nın % 90'ın üzerindeki mortalitesine dayanarak, 12 Metarhizium izolatı, spor üretimi, canlılığı, LC 50 , LT 50 ve ST 50 için daha da test edilmiştir. Tablo 2 ,3 potansiyel izolat için, M34311, M34412 ve M81123; M34412'nin en iyi performans gösteren izolat olduğu bulundu.
Örneğin pirinç, sorgum, mısır ve buğday gibi test edilen alt-tabakalar arasında, pirinç Metarhizium durumunda maksimum sporülasyon izole desteklenen (sporlar / kg 60-75 g spor tozu 4-4,4 10 x 10 spor / g), .
H. armigera'nın güvercin bezlerinde kontrolü için saha denemesi sırasında sırasıyla M. anisopliae M34412 yağ ve sulu formülasyonlar ile% 78.0 ve% 70.9 etkinlik elde edildi . M. anisopliae ile tedavi edilen arsaların bakla zararı, arıtılmamış kontrol parsellerine (% 23.63) ve kimyasal olarak arıtılmış parsele (% 10.24) göre daha az (% 8.76) bulunmuştur. Muamele edilmemiş kontrol grubundaki ortalama verim (q / ha), M. anisopliae M34412 muamelesinden (14.04 q / ha) sonra olan 7.31 q / ha'dan düşüktür. Kimyasal işlem, 12.78 q / ha verim sağlamıştır ( Tablo 3 ).
Fitotoksisite belirtileri için kaydedilen gözlemler, hiçbir muamele, günde üç kez M. anisopliae formülasyon spreyinden sonra güvercin bezelye bitkisinde fitotoksik bir etki göstermediğini ortaya koymuştur. Toplanan 57 topraktaki eklembacaklılardan (tarla kriketleri ve örümceklerden) hiçbiri enfekte değildi. Toplanan canopy-yaşayan eklem bacaklılardan 590 tanesinde Heteroptera (= toplanan eklembacaklıların% 0.3'ü) olan iki kişiye M. anisopliae enfekte olduğu tespit edildi ( Tablo 4 ). Ne örümcekler ne Coccinellids mantara yenik düşmedi.
| Toprak (58 izolat) | ||
| Yalıtım No. | ekin | Izolat sayısı |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Domates | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Muhallebi elma | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Şeker kamışı | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | Bamya | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Güvercin bezelye | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Nohut | 4 |
| M183365 | Pamuk | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Böcek konakçı (10 izolatlar) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Güvercin bezelye yağlı kurdu | 5 |
| M16154, M16760 | Şeker kamışı böreği | 2 |
| M16861 | Şeker kamışı beyaz leblebi | 1 |
| M16962 | Şeker kamışı-böceği | 1 |
| M161063 | Şeker kamışı-pirilla perpussila | 1 |
Tablo 1. Metarhizium suşlarının kökeni. 68 Metarhizium suşu, farklı ekin alanlarından (58 suş) ve ekin alanlarından (10 suş) mikroskobik böceklerden izole edildi.
| yalıtmak | Verim (g / kg pilav) | Canlılık (%) | LC 50 (x 103 spor / mL) | LT 50 (günler) | Mortalite (%) | |
| Ortalama ± SD | Ortalama ± SD | (Fidusial Limit) | (Fidusial Limit) | (Fidusial Limit) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92.00 ± 2.64a | 2.47 (2.26-2.69) | 2 (0.4-10.3) | 3.5 (3.2-3.7) | 96.67 |
| M34412 | 67.00 ± 3.46b | 97.00 ± 1.73a | 2.3 (2.11-2.52) | 1.4 (0.1-1.9) | 3.3 (3.0-3.6) | 96.67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93.00 ± 1.73a | 2.65 (2.43-2.90) | 5.7 (1.2-26.7) | 3.3 (3.1-3.6) | 95,56 |
| Sütun içinde aynı harfi izleyen rakamlar istatistiksel olarak farklı değildir. | ||||||
| ST 50 ,% 0.1 (w / v) Tween 80'de% 50 sporların sedimantasyonu için gerekli süre. | ||||||
| Sütun içinde aynı harfi izleyen rakamlar istatistiksel olarak farklı değildir. SD, Standart Sapma. T80, Tween 80 (% 0.1, ağ / hac). | ||||||
| LC 50 , sporların ortalama ölümcül konsantrasyonu, 14 gün sonra H. armigera'nın % 50'sinde mortaliteye neden olmak için hesaplandı. | ||||||
| LT 50 , sporların ortalama ölümcül zamanı, H. armigera'nın % 50 ölümüne neden olarak hesaplandı. | ||||||
Tablo 2. En iyi performans gösteren üç Metarhizium izolatı seçimi. H. armigera 3üncü kademeli larva ile böcek biyolojik tahlillerinde üretim parametrelerine ve performansa dayalı olarak seçildi.
| Arazi Denemesi $ | ||
| tedavi | Etkinlik yüzdesi * | Verim (q / ha) |
| Sulu M. anisopliae M34412 (5x10 12 spor / ha) 500 L | 70.93 ± 4.19 | 14.04 |
| Yağ formülasyonu ( M. anisopliae ) ( 5x10 12 spor / ha) 3 L | 78.02 ± 4.61 | 15,53 |
| Kimyasal tarım ilaçları / Çiftçilerin uygulaması (2 ml / L, 500 L / ha) | 63.43 ± 0.85 | 12.78 |
| Muamele edilmemiş Kontrol | - | 7.31 |
| Demonstrasyon denemesinde (Çiftçilerin katılımcı programı) $$ | ||
| tedavi | Kurbağı hasarı | Verim (q / ha) |
| Sulu formülasyon ( M. anisopliae ); Alan 4.2 ha | 15.9 ± 1.26 | 10.75 |
| Yağ formülasyonu ( M. anisopliae ); Alan 0.4 ha | 17.74 | 12.5 |
| Çiftçilerin uygulamaları; Alan 11ha | 22.72 ± 3.37 | 7.55 |
| Sulanan bitki | ||
| $ Rasgele Blok Tasarımı | ||
| * Henderson ve Tilton'dan (1955) sonra | ||
| # HaNPV, H. armigera nucleopolyhedrovirus | ||
| $$ NGösterim çalışmalarına katılan çiftçilerin sayısı 20 idi. Güvercin bezelye tohumları (BSMR - 736) çiftçilere gübre ile birlikte tedarik edildi. Köy: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19.473 ° N 74.6 ° E) | ||
Tablo 3. M. anosopliae (M34412) suşunun H. armigera'ya karşı tarla performansı. M. anisopiae'nin farklı formülasyonlarının etkinlikleri, güvercin bezelye alan koşullarında H. armigera istilasına karşı kimyasal zehir ilaçlarıyla karşılaştırılmıştır.
| Parametre | Alan 1 | Alan 2 | Alan 3 |
| Arsa büyüklüğü (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| çoğaltır | 2 | 2 | 2 |
| # Düşen tuzaklardan arthropodlar test edildi | 20 | 22 | 15 |
| M. anisopliae ile enfekte (çukur tuzakları) | ND | ND | ND |
| # Tarama net topluluğundan test edilen artropodlar test edildi | 193 | 171 | 226 |
| M. anisopliae (süpürme ağı toplama) ile enfekte | ND | ND | 0.9 |
| ND, Tespit edilemedi Alan 1, Ziraat üniversitesi, Pune; Alan 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Alan 3, STK 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1880'li yıllarda, ilk girişim, bok böreği böcekleri, Anisoplia austriaca ve şeker pancarı curculio Cleonis punctiventris 21 kontrol etmek için Metarhizium kullanmaya yapılmıştır. Bu protokolde ön koşullardan biri, ya topraktan ya da enfekte böceklerden oluşan bir öldürücü zararı izole etmekti. Aslında, LC 50 , LT 50 ve ST 50 gibi diğer parametreler, ürünün 22 , 23 maliyet etkinliğine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Spor üretiminin optimizasyonu için spor endüstrisi, canlılık ve virülans arasında hassas bir denge 24 sağlanmıştır.
Tarım, yüksek hacimli ve düşük maliyetli bir üründür; kalite algılaması, son kullanıcılar tarafından kabul edilebilirlik ve sporların raf ömrü büyük endişelerdir. Host özgüllüğü, hedef dışı etkileri önleme açısından avantajlıdır= "Xref"> 14. Suni ortamda tekrar tekrar alt kültürlenmenin önüne geçilmesi ve böcek konakçığına zaman zaman geçilmesi, Alan 22'deki Metarhizium sporlarının virülansını ve etkililiğini devam ettirdi . Sunulan yaklaşımın sınırlamaları vardır: ekonomik eşik seviyesi bitki başına ~ 2-3 larva olduğu zaman hazırlanma daha etkilidir ve yüksek nem ve nispeten düşük sıcaklıklarda spor çimlenmesi maksimum seviyededir.
Burada bakteri (Bt) ve viral preparatlar (-HaNPV) sadece sindirimde etkili olsa da, mantar preparatı temastan sonra etkindir. Kalite kontrol parametreleri ile ilgili olarak, sporların canlılığının yanı sıra, ilk defa, aynı enzim genlerinin kütikül degradasyon enzimi aktivitelerine ve spesifik kısıtlama sindirim modellerine dayanan biyokimyasal ve moleküler markörlerin etkinlik kazandırabileceği öne sürülmüştür alan. Kalite-kontrÖnerilen ol parametreleri: (a) spor çimlenmesi olarak ölçülen spor canlılığı (28 ° C'de ve% 70-80 RH'de 16 saat sonra PDA'da>% 90 olmalıdır); (b) H armigera yüzde ölüm oranı (laboratuvar, biyo deneme içinde, 1 x 10 7 sporlarla>% 90 olmalıdır); (C) 72 saat sonra kitin ortamında bulunan kitinaz aktivitesi (> 3.5 x 10 -3 U / mL olmalıdır); Ve (d) kitinaz genlerinin PCR-RFLP örneği. Bu el yazması, esas olarak, bir entomopatojenik mantarın izolasyonundan sahadaki zararlılara karşı etkinlik verilerinin oluşturulmasına kadar olan protokolleri tarif etmiştir. Bu, herhangi bir biyo-pestisit formülasyonunu Hindistan Merkezi İnsektisit Kurulu'na kaydetmenin ve nihayetinde ticarileştirme için ön koşullardan biridir.
Burada detaylandırılan deney serisi, potansiyel bir mycoinsecticide geliştirilmesi için yararlı olacaktır. Ayrıca, sporların ekstraksiyonundan sonra, atık mikroskobik biyokütle,Bitki büyüme promosyonu veya chitosan veya glikozamin polimerlerin sağlık uygulamaları için izolasyonu için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Yeni Delhi ve İsviçre, Berne, Kalkınma ve İşbirliği İsviçre Ajansı'nın Biyoteknoloji Bölümü'ndeki Hint-İsviçre İşbirliği Biyoteknolojideki İşbirliği (ISCB) programındaki işbirlikçilerinin katkısını kabul ediyor. Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane ve Abhijeet Lande dahil olmak üzere mikozinsit geliştirilmesine katılan proje öğrencilerinin ve çalışanların katkıları kabul edilmektedir. EKP ve SGT araştırma bursları için sırasıyla Üniversite Hibeler Komisyonu, Hindistan ve Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi (CSIR), Hindistan'a teşekkür ederler. MVD, Emeritus Scientist Scheme için Yeni Delhi Sanayi ve Bilimsel Araştırma Konseyi'nin desteğini onayladı. Yazarlar ISCB ve SBIRI programları kapsamında maddi destek için Yeni Delhi, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'ne minnettarlar. Teşekkür ederizOnların girdileri için yorumcular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
