Summary
Hier berichten wir über die verschiedenen Phasen der wissensbasierten Entwicklung eines wirksamen Mycoinsektizids, einschließlich der Isolierung, Identifizierung, Screening und Auswahl des "best-fit" entomopathogenen Pilzes, Metarhizium anisopliae , zur Bekämpfung von Insektenschädlingen in der Landwirtschaft .
Abstract
Ein wichtiges Anliegen bei der Entwicklung von kommerziellen Mycoinsektiziden ist die Abtötungsgeschwindigkeit im Vergleich zu der von chemischen Insektiziden. Daher sind Isolation und Screening für die Auswahl eines schnell wirkenden, hochgradig virulenten entomopathogenen Pilzes wichtige Schritte. Entomopathogene Pilze wie Metarhizium, Beauveria und Nomurea , die durch Kontakt wirken, eignen sich besser als Bacillus thuringiensis oder Nukleopolyhedrosis Virus (NPV), die von der Insektenschädlinge eingenommen werden müssen. In der vorliegenden Arbeit isolierten wir 68 Metarhiziumstämme von infizierten Insekten unter Verwendung einer Bodenverdünnung und Ködermethode. Die Isolate wurden durch die Amplifikation und Sequenzierung der ITS1-5.8S-ITS2- und 26S-rDNA-Region identifiziert. Der am meisten virulenten Stamm von Metarhizium anisopliae wurde basierend auf der medianen letalen Konzentration (LC 50 ) und der Zeit (LT 50 ), die in Insekten-Bioassays gegen III-Instar-Larven von Helicoverpa armigera erhalten wurde, ausgewählt.Die Massenproduktion von Sporen durch den ausgewählten Stamm wurde mit Festkörperfermentation (SSF) unter Verwendung von Reis als Substrat für 14 Tage durchgeführt. Sporen wurden aus der sporulierten Biomasse mit 0,1% Tween-80 extrahiert und verschiedene Formulierungen der Sporen wurden hergestellt. Feldversuche der Formulierungen zur Kontrolle eines H. armigera- Befalles in Taubenerbsen wurden durch randomisierte Blockgestaltung durchgeführt. Die mit Öl und wässrigen Formulierungen erhaltenen Befallkontrollniveaus (78,0% bzw. 70,9%) waren besser als die mit chemischen Pestiziden erhaltenen 63,4%
Introduction
Von der Einführung von Organochlor-Pestiziden in den 1940er Jahren in Indien hat die Verwendung von Pestiziden viele Falten 1 , mit Ernte-Schädlinge noch kostet Milliarden von Rupien 2 jährlich in Bezug auf Ertragsverlust in der landwirtschaftlichen Produktion. Die weit verbreitete und nicht-vernünftige Verwendung von synthetischen Pestiziden ist eine kontinuierliche Bedrohung für die Umwelt und die menschliche Gesundheit 1 . Die wahllose Verwendung von Pestiziden führt zu Rückständen im Boden und zur Erschöpfung von natürlichen Schädlingsbekämpfern. Es dient auch als ein mächtiger Selektionsdruck für die Veränderung der genetischen Make-up einer Schädlingsbevölkerung, was zur Entwicklung des Widerstandes 1 führt . Trotz der enormen Vorteile der grünen Revolution, die hohe Inputs wie Dünger und Pestizide benötigte, sind Schädlinge weiterhin ein wichtiger biotischer Zwang. Eine allgemeine Schätzung der jährlichen Ernteverluste in Indien und weltweit beträgt 12 Mrd. USDEf "> 2 und USD 2.000 Mrd. 3 .
Wenn chemische Pestizide bei der Bekämpfung von Insektenschädlingen schädliche Wirkungen haben, wird es zwingend erforderlich, nach alternativen Methoden zu suchen, die ökologisch sinnvoll, zuverlässig, wirtschaftlich und nachhaltig sind. Die biologische Kontrolle bietet eine geeignete Alternative und beinhaltet die Verwendung von Parasiten, Raubtieren und mikrobiellen Pathogenen 4 . Pilze sind zum Beispiel bekannt, um eine breite Palette von Insektenschädlingen zu infizieren, darunter Lepidopterane, Hymenopterane, Coleopterane und Dipterane, die oft zu natürlichen Tierseuchen führen. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu anderen bakteriellen und viralen Insektenbekämpfungsmitteln die Wirkungsweise von insektenpathogenen Pilzen durch Kontakt 5 . Diese Pilze umfassen eine heterogene Gruppe von über 100 Gattungen, wobei etwa 750 Arten unter verschiedenen Insekten berichtet werden. Die bedeutenden Pilzpathogene sind: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii und Hirsutella sp., um nur einige zu nennen 6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin ist der zweithäufigste entomopathogene Pilz in der Biokontrolle. Es ist bekannt, über 200 Arten von Insekten anzugreifen 7 .
In dieser Studie werden verschiedene Stufen der wissensbasierten Entwicklung eines Mycopesticids mit M. anisopliae vorgestellt. Dazu gehören: 1) die Identifizierung einer Quelle ( dh entweder Boden oder mykosierte Insekten) für virulenten Entomopathogene, 2) Entomopathogenidentifizierung und Selektion, 3) Strategien zur Aufrechterhaltung ihrer virulenten Natur und Wirksamkeit im Labor-Bioassay und im Feld, 4 ) Die kostengünstige Formulierung von infektiösen Propagulen, 5) die Entwicklung von einzigartigen Qualitätskontrollparametern für die virulente Präparation und 6) Bioprospektation und Wertschöpfung.
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Protocol
1. Isolierung von entomopathogenen Pilzen
- Bodenverdünnungsmethode
- Sammeln Sie die Bodenproben und mycosed Insekten aus verschiedenen Erntefeldern ( Tabelle 1 ). Isolieren Sie die entomopathogenen Pilze aus Bodenproben mit dem Bodenverdünnungs-Plattierungsverfahren 8 .
Anmerkung: In dieser Studie wurden Proben von der Pune (18 ° 31'13''N; 73 ° 51'24''E) und Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E gesammelt ) Bezirke, Maharashtra, Indien. - 10 g jeder Bodenprobe wiegen und separat zu 90 ml sterilem 0,1% (w / v) Tween-80 zugeben.
- Die Proben mit einem Magnetrührer für 60 min sorgfältig vermischen, um die an den Bodenpartikeln haftenden Sporen freizusetzen.
- Nach dem Mischen verteilen sich 100 bis 200 & mgr; l Aliquots von jeder Probe auf selektives Medium, enthaltend (g / l): Pepton, 10; Glukose, 20; Agar, 18; Streptomycin, 0,6; Tetracyclin, 0,05; CycLohexamid, 0,05; Und dodin, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Inkubieren Sie die Platten bei 28 ° C für 3-7 Tage.
- Selektieren und subkulturieren die einzelnen sporulierenden Kolonien auf demselben Medium, um reine Kulturen zu erhalten.
- Sammeln Sie die Bodenproben und mycosed Insekten aus verschiedenen Erntefeldern ( Tabelle 1 ). Isolieren Sie die entomopathogenen Pilze aus Bodenproben mit dem Bodenverdünnungs-Plattierungsverfahren 8 .
- Von mycosed Insekten
- Sammle die myzosierten Insekten aus dem Feld.
Anmerkung: Ein schwerer Larvenkörper wird wahrscheinlich mit entomopathogenem Pilz infiziert. Bei bakterieller oder viraler Infektion ist der tote Insektenkörper weich. - Sammle lebende Insekten mit abnormalem Verhalten, schlechter Koordination und ruckartigen Bewegungen.
- Halten Sie die Insekten bis zum Tode und übertragen Sie sie dann in feuchten Kammern für weitere Mykosen und Sporulation, wenn überhaupt, bei 28 ° C und 70-80% RH.
- Streifen Sie die Sporen aus den sporulierenden Kadavern auf das oben genannte selektive Medium und erhalten Sie reine Kulturen durch weitere Subkultivierung 2-3 mal auf dem gleichen Medium.
- Sammle die myzosierten Insekten aus dem Feld.
- Ködermethode
- In einemDurchstechflasche (3,85 x 6,0 cm) mit 60 g Bodenprobe, fügen Sie 4-reis-Motten-Larven ( Corcyra cephalonica ) hinzu und halten Sie die Durchstechflaschen bei 25 ± 2 ° C für einen Zeitraum von 14 Tagen.
- Drehen Sie die Fläschchen jeden Tag auf den Kopf. Nach 14 Tagen die Bodenproben auf das Vorhandensein von mycosed Reis-Mottenlarven abschirmen. Isolieren Sie den entomopathogenen Pilz durch Streifen von Sporen aus sporulierenden Kadavern auf selektivem Medium.
- Nach dem Erhalten von Reinkulturen die Isolate auf Kartoffeldextrose-Agar (PDA) schräg stellen und bei 28 ° C und 70-80% RH für 7 Tage inkubieren, um eine Sporulation zu ermöglichen. Nach der Sporulation die Mutterkulturen bei 8 ° C bis zur Anwendung aufrechterhalten.
2. Identifizierung von entomopathogenen Pilzen
- Identifizieren Sie entomopathogene Pilze, indem Sie morphologische Merkmale beobachten ( dh asexuelle Sporengröße und Form und die Anordnung der Sporen auf Conidiophoren); Isoliert von 3 Hauptgattungen, Metarhizium , Beauv Eria und Nomuraea identifiziert werden können.
- Zur molekularen Identifizierung von Metarhizium- Stämmen wird die genomische DNA aus der Myzel-Biomasse unter Verwendung eines DNA-Isolationskits extrahiert; Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien ). Überprüfen Sie die Qualität der genomischen DNA durch Durchführung der Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel.
- PCR-amplifizieren die ITS1-5.8S-ITS2 und 26S rDNA Region. Verwenden Sie genomische DNA als Vorlage, mit ITS1 forward (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) und ITS4 Reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Primer 10 .
- Gel-eluieren und die erwarteten Amplikons unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits reinigen; Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien ). Quantifizieren Sie das gereinigte Amplikon und die Sequenz.
- Lesen und bearbeiten Sie die Sequenzen mit der Software und führen Sie eine BLAST-Suche der Nukleotidsequenzen in der NCBI GenBank-Datenbibliothek aus, um die enge Homologie zu analysieren= "Xref"> 11.
- Hinterlegung der Sequenzen von identifizierten entamopathogenen Isolaten an die NCBI GenBank Datenbank, um die Zugangsnummern abzurufen.
3. Screening von Metarhizium- Isolaten gegen H. armigera
- Insektenaufzucht
- Stellen Sie die erste Kultur von H. armigera her, indem Sie gesunde Larven und Puppen des Insekts aus dem Feld sammeln.
- Für die Aufzucht, wachsen die Larven einzeln in sterilen Polypropylen-Durchstechflaschen (3,85 x 6,0 cm, 50-ml-Kapazität), die Stücke von Okra enthalten, die mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit für 10 min 12 desinfiziert wurden.
- Sammeln Sie die Insekteneier, die während der Aufzucht aufgelegt wurden, und oberflächensterilisieren sie mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit.
- Halten Sie die Larven bei 25 ± 2 ° C und 65 ± 5% RH.
- Insekten-Bioassay
Hinweis: Für den Insekten-Bioassay, die Herstellung von Sporen,Und Feldleistungsstudien wurden die ersten Subkulturen von Metarhizium- Stämmen aus mycosed H. armigera- Larven verwendet, sofern nicht anders angegeben.- Für die Insekten-Bioassays verwenden Sie III-Instar-Larven von H. armigera .
- Tauchen Sie einen Satz von 30 Larven einzeln in eine 10-ml-Sporensuspension von Metarhizium- Isolaten (1 x 10 7 Sporen / ml, sofern nicht anders angegeben, Lebensfähigkeit> 90%) für 5 s.
- Nach der Behandlung jede Larve einzeln in eine separate, sterile Durchstechflasche geben, um einen Kannibalismus zu vermeiden. Zu jeder Durchstechflasche fügen Sie feuchtes Whatmann-Filterpapier Nr. 1 und ein Stück desinfizierten Okra als Futter hinzu. Ändern Sie das Papier und füttern Sie an wechselnden Tagen.
- Halten Sie die Larven bei 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH und 16: 8 Licht: dunkel für 14 Tage oder bis sie sterben.
- Übertragen Sie die toten Larven auf sterile Petrischalen, die feuchte Wattestäbchen enthalten und halten sie bei 28 ° C und 70-80% RH für 3-7 Tage, um Myzelien und Sporen zu ermöglichenBildung über die Kadaver.
- Für eine Kontrolle, behandeln Sie einen Satz von 30 Larven in dreifacher Ausfertigung mit 0,1% (w / v) Tween-80 in sterilem destilliertem Wasser.
- Führen Sie alle Experimente in dreifacher Ausfertigung mit frisch zubereiteten Sporensuspensionen durch. Sammeln und bündeln Sie die Daten über die prozentuale Mortalität aus drei Experimenten, um Durchschnittswerte zu erhalten. Berechnen Sie die korrigierte prozentuale Mortalität mit Abbott's Formel 13 .
- Führen Sie die Experimente mit einem randomisierten kompletten Block Design (RCBD) Layout, mit jeder Behandlung mit einem Satz von 30 Larven in dreifacher Ausfertigung. Basierend auf prozentualer Mortalität gegen H. armigera , wählen Sie Metarhizium- Isolate für die weitere Screening der besten Isolat für kommerzielle Produktion.
- Wählen Sie die Isolate, die> 90% Mortalität gegen H. armigera III-instar Larven demonstrieren.
Anmerkung: Hier wurden 12 Isolate ausgewählt. - Bestimmen Sie die LT 50 dieser Isolate und wählen Sie die Isolate demonstrierenBewertung der schnellsten Tötung (in kürzerer Zeit).
Anmerkung: Hier wurden 5 Isolate aus den 12 stärksten Isolaten ausgewählt. - Bestimmen Sie die LC 50 -Werte der ausgewählten Isolate mit vier verschiedenen Konzentrationen (dh 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 und 1 × 10 9 Sporen / ml) der Sporensuspension.
- Bestimmen Sie die LC 50 der Metarhizium- Isolate gegen III-Instar-Larven von H. armigera , um die Möglichkeit zu erkennen, den Unterschied in der Virulenz von Isolaten mit hohen Mortalitätswerten zu identifizieren, die unentdeckt werden könnten, wenn nur eine einzige Dosis verwendet wird.
4. Herstellung von Sporen eines Metarhizium- Isolats für Feldleistungsstudien
- Herstellung von Metarhiziumsporen durch SSF
- Für SSF, bereiten Sie das Inokulum durch Zugabe von 2 x 10 7 Sporen der Metarhizium- Isolate zu200 ml YPG (0,3% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 1,0%, Glucose) Medium. Inkubieren Sie die Kolben bei 28 ° C unter Schütteln (180 U / min) für 48 h.
- Für die Massenproduktion von Sporen durch SSF, verwenden Sie Reis als Substrat, wenn nicht anders angegeben.
- Für SSF füllen Sie Autoklavenbeutel (Typ / 14 mit einem einzigen Mikrofiltfilter von 0,5 μm, 2 kg Fassungsvermögen, 64 × 36 cm) mit 2 kg Reis. Füge 1.000 ml destilliertes Wasser dem Reis in die Säcke hinzu und über Nacht einweichen 14 . Autoklavieren Sie die Beutel mit dem getränkten Reis bei 121 ° C für 45 min 15 .
- Inokulieren Sie die Beutel mit 48-h-altem Myzel-Inokulum (10% Inokulum, 200 ml für 2 kg Reis) und inkubieren bei 28 ° C und 70-80% RH für 14 Tage.
- Ernte die Sporen durch Flüssigkeitsextraktion mit 0,1% Tween-80. Dazu fügen Sie den Inhalt des Beutels zu 0,1% Tween-80 (3 L pro 1 kg Reis) hinzu, mischen gründlich, trennen die Sporen aus der Flüssigkeit durch Zentrifugation und trocknen bei 37 ° C für 2 Tage / Li>
- Alternativ trocknen Sie die Beutel mit Reis mit den Sporen und einigen Myzelien bei 37 ° C für 2 Tage, um den Feuchtigkeitsgehalt zu reduzieren (<20%). Ernten Sie die Sporen mit einem Mähdrescher oder Vibro-Sichter.
- Lebensfähigkeit Studien
- Bestimmen Sie die prozentuale Lebensfähigkeit der geernteten Sporen mit verschiedenen Methoden 15 . Dazu werden die Sporensuspensionen in 0,1% (w / v) Tween-80 vorbereitet und die Anzahl auf 1 × 10 3 Sporen / ml eingestellt.
- Die Sporensuspensionen (0,1 ml) auf die PDA-Platten dreifach verteilen und bei 28 ° C und 70-80% RH für 72 h inkubieren.
- Manuell die isolierten Kolonien zählen und die gesamte lebensfähige Anzahl für die jeweilige Probe bestimmen.
- Sporen-Sedimentationsrate
- Für eine einheitliche Dosierung ist die homogene Sporensuspension erforderlich; Bestimmen die Sporen-Sedimentationsraten für Metarhizium- Isolate wie beschrieben"Xref"> 16 Überprüfen Sie die Sedimentationsraten von Sporen in 0,2 M Ammoniumsulfat und 0,1% Tween-80.
- Stellen Sie die Anzahl der Sporensuspension auf ~ 7 × 10 7 Sporen / ml ein, um eine anfängliche Extinktion von 0,6 bei 540 nm zu erhalten. Lassen Sie die Küvetten für 6 Stunden ungestört stehen, damit sich die Sporen absetzen können.
- Die Extinktion bis zu 6 h aufnehmen. Drücken Sie die Sedimentationsrate in Prozent aus und berechnen Sie die für 50% Sedimentation benötigte Zeit (ST 50 ). Wiederholen Sie das Experiment dreimal mit frisch zubereiteten Sporensuspensionen.
5. Feld-Performance-Studien über die Fähigkeit der ausgewählten M. anisopliae isolieren, um H. armigera in Taubenerbsen zu kontrollieren
- Benetzbare Pulverformulierung von M. anisopliae M 34412 Sporen
- Vorbereitung der 2,5-5% benetzbaren Pulverformulierung durch Mischen der Sporen mit Talk.
- Passen Sie die endgültige Vitalzahl (TVC) auf 1 x 10 12 Spo anRes pro kg Formulierung
- Feldleistungsstudien von M. anisopliae M 34412 Sporen
- Für Feldleistungsstudien über die Fähigkeit des ausgewählten M. anisopliae- Isolats, H. armigera- Befall in Taubenerbsen zu kontrollieren, verwenden Sie eine RCBD mit vier Replikationen.
Anmerkung: Hier bei Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E) durchgeführt. - Verwenden Sie zwei verschiedene Sprühformulierungen, eine Ölformulierung von Sporen (5 x 10 12 Sporen / 3 L Diesel: Sonnenblumenöl, 7: 3) und eine wässrige Formulierung in Tween-80 (0,1%). Die Ölformulierung mit einem Ultra-Low-Volumen (ULV) Spray (70 min; 3 L / ha) die wässrige Formulierung mit einem Rucksacksprüher (5 x 10 12 Sporen, 500 l / ha) aufsprühen.
Anmerkung: Hier wurden die Larvenpopulationen einen Tag vor dem Spray aufgezeichnet und 3 und 7 Tage nach dem Auftragen jedes Sprays auf 5 zufällig ausgewählte Pflanzen. Die Gesamtbevölkerung war tFür die statistische Analyse zur Quadratwurzel von n + 1 geleitet.- Nach landwirtschaftlichen Praktiken für die Tauben Erbsen Ernte, führen Sie die erste Sprühen zwischen 10 und 15 d nach Ei Verlegung und 2 weitere Male mit einem 14-Tage-Intervall. Führen Sie das Sprühen zwischen 16:00 und 18:00 h IST durch. Überwachen Sie die Windrichtung und verwenden Sie ggf. Tuchvorhänge, um das Spritzen von Sporen zu den benachbarten Parzellen zu vermeiden.
- Zum Vergleich die chemischen Insektizide mit einem Hand-Kompressions-Rucksack Spray sprühen.
- Bestimmen Sie die Beharrlichkeit des Inokulums auf dem Feld durch das Sammeln von H. armigera Larven 0, 3, 5, 7 und 14 Tage nach dem Sprühen.
- Halten Sie diese Larven unter Beobachtung für einen Zeitraum von 14 Tagen und nach dem Tod, übertragen Sie sie in eine Plastikfläschchen mit feuchtem Filterpapier. Inkubieren bei 25 ± 2 ° C und 70 ± 10% RH zur Beobachtung der Mykose.
- Bestimmen Sie die Beharrlichkeit des Inokulums auf der Larvenpopulation auf der Grundlage der p Ering-Mortalitätsdaten der nach dem Sprühen aus dem Feld gesammelten Larven
- Bewerten Sie die Feldstudien auf der Basis der prozentualen Wirksamkeit 17 , Prozent Pod Schaden und Prozent Ausbeute 18 .
Anmerkung: Hier wurden die Daten für die Parameter wie Temperatur, Feuchtigkeit, Windgeschwindigkeit (km / h), Sonnenschein (h), Niederschlag (mm), Regentage und Verdunstung (mm) während eines Versuches bei einem Landwirtschaft Universität (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- Für Feldleistungsstudien über die Fähigkeit des ausgewählten M. anisopliae- Isolats, H. armigera- Befall in Taubenerbsen zu kontrollieren, verwenden Sie eine RCBD mit vier Replikationen.
- Das partizipative Programm der Landwirte
- Wählen Sie die Anzahl der Landwirte für die Demonstrationsversuche aus. Versorgung der Tauben Erbsensamen (BSMR - 736) zusammen mit Dünger an die Bauern.
Hinweis: In dieser Studie waren 20 Landwirte beteiligt. Dorf: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Verwenden Sie die gleichen Sprühformulierungen und die Anzahl der Sprays wie in Schritt 5.2.
- Wählen Sie die Anzahl der Landwirte für die Demonstrationsversuche aus. Versorgung der Tauben Erbsensamen (BSMR - 736) zusammen mit Dünger an die Bauern.
- Beobachten Sie die Wirkung von Mycoinsektizid Spray, wenn überhaupt, auf die Taube Erbse Blätter.
- Sammeln Sie die Bodenbewohner-Arthropoden und blattbewohnenden Insekten 1 Tag nach jeder Behandlung in den unbehandelten Parzellen und in den mit M. anisoplien behandelten Plots.
- Sammle die Boden-Arthropoden mit Pitfall-Fallen innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung und sammle die blattbewohnenden Insekten mit einem Sweep-Netz am Morgen nach der Behandlung ( dh etwa 15-18 Stunden nach der Behandlung).
- Halten Sie sie einzeln in zylindrischen Plastikboxen mit einem Durchmesser von 3,5 cm und einer Höhe von 4,0 cm. Überprüfen Sie die Insekten täglich auf Infektion und füttern Sie sie mit entsprechender Nahrung.
- Notieren Sie die Anwesenheit von M. anisopliae , wenn überhaupt, und isolieren Sie den Pilz.
7. Identifizierung von Qualitätskontrollparametern
- Überprüfen Sie die Sporenlebensfähigkeit durch Messung der Sporenkeimung auf PDA bei 28 °C;
- Messen Sie abbildende Enzymaktivitäten wie Chitinase, Chitin-Deacetylase, Chitosanase, Protease und Lipase, die im YPG- und Chitin-Medium produziert werden, wie zuvor beschrieben 15 .
- Bestimmen Sie die prozentuale Mortalität von H. armigera in einem Labor-Bioassay 15 .
- Verwenden Sie molekulare Marker, wie ein PCR-RFLP-Muster von Chitinasen ( Chit 1 , 2 und 4 ) und Protease ( Pr1A ) -Gen , als Virulenzattribute für M. anisopliae .
- Extrahiere die genomische DNA aus der Myzelien-Biomasse unter Verwendung eines DNA-Isolationskits 15 . PCR-amplifizieren die Chit1- und Chit2- Genfragmente unter Verwendung genomischer DNA als Matrize mit Primerpaaren Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) und Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Für Chit4 verwenden Sie das Primerpaar Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- Für die Amplifikation des Pr1A-Gens verwenden Sie das METPR2- und METPR5-Primerpaar (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Führen Sie den Restriktionsverdau 19 des Chit1- Gens mit BsaJI , BstUI und ScrFI durch ; Des Chit2- Gens mit AluI , HpyCH4IV und HpyCH4V und des Chit4- Gens mit BstUI , HaeIII und MboI . Für die Verdauung des Pr1A- Gens verwenden Sie RsaI , DdeI und MspI 20 .
- Beobachten Sie das Beschränkungsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) -Muster auf 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese für jedes Gen für die meisten virulenten Stämme (> 90% Mortalität); Dies kann als Virulenzmarker für die Selektion von M. anisopliae verwendet werden .
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Representative Results
Während der Untersuchungen wurden verschiedene Stämme von Metarhizium, Beauveria und Nomuraea durch verschiedene Isolationsmethoden isoliert (Daten nicht gezeigt) 6 , 14 Da Metarhizium- Stämme bei der Kontrolle von H. armigera , einem schrecklichen Schädling in den Hülsen 6 , 14, wirksamer waren Wurden weitere Isolierungen zur Isolierung von Metarhiziumstämmen aus verschiedenen Kulturfeldern und Insekten gezielt ( Tabelle 1 ). Die Summe von 68 erhaltenen Metarhizium- Isolaten wurde durch kulturelle und morphologische Merkmale und durch ITS 1-5.8S-ITS 4-Sequenzierung identifiziert. Basierend auf der> 90% -igen Sterblichkeit von H. armigera in Labor-Bioassays wurden 12 Metarhizium- Isolate weiter auf Sporenproduktion, Lebensfähigkeit, LC 50 , LT 50 und ST 50 getestet. Tabelle 2 beschreibt die DatenFür 3 Potentialisolate, M34311, M34412 und M81123; M34412 wurde als das beste führende Isolat gefunden.
Unter den getesteten Substraten wie Reis, Sorghum, Mais und Weizen stützte der Reis die maximale Sporulation im Falle von Metarhizium- Isolaten (60-75 g Sporen / kg, 4-4,4 x 10 10 Sporen / g Sporenpulver) .
Während des Feldversuchs zur Kontrolle von H. armigera in Taubenerbsen wurden mit dem M. anisopliae M34412-Öl bzw. den wässrigen Formulierungen 78,0% und 70,9% Wirksamkeit erhalten . Die Podschädigung in M. anisoplia- behandelten Plots ergab sich weniger (8,76%) als in den unbehandelten Kontrollplots (23,63%) und den chemisch behandelten Plots (10,24%). Die mittlere Ausbeute (q / ha) bei der unbehandelten Kontrolle betrug 7,31 q / ha, was nach der M. anisopliae M34412-Behandlung (14,04 q / ha) geringer war. Die Behandlung mit Chemikalie ergab eine Ausbeute von 12,78 q / ha ( Tabelle 3 ).
Die Beobachtungen, die für Phytotoxizitätssymptome aufgezeichnet wurden, zeigten, dass keine Behandlungen eine phytotoxische Wirkung auf die Taubenerbsenfrucht nach 3 Sprays von M. anisopliae Formulierung zeigten. Von 57 gesammelten Boden-Arthropoden (Feldgrillen und Spinnen) wurden keine infiziert. Von 590 gesammelten Baldachin-bewohnenden Arthropoden wurden zwei Individuen der Ordnung Heteroptera (= 0,3% der gesammelten Arthropoden) mit M. anisopliae infiziert ( Tabelle 4 ). Weder Spinnen noch Coccinelliden erlag dem Pilz.
| Boden (58 Isolate) | ||
| Isolieren Nr. | Ernte | Anzahl der Isolate |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomate | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Custard Apfel | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Zuckerrohr | 11 |
| M101133, M10134, M101335, M101436, M101537, M101639, M101739, M101840, M101340, M10014, | Brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | Okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Taubenerbsen | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Kichererbse | 4 |
| M183365 | Baumwolle | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Insektenwirt (10 isoliert) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Tauben-Erbsen-fettiger Schnittwurm | 5 |
| M16154, M16760 | Zuckerrohr-mealy Bug | 2 |
| M16861 | Zuckerrohr-weißes grub | 1 |
| M16962 | Zuckerrohrkäfer | 1 |
| M161063 | Zuckerrohr-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabelle 1. Herkunft von Metarhizium- Stämmen. Die 68 Metarhizium- Stämme wurden aus verschiedenen Kulturfeldern (58 Stämme) und mykosierten Insekten aus den Erntefeldern (10 Stämme) isoliert.
| Isolieren | Ausbeute (g / kg Reis) | Lebensfähigkeit (%) | LC 50 (x 103 Sporen / ml) | LT 50 (Tage) | Mortalität (%) | |
| Mittler ± SD | Mittler ± SD | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | ||
| M34311 | 60,00 ± 2,64a | 92,00 ± 2,64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67,00 ± 3,46b | 97,00 ± 1,73a | 2.3 (2.11-2.52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96,67 |
| M81123 | 75,00 ± 3,60c | 93,00 ± 1,73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3.3 (3.1-3.6) | 95,56 |
| Zahlen, die von demselben Buchstaben innerhalb der Spalte gefolgt werden, sind nicht statistisch verschieden. | ||||||
| ST 50 , Zeit für die Sedimentation von 50% Sporen in 0,1% (w / v) Tween 80 erforderlich. | ||||||
| Zahlen, die von demselben Buchstaben innerhalb der Spalte gefolgt werden, sind nicht statistisch verschieden. SD, Standardabweichung. T80, Tween 80 (0,1%, w / v). | ||||||
| LC 50 , die mediane tödliche Konzentration von Sporen berechnet, um 50% Mortalität von H. armigera nach 14 Tagen verursachen. | ||||||
| LT 50 , die mediane tödliche Zeit der Sporen berechnet, um 50% Mortalität von H. armigera verursachen . | ||||||
Tabelle 2. Auswahl von drei leistungsstärksten Metarhizium- Isolaten. H. armigera 3 rd- installar-Larven ausgewählt.
| Feldversuch $ | ||
| Behandlung | % Wirksamkeit * | Ausbeute (q / ha) |
| Wässriges M. anisopliae M34412 (5x 10 12 Sporen / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14.04 |
| Ölformulierung ( M. anisopliae ) (5x 10 12 Sporen / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15.53 |
| Chemische Pestizide / Bauernpraxis (2ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12,78 |
| Unbehandelte Kontrolle | - | 7.31 |
| Demonstrationsversuch in (Landwirtschafts-Teilnahmeprogramm) $$ | ||
| Behandlung | % Podschaden | Ausbeute (q / ha) |
| Wässrige Formulierung ( M. anisopliae ); Fläche 4,2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10,75 |
| Ölformulierung ( M. anisopliae ); Fläche 0,4 ha | 17,74 | 12.5 |
| Landwirte Praxis; Bereich 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Bewässerte Ernte | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Nach Henderson und Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nucleopolyhedrovirus | ||
| $$ NUmber der Landwirte, die an den Demonstrationsversuchen beteiligt waren, waren 20. Die Taubensamen (BSMR - 736) wurden zusammen mit Düngemitteln an die Bauern geliefert. Dorf: Deolali Pravara, Tal. Rahuri Dist. A'Nagar (MS) (19,473 ° N 74,6 ° E) | ||
Tabelle 3. Feldleistung des M. anosopliae (M34412) -Stamm gegen H. armigera . Die Wirksamkeit verschiedener Formulierungen von M. anisopiae wurde mit chemischen Pestizidbehandlungen gegen H. armigera Befall in Taubenerbsen unter Feldbedingungen verglichen.
| Parameter | Feld 1 | Feld 2 | Feld 3 |
| Grundstücksgröße (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| Repliziert | 2 | 2 | 2 |
| # Arthropoden aus Pitfallfallen getestet | 20 | 22 | 15 |
| % Infiziert mit M. anisopliae (Fallstricke) | ND | ND | ND |
| # Arthropoden aus Sweep-Netz-Sammlung getestet | 193 | 171 | 226 |
| % Infiziert mit M. anisopliae (Sweep-Netz-Sammlung) | ND | ND | 0,9 |
| ND, nicht erkannt Feld 1, Landwirtschaftliche Hochschule, Pune; Feld 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Feld 3, NGO 2, Aalandi, Pune. |
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Discussion
Während der 1880er Jahre wurde der erste Versuch unternommen, Metarhizium zu benutzen, um den Skarabäuskäfer, Anisoplia austriaca und die Zuckerrüben curculio, Cleonis punctiventris 21 zu kontrollieren . In diesem Protokoll war eine der Voraussetzungen, einen virulenten Stamm entweder vom Boden oder von infizierten Insekten zu isolieren. Tatsächlich haben andere Parameter wie LC 50 , LT 50 und ST 50 wesentlich zur Kostenwirksamkeit des Produkts 22 , 23 beigetragen. Für die Optimierung der Sporenproduktion wurde eine heikle Balance zwischen der Anzahl der Sporen, der Lebensfähigkeit und der Virulenz beibehalten 24 .
Da die Landwirtschaft ein hochvolumiges Low-Cost-Produkt ist, sind die Qualitätswahrnehmung, die Akzeptanz der Endverbraucher und die Haltbarkeit von Sporen die Hauptanliegen. Host-Spezifität ist vorteilhaft, um Nicht-Ziel-Effekte zu vermeiden= "Xref"> 14 Die Vermeidung von wiederholter Subkultivierung auf künstlichem Medium und die gelegentliche Passage durch den Insektenwirt behielten die Virulenz und Wirksamkeit der Metarhiziumsporen im Feld 22 auf . Der vorgestellte Ansatz hat Einschränkungen: Die Vorbereitung ist effektiver, wenn der ökonomische Schwellenwert ~ 2-3 Larven pro Pflanze beträgt und die Sporenkeimung bei Vorhandensein hoher Feuchtigkeit und relativ niedriger Temperaturen maximal ist.
Hier ist die Pilzpräparation nach dem Kontakt wirksam, während bakterielle (Bt) und virale Präparate (-HaNPV) nur wirksam sind, wenn sie verdaut werden. In Bezug auf die Qualitätskontrollparameter wurde neben der Lebensfähigkeit der Sporen erstmals vorgeschlagen, dass biochemische und molekulare Marker auf der Basis von Nagelhaut abbauenden Enzymaktivitäten und spezifischen Restriktionsverdauungsmustern der gleichen Enzymgene die Wirksamkeit in das Feld. Die Qualität-contrOl-Parameter vorgeschlagen: (a) die Sporenlebensfähigkeit, gemessen als Sporenkeimung (sollte> 90% auf PDA nach 16 h bei 28 ° C und 70-80% RH); (B) die prozentuale Mortalität von H. armigera (sollte> 90%, mit 1 x 10 7 Sporen im Labor-Bioassay); (C) die Chitinase-Aktivität im Chitin-Medium nach 72 h (sollte> 3,5 x 10 -3 U / ml) sein; Und (d) das PCR-RFLP-Muster von Chitinase-Genen. Dieses Manuskript hat im Wesentlichen die Protokolle beschrieben, von der Isolierung eines entomopathogenen Pilzes bis zur Erzeugung von Wirksamkeitsdaten gegen die Zielplage auf dem Feld. Dies ist eine der Voraussetzungen für die Registrierung von Biopestizid-Formulierungen mit dem Central Insecticide Board of India und schließlich für die Kommerzialisierung.
Die hier detaillierte Versuchsreihe wird für die Entwicklung eines potentiellen Mycoinsektizids nützlich sein. Darüber hinaus kann nach der Extraktion der Sporen die Abfall-Myzel-Biomasse verwendet werdenPflanzenwachstumsförderung oder zur Isolierung von Chitosan- oder Glucosaminpolymeren für Anwendungen im Gesundheitswesen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bestätigen den Beitrag der Mitarbeiter aus dem Indo-Swiss Collaboration in Biotechnology (ISCB) des Fachbereichs Biotechnologie, Neu-Delhi und der Direktion für Entwicklung und Zusammenarbeit, Bern, Schweiz. Die Beiträge von Projektschülern und Mitarbeitern, die an der Entwicklung des Mycoinsektizids beteiligt sind, darunter Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane und Abhijeet Lande, werden anerkannt. EKP und SGT danken der University Grants Commission, Indien und dem Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, für Forschungsstipendien. MVD erkennt die Unterstützung des Rates für industrielle und wissenschaftliche Forschung, Neu-Delhi für das Emeritus Scientist Scheme an. Die Autoren sind dank der Abteilung für Biotechnologie, Neu-Delhi, Indien für die finanzielle Unterstützung im Rahmen der ISCB- und SBIRI-Programme. Wir sind dankbarRezensenten für ihre Eingaben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
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