Summary
Здесь мы сообщаем о различных этапах разработки основанного на знаниях эффективного микоинсецицита, включая изоляцию, идентификацию, скрининг и подбор «энтеропатогенного гриба« наилучшего соответствия », Metarhizium anisopliae , для борьбы с насекомыми-вредителями в сельском хозяйстве ,
Abstract
Основной проблемой при разработке коммерческих микоинсектицидов является скорость уничтожения по сравнению с химическими инсектицидами. Поэтому важными шагами являются изоляция и скрининг для выбора быстродействующего, сильно вирулентного энтомопатогенного гриба. Энтомопатогенные грибы, такие как Metarhizium, Beauveria и Nomurea , которые действуют при контакте, лучше подходят, чем Bacillus thuringiensis или вирус нуклеополедроза (NPV), которые необходимо принимать внутрь насекомого-вредителя. В настоящей работе мы выделили 68 штаммов Metarhizium от инфицированных насекомых с использованием метода разбавления почвы и приманки. Изоляты были идентифицированы путем амплификации и секвенирования области рДНК ITS1-5.8S-ITS2 и 26S. Наиболее вирулентный штамм Metarhizium anisopliae был выбран на основе медианной летальной концентрации (LC 50 ) и времени (LT 50 ), полученной в биоанализах насекомых, против личинок III-типа Helicoverpa armigera.Массовое производство спор по выбранному штамму проводили с твердофазной ферментацией (SSF) с использованием риса в качестве субстрата в течение 14 дней. Споры экстрагировали из спорулированной биомассы с использованием 0,1% твин-80 и получали различные составы спор. Полевые испытания составов для борьбы с заражением H. armigera в голубем были проведены рандомизированным блочным дизайном. Уровни контроля заражения, полученные с маслом и водными составами (78,0% и 70,9% соответственно), были лучше, чем 63,4%, полученные химическим пестицидом.
Introduction
С введением хлорорганических пестицидов в 1940 - х годах в Индии, использование пестицидов увеличилось во много раз 1, с урожая вредители все еще обходится в миллиарды рупий 2 в год с точки зрения потери урожая в сельскохозяйственном производстве. Широкое и неразумное использование синтетических пестицидов является постоянной угрозой для окружающей среды и здоровья человека 1 . Неизбирательное использование пестицидов приводит к остаткам в почве и истощению природных хищников-вредителей. Он также служит мощным давлением отбора для изменения генетического состава популяции вредителей, что приводит к развитию резистентности 1 . Несмотря на огромные преимущества «зеленой революции», требующей больших затрат, таких как удобрения и пестициды, вредители продолжают оставаться основным биотическим ограничением. Общая оценка зарегистрированных ежегодных потерь урожая в Индии и во всем мире составляет 12 млрд. Долл. СШАEf "> 2 и 2 000 млрд. Долл. США 3 соответственно.
Когда химические пестициды оказывают вредное воздействие при использовании для борьбы с насекомыми-вредителями, необходимо искать альтернативные методы, которые являются экологически безопасными, надежными, экономичными и устойчивыми. Биологический контроль предлагает подходящую альтернативу и включает использование паразитов, хищников и микробных патогенов 4 . Известно, что грибы заражают широкий круг насекомых-вредителей, включая чешуекрылых, перепончатокрылых, колеоптеров и диптерин, часто приводящих к естественным эпизоотиям. Кроме того, в отличие от других бактериальных и вирусных средств борьбы с насекомыми, способ действия патогенных грибов насекомых находится в контакте 5 . Эти грибы содержат гетерогенную группу из более чем 100 родов, из которых около 750 видов относятся к различным насекомым. Важными грибковыми патогенами являются: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii и Hirsutella sp., Чтобы назвать несколько 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Сорокин является вторым наиболее широко используемым энтомопатогенным грибом в биоконтролле. Известно, что он атаковал более 200 видов насекомых 7 .
В этом исследовании представлены различные этапы, связанные с основанием на знаниях развития микопауцида с использованием M. anisopliae . Это включает в себя: 1) идентификацию источника ( т. Е. Почв или насекомых-мицеров) для вирулентных энтомопатогенов, 2) идентификацию и селекцию энтомопатогена, 3) стратегии сохранения их вирулентного характера и эффективности в лабораторном биоанализе и на местах 4 ) Рентабельная формулировка инфекционных размножений, 5) разработка уникальных параметров контроля качества для вирулентного препарата и 6) биоразведка и добавление стоимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение энтомопатогенных грибов
- Метод разбавления почвы
- Соберите образцы почвы и насекомых-микозов из разных полей сельскохозяйственных культур ( Таблица 1 ). Выделите энтомопатогенные грибы из образцов почвы, используя метод нанесения покрытия на почву 8 .
Примечание: в этом исследовании образцы были собраны из Пуны (18 ° 31'13''N, 73 ° 51'24''E) и Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ), Махараштра, Индия. - Взвесьте 10 г каждого образца почвы и добавьте их отдельно к 90 мл стерильного 0,1% (мас. / Об.) Твин-80.
- Тщательно перемешайте образцы с помощью магнитной мешалки в течение 60 мин, чтобы высвободить споры, прилипающие к частицам почвы.
- После смешивания распределяйте аликвоты от 100 до 200 мкл из каждого образца на селективную среду, содержащую (г / л): пептон, 10; Глюкоза, 20; Агар, 18; Стрептомицин, 0,6; Тетрациклин, 0,05; сусЛохексиламид, 0,05; И додина, 0,1 мл; PH 7,0 9 . Инкубируйте планшеты при 28 ° C в течение 3-7 дней.
- Выбор и субкультура отдельных спорулирующих колоний на одной и той же среде для получения чистых культур.
- Соберите образцы почвы и насекомых-микозов из разных полей сельскохозяйственных культур ( Таблица 1 ). Выделите энтомопатогенные грибы из образцов почвы, используя метод нанесения покрытия на почву 8 .
- От зараженных насекомых
- Соберите зараженных насекомых с поля.
Примечание. Твердое личиночное тело, вероятно, заражено энтомопатогенным грибом. При бактериальной или вирусной инфекции тело мертвого насекомого является мягким. - Собирайте живых насекомых с ненормальным поведением, плохой координации и рывками.
- Храните насекомых до смерти и затем переносите их во влажные камеры для дальнейшего микоза и споруляции, если таковые имеются, при 28 ° C и относительной влажности 70-80%.
- Выровняйте споры от спорообразующих трупов на вышеупомянутой селективной среде и получите чистые культуры путем дальнейшей субкультуры 2-3 раза на той же среде.
- Соберите зараженных насекомых с поля.
- Метод приманки
- ВФлакон (3,85 х 6,0 см), содержащий 60 г образца почвы, добавить 4 личинок личинок риса ( Corcyra cephalonica ) и оставить флаконы при 25 ± 2 ° C в течение 14 дней.
- Поверните пузырьки вверх дном каждый день. Через 14 дней отфильтруйте образцы почвы для присутствия личинок личинок микозы. Изолируйте энтомопатогенный гриб, вырезая споры из спорообразующих трупов на селективной среде.
- Получив чистые культуры, перенесите изоляты на укороченные картофельные декстрозные агары (PDA) и инкубируйте при 28 ° С и 70-80% относительной влажности в течение 7 дней, чтобы обеспечить споруляцию. После споруляции поддерживайте материнские культуры при 8 ° C до использования.
2. Идентификация энтомопатогенных грибов
- Определить энтомопатогенные грибы, наблюдая морфологические характеристики ( т. Е. Асексуальный размер и форму споры и расположение споров на конидиеносах); Изоляты 3 основных родов, Metarhizium , Beauv Eria и Nomuraea , могут быть идентифицированы.
- Для молекулярной идентификации штаммов Metarhizium выведите геномную ДНК из мицелиальной биомассы с использованием набора для выделения ДНК; Следуйте инструкциям производителя (см. Таблицу материалов ). Проверьте качество геномной ДНК, выполнив электрофорез на 0,8% агарозном геле.
- ПЦР-амплифицируют область ITS1-5.8S-ITS2 и 26S рДНК. Используйте геномную ДНК в качестве шаблона с праймерами ITS1 forward (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) и ITS4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 10 .
- Гель-элюат и очистка ампликонов ожидаемого размера с использованием набора для экстракции гелем; Следуйте инструкциям производителя (см. Таблицу материалов ). Количественный анализ очищенного ампликона и последовательности.
- Прочитайте и отредактируйте последовательности с помощью программного обеспечения и выполните BLAST-поиск нуклеотидных последовательностей в библиотеке данных NCBI GenBank для анализа близкой гомологии= "Xref"> 11.
- Депонирование последовательностей идентифицированных энтамопатогенных изолятов в базу данных NCBI GenBank для извлечения номеров доступа.
3. Скрининг изолятов метарзиция против H. armigera
- Воспитание насекомых
- Установить первоначальную культуру H. armigera путем сбора здоровых личинок и куколок насекомого с поля.
- Для выращивания выращивайте личинок индивидуально в стерильных пробирках из полипропилена (3,85 х 6,0 см, 50 мл), содержащих куски опара, дезинфицированные 0,5% (об. / Об.) Гипохлоритом натрия в течение 10 мин 12 .
- Соберите яйца насекомых, уложенные во время выращивания и стерилизовать их стерильным раствором 0,5% (об. / Об.) Гипохлорита натрия.
- Поддержание личинок при 25 ± 2 ° C и 65 ± 5% относительной влажности.
- Биоанализ насекомых
Примечание: для биоанализа насекомых производство спор,И исследования на местах, были использованы первые субкультуры штаммов Metarhizium из личинок микоза H. armigera , если не указано иное.- Для биоанализов насекомых используйте личинки III-возрастной группы H. armigera .
- Окуните набор из 30 личинок в трех экземплярах индивидуально в 10-мл спорную суспензию изолятов Metarhizium (1 × 10 7 спор / мл, если не указано иначе, жизнеспособность> 90%) в течение 5 с.
- После лечения переносите каждую личинку индивидуально в отдельный стерильный флакон, чтобы избежать каннибализма. Для каждого флакона добавьте влажную фильтровальную бумагу Whatmann № 1 и кусок дезинфицированной бамии в качестве корма. Измените бумагу и подайте в альтернативные дни.
- Держите личинок при 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% относительной влажности и 16: 8 светлых: темных в течение 14 дней или до тех пор, пока они не умрут.
- Перенесите мертвых личинок на стерильные чашки Петри, содержащие влажные ватные тампоны, и держите их при 28 ° C и относительной влажности 70-80% в течение 3-7 дней, чтобы разрешить мицелию и споруОбразование над трупами.
- Для контроля обработайте набор из 30 личинок в трех повторностях с 0,1% (мас. / Об.) Твин-80 в стерильной дистиллированной воде.
- Проведите весь эксперимент в трех повторностях, используя свежеприготовленные суспензии спор. Собирайте и объедините данные о процентной смертности из трех экспериментов, чтобы получить средние значения. Вычислите скорректированную процентную смертность, используя формулу 13 Abbott's.
- Выполните эксперименты с использованием схемы рандомизированного полного блочного дизайна (RCBD) с каждой обработкой, содержащей набор из 30 личинок в трех экземплярах. Основываясь на процентной смертности от H. armigera , выберите изоляты Metarhizium для дальнейшего скрининга лучшего изолята для коммерческого производства.
- Выделите изоляты, демонстрирующие> 90% смертность от личинок H. armigera III-instar.
Примечание: здесь было выбрано 12 изолятов. - Определите LT 50 этих изолятов и выберите изоляциюРейтинг самого быстрого убийства (за меньшее время).
Примечание: здесь 5 изолятов были выбраны из 12 наиболее сильных изолятов. - Определите значения LC 50 выбранных изолятов с использованием четырех различных концентраций (т.е. 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 и 1 × 10 9 спор / мл) суспензии спор.
- Определите LC 50 изолятов Metarhizium против личинок III-возраста H. armigera, чтобы увеличить вероятность выявления разницы в вирулентности изолятов с высокими значениями смертности, которые могут остаться незамеченными, если используется только одна доза.
4. Производство споров изолята метаризиума для изучения полевых характеристик
- Производство споров Metarhizium SSF
- Для SSF подготовьте инокулят, добавив 2 x 10 7 спор изолятов Metarhizium к200 мл YPG (0,3% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона и 1,0% глюкозы). Инкубируйте колбы при 28 ° C со встряхиванием (180 об / мин) в течение 48 часов.
- Для массового производства спор SSF используйте рис в качестве субстрата, если не указано иное.
- Для SSF заполните автоклавные мешки (тип / 14 с одним фильтром с микрофильтрами 0,5 мкм, 2 кг, 64 × 36 см) с 2 кг риса. Добавить 1000 мл дистиллированной воды в рис в мешках и замочить в течение ночи 14 . Автоклавируйте мешки с пропитанным рисом при 121 ° C в течение 45 минут 15 .
- Выделать мешки с меченым инокулятом 48-часового (10% посевной, 200 мл на 2 кг риса) и инкубировать при 28 ° С и 70-80% относительной влажности в течение 14 дней.
- Убирают споры с помощью жидкостной экстракции с использованием 0,1% Tween-80. Для этого добавьте содержимое мешка в 0,1% Tween-80 (3 л на 1 кг риса), тщательно перемешайте, отделите споры от жидкости центрифугированием и высушите при 37 ° C в течение 2 дней. < / Li>
- Альтернативно, сушат мешки с рисом со спорами и некоторые мицелии при 37 ° C в течение 2 дней для снижения содержания влаги (<20%). Убирайте споры с помощью мико-харвестера или вибросита.
- Исследования жизнеспособности
- Определите процент жизнеспособности собранных спор, используя разные методы. 15 . Для этого подготовьте суспензии спор в 0,1% (мас. / Об.) Tween-80 и отрегулируйте количество до 1 × 10 3 спор / мл.
- Распределить суспензии спор (0,1 мл) на планшеты ПЦР в трех повторностях и инкубировать при 28 ° С и 70-80% относительной влажности в течение 72 часов.
- Вручную подсчитайте изолированные колонии и определите общий жизнеспособный подсчет для соответствующего образца.
- Скорость осаждения споры
- Для однородной дозировки требуется гомогенная суспензия спор; Определяют скорости седиментации споров для изолятов Metarhizium, как описано"Xref"> 16. Проверьте скорость седиментации спор в 0,2 М сульфате аммония и 0,1% Твин-80.
- Отрегулируйте количество суспензии спор до ~ 7 × 10 7 спор / мл, чтобы получить начальную абсорбцию 0,6 при 540 нм. Разрешить кюветам стоять без движения в течение 6 ч для определения спор.
- Запишите поглощение на срок до 6 часов. Выразите скорость осадконакопления в процентах и рассчитайте время, необходимое для осаждения 50% (ST 50 ). Повторите эксперимент трижды, используя свежеприготовленные суспензии спор.
5. Исследования эффективности полетов способности отобранных M. anisopliae изолировать для контроля H. armigera в Pigeon Peas
- Смачивающаяся порошковая композиция M. anisopliae M 34412 спор
- Подготовьте 2,5-5% смачиваемого порошкообразного состава путем смешивания спор с тальком.
- Отрегулируйте окончательный жизнеспособный счет (TVC) на 1 x 10 12 spoRes на кг состава.
- Изучение полевых характеристик M. anisopliae M 34412 спор
- Для исследования эффективности полетов способности отобранного изолята M. anisopliae контролировать заражение H. armigera в голубем, используйте RCBD с четырьмя повторениями.
Примечание: Здесь исполняется в Махатме Фуле Круши Видьяпеет (MPKV), Рахури (19.3927 ° с.ш., 74.6488 ° в.д.). - Используйте две различные составы спрей, масляную композицию спор (5 × 10 12 спор / 3 л дизельного топлива: подсолнечное масло, 7: 3) и водную композицию в Твин-80 (0,1%). Распылите масляную композицию распылителем ультранизкого объема (ULV) (70 мин, 3 л / га) в водной композиции с помощью рюкзачного опрыскивателя (5 × 10 12 споров, 500 л / га).
Примечание. Здесь популяции личинок регистрировали за один день до распыления и через 3 и 7 дней после нанесения каждого спрея на 5 случайно выбранных растений. Общая численность населения составляла tДля статистического анализа был преобразован в квадратный корень из n + 1.- Согласно сельскохозяйственным методам выращивания гороха гороха, первое опрыскивание между 10 и 15 днями после яйцекладки и еще 2 раза с 14-дневным интервалом. Выполните распыление между 16:00 и 18:00 часов IST. Следите за направлением ветра и, при необходимости, используйте тканевые шторы, чтобы избежать дрейфа спор на соседние участки.
- Для сравнения, распылите химические инсектициды с помощью ручного компрессионного рюкзака.
- Определите сохранение инокулята в поле путем сбора личинок H. armigera 0, 3, 5, 7 и 14 дней после распыления.
- Держите этих личинок под наблюдением в течение 14 дней и после смерти, перенесите их в пластиковый флакон, содержащий влажную фильтровальную бумагу. Инкубируйте при 25 ± 2 ° C и 70 ± 10% RH для наблюдения за микозом.
- Определить стойкость посевного материала на популяции личинок на основе р Данные о смертельных исходах личинок, собранных с поля после опрыскивания.
- Оцените полевые исследования на основе процентной эффективности 17 , процентного повреждения пор и процентного дохода 18 .
Примечание: здесь данные для параметров, таких как температура, влажность, скорость ветра (км / ч), солнечный свет (h), осадки (мм), дождливые дни и испарение (мм), были зарегистрированы во время испытания на (Махатма Фуле Круши Видиапеет, Рахури, 19.3927 ° с.ш., 74.6488 ° в.д.).
- Для исследования эффективности полетов способности отобранного изолята M. anisopliae контролировать заражение H. armigera в голубем, используйте RCBD с четырьмя повторениями.
- Программа участия фермеров
- Выберите количество фермеров для демонстрационных испытаний. Поставка семян гороха голуби (BSMR - 736) вместе с удобрениями для фермеров.
Примечание. В этом исследовании участвовали 20 фермеров. Деревня: Деолала Правара, (19.473 ° с.ш. 74.6 ° з. Д.). - Используйте те же составы спрей и количество спреев, как на этапе 5.2.
- Выберите количество фермеров для демонстрационных испытаний. Поставка семян гороха голуби (BSMR - 736) вместе с удобрениями для фермеров.
- Наблюдайте действие спрея mycoinsecticide, если таковое имеется, на листья говядины.
- Собирайте почвенных обитающих членистоногих и населяющих листьев насекомых через 1 день после каждой обработки на необработанных участках и на участках, обработанных M. anisopliae .
- Собирайте почвенные членистоногие ловушками с ловушками ловушки в течение 24 часов после обработки и собирайте насекомых, населяющих листья, сетчатой сеткой утром после обработки ( т. Е. Примерно через 15-18 часов после обработки).
- Держите их отдельно в цилиндрических пластиковых коробках диаметром 3,5 см и высотой 4,0 см. Ежедневно проверяйте насекомых на наличие инфекции и кормите их подходящей пищей.
- Запишите присутствие M. anisopliae , если вообще, и выделите гриб.
7. Идентификация параметров контроля качества
- Проверьте жизнеспособность спор, измеряя прорастание спор на КПК при 28 °; С.
- Измерьте активность ферментов, ухудшающих кутикулу, такие как хитиназа, хитин деацетилаза, хитозаназа, протеаза и липаза, полученные в средах YPG и хитина, как описано ранее 15 .
- Определите процентную смертность H. armigera в лабораторном биоанализе 15 .
- Используйте молекулярные маркеры, такие как PCR-RFLP-образец генов хитиназ ( Chit 1 , 2 и 4 ) и протеазы ( Pr1A ), как атрибуты вирулентности для M. anisopliae .
- Извлеките геномную ДНК из биомассы мицелия с помощью набора для изоляции ДНК 15 . ПЦР-амплифицируют фрагменты гена Chit1 и Chit2 с использованием геномной ДНК в качестве матрицы с праймерными парами Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) и Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Для Chit4 используйте пару праймеров Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG),
- Для амплификации гена Pr1A используйте пару праймеров METPR2 и METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Выполните рестрикционную обработку 19 гена Chit1 с BsaJI, BstUI и ScrFI; гена Chit2 с AluI, HpyCH4IV и HpyCH4V, и гена Chit4 с BstUI, HaeIII и MboI. Для переваривания гена Pr1A используйте RsaI , DdeI и MspI 20 .
- Соблюдайте шаблон полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) на 1,5% агарозном геле путем электрофореза для каждого гена для большинства вирулентных штаммов (> 90% смертности); Это может быть использовано как маркер вирулентности для отбора M. anisopliae .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В ходе исследований различные штаммы Metarhizium, Beauveria и Nomuraea были изолированы различными методами изоляции (данные не показаны) 6 , 14. Было обнаружено, что штаммы Metarhizium более эффективны при контроле H. armigera , ужасного вредителя в импульсах 6 , 14 , Дальнейшие выделения были нацелены на выделение штаммов Metarhizium из разных полей сельскохозяйственных культур и насекомых ( таблица 1 ). В общей сложности 68 изолятов из метакризиума были идентифицированы по культурным и морфологическим характеристикам и секвенированием ITS 1-5.8S-ITS 4. Основываясь на> 90% -ной смертности H. armigera в лабораторных биоанализах, 12 изолятов Metarhizium были дополнительно проверены на производство спор, жизнеспособность, LC 50 , LT 50 и ST 50 . Таблица 2 описывает данныеДля 3 потенциальных изолятов, M34311, M34412 и M81123; Было обнаружено, что M34412 является наиболее эффективным изолятом.
Среди тестируемых субстратов, таких как рис, сорго, кукуруза и пшеница, риса поддерживали максимальную споруляцию в случае изолятов Metarhizium (60-75 г спор / кг, 4-4,4 × 10 10 спор / г порошка споры) ,
Во время полевого испытания для контроля H. armigera в говяжьем горохе, 78,0% и 70,9% эффективности были получены с маслом M. anisopliae M34412 и водными препаратами соответственно . Было обнаружено, что повреждение стручка в обработанных M. anisopliae участках было меньше (8,76%), чем на необработанных контрольных участках (23,63%) и химически обработанных участках (10,24%). Средний выход (q / га) в необработанном контроле составил 7,31 ц / га, что было меньше, чем после обработки M. anisopliae M34412 (14,04 ц / га). Обработка химическим веществом давала выход 12,78 ц / га ( таблица 3 ),
Наблюдения, зарегистрированные для симптомов фитотоксичности, показали, что никакие обработки не показали фитотоксический эффект на культуру гороха после 3 брызг препарата M. anisopliae . Из 57 собранных почвенных членистоногих (полевые сверчки и пауки) ни один из них не был инфицирован. Из 590 собранных навесов, обитающих членистоногих, было обнаружено, что два человека порядка Heteroptera (= 0,3% собранных членистоногих) инфицированы M. anisopliae ( табл. 4 ). Ни пауки, ни коккинеллиды не поддались грибу.
| Почва (58 изолятов) | ||
| Изолировать № | урожай | Количество изолятов |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Помидор | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Заварное яблоко | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Сахарный тростник | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | баклажан | 12 |
| M51118, M51219 | окра | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Голубь горох | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Нут | 4 |
| M183365 | Хлопок | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Хозяин насекомого (10) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Голубь из говядины | 5 |
| M16154, M16760 | Мука из сахарного тростника | 2 |
| M16861 | Сахарный тростник | 1 |
| M16962 | Sugarcane-жук | 1 |
| M161063 | Sugarcane-Pyrilla perpussila | 1 |
Таблица 1. Происхождение штаммов Metarhizium . 68 штаммов Metarhizium были выделены из разных полей сельскохозяйственных культур (58 штаммов) и зараженных насекомыми из полей урожая (10 штаммов).
| изолировать | Выход (г / кг риса) | Жизнеспособность (%) | LC 50 (× 103 спор / мл) | LT 50 (дней) | Смертность (%) | |
| Среднее ± SD | Среднее ± SD | (Фидуциальный предел) | (Фидуциальный предел) | (Фидуциальный предел) | ||
| M34311 | 60.00 ± 2.64a | 92,00 ± 2.64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67,00 ± 3.46b | 97,00 ± 1.73a | 2,3 (2.11-2.52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96,67 |
| M81123 | 75.00 ± 3.60c | 93,00 ± 1.73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5.7 (1.2-26.7) | 3,3 (3,1-3,6) | 95,56 |
| Числа, за которыми следует одна и та же буква в столбце, не отличаются статистически. | ||||||
| ST 50 , время, необходимое для осаждения 50% спор в 0,1% (мас. / Об.) Твин 80. | ||||||
| Числа, за которыми следует одна и та же буква в столбце, не отличаются статистически. SD, стандартное отклонение. T80, Tween 80 (0,1%, масса / объем). | ||||||
| LC 50 , медианная летальная концентрация спор, рассчитанная на 50% смертность H. armigera через 14 дней. | ||||||
| LT 50 , среднее летальное время спор, рассчитанное на 50% смертность H. armigera . | ||||||
Таблица 2. Выбор трех лучших изолятов Metarhizium . H. armigera 3- го рода.
| Полевое испытание $ | ||
| лечение | % Эффективность * | Доход (кв / га) |
| Водный M. anisopliae M34412 (5x10 12 спор / га) 500 л | 70,93 ± 4,19 | 14,04 |
| Состав масла ( M. anisopliae ) (5x10 12 спор / га) 3 л | 78,02 ± 4,61 | 15,53 |
| Практика химических пестицидов / фермеров (2 мл / л, 500 л / га) | 63,43 ± 0,85 | 12,78 |
| Необработанный контроль | - | 7,31 |
| Демонстрационная пробная версия в (Программа участия фермеров) $$ | ||
| лечение | % Pod повреждение | Доход (кв / га) |
| Водная композиция ( M. anisopliae ); Площадь 4,2 га | 15,9 ± 1,26 | 10,75 |
| Состав масла ( M. anisopliae ); Площадь 0,4 га | 17,74 | 12,5 |
| Практика фермеров; Площадь 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Орошаемая культура | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * После Хендерсона и Тилтона (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nucleopolyhedrovirus | ||
| $$ NКоличество фермеров, участвовавших в демонстрационных испытаниях, составляло 20. Семена гороха голубя (BSMR - 736) поставлялись вместе с удобрениями фермерам. Деревня: Деолала Правара, Тал. Рахурьте. Dist. А'Нагар (MS) (19,473 ° С, 74,6 ° С) | ||
Таблица 3. Полевые характеристики штамма M. anosopliae (M34412) против H. armigera . Эффективность различных составов M. anisopiae сравнивалась с химическими пестицидными препаратами против заражения H. armigera в говяжьем горохе в полевых условиях.
| параметр | Поле 1 | Поле 2 | Поле 3 |
| Размер участка (м) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| Реплики | 2 | 2 | 2 |
| # Проверено членистоногие из ловушек ловушки | 20 | 22 | 15 |
| % Инфицированных M. anisopliae (ловушки ловушки) | Северная Дакота | Северная Дакота | Северная Дакота |
| # Проверено членистоногие из коллекции чистых сетей | 193 | 171 | 226 |
| % Заражено M. anisopliae (коллекция чистых сетей) | Северная Дакота | Северная Дакота | 0.9 |
| ND, не обнаружено Поле 1, Сельскохозяйственный колледж, Пуна; Поле 2, НПО 1, Тулапур, Пуна; Поле 3, НПО 2, Ааланди, Пуна. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В 1880-х годах была сделана первая попытка использовать Metarhizium для борьбы с жуком-скарабеем Anisoplia austriaca и куркулией сахарной свеклы Cleonis punctiventris 21 . В этом протоколе одним из предварительных условий было выделение вирулентного штамма либо из почвы, либо из зараженных насекомых. Действительно, другие параметры, такие как LC 50 , LT 50 и ST 50 , значительно способствовали экономической эффективности продукта 22 , 23 . Для оптимизации производства споры сохранялся тонкий баланс между количеством спор, жизнеспособностью и вирулентностью 24 .
Поскольку сельское хозяйство является продуктом с большим объемом и низкой стоимостью, основными проблемами являются восприятие качества, приемлемость конечных пользователей и срок хранения спор. Специфика хозяина выгодна для предотвращения нецелевых эффектов= "Xref"> 14. Уклонение от повторной субкультуры на искусственной среде и случайный проход через хозяина насекомого поддерживало вирулентность и эффективность споров Metarhizium в области 22 . Представленный подход имеет свои ограничения: препарат более эффективен, когда экономический пороговый уровень составляет 2-3 личинок на растение, а всхожесть споры достигает максимума при высокой влажности и относительно низких температурах.
Здесь грибковый препарат эффективен после контакта, тогда как бактериальные (Bt) и вирусные препараты (-HaNPV) эффективны только при переваривании. Что касается параметров контроля качества, то в дополнение к жизнеспособности споров впервые было высказано предположение, что биохимические и молекулярные маркеры, основанные на активности разлагающихся кутикулы ферментов и специфических структур рестрикционного расщепления одних и тех же генов фермента, могут обеспечить эффективность в поле. Качество-contrОла: (а) жизнеспособность спор, измеренная как прорастание споры (должно быть> 90% на КПК через 16 ч при 28 ° С и 70-80% относительной влажности); (B) процентная смертность H. armigera (должна составлять> 90%, с 1 x 10 7 спор в лабораторном биоанализе); (C) активность хитиназы в хитиновой среде через 72 часа (должна составлять> 3,5 · 10 -3 U / мл); И (d) образец ПЦР-RFLP генов хитиназы. В этой рукописи по существу описаны протоколы, от выделения энтомопатогенного гриба до генерации данных эффективности против целевого вредителя в поле. Это одна из предпосылок для регистрации любой рецептуры биопестицида с Центральным советом по инсектицидам Индии и, в конечном счете, для коммерциализации.
Ряд экспериментов, подробно описанных здесь, будет полезен для разработки потенциального микоинсектицида. Кроме того, после извлечения спор, биомасса мусора мишени может быть использована дляСтимулирования роста растений или для выделения хитозановых или глюкозамин-полимеров для применения в здравоохранении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают вклад сотрудников из программы Индо-швейцарского сотрудничества в области биотехнологии (ISCB) Департамента биотехнологии, Дели и Швейцарского агентства по развитию и сотрудничеству, Берн, Швейцария. Признаны вклад студентов и сотрудников проекта, участвующих в разработке микоинсектицидов, в том числе Вандана Гормаде, Паллави Нахар, Прия Ядав, Шуклангби Кулкарни, Маниша Капур, Сантош Чаван, Равиндра Видхате, Шамала Мане и Абхиджит Ланде. EKP и SGT выражают благодарность Комиссии университетов по грантам, Индии и Совету научных и промышленных исследований (CSIR), соответственно, за научные стипендии. МВД признает поддержку Совета промышленных и научных исследований, Нью-Дели для программы «Заслуженный ученый». Авторы благодарны Департаменту биотехнологии, Нью-Дели, Индия за финансовую поддержку в рамках программ ISCB и SBIRI. Мы благодарныРецензентов за их вклад.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
