Summary
Här redovisar vi de olika faser som är inblandade i den kunskapsbaserade utvecklingen av en effektiv mycoinsekticid, inklusive isolering, identifiering, screening och urval av "entomopathogenic fungus " best fit ", Metarhizium anisopliae , för bekämpning av skadegörare i jordbruket .
Abstract
Ett stort problem vid utvecklingen av kommersiella mycoinsekticider är dödhastigheten jämfört med den för kemiska insekticider. Därför är isolering och screening för valet av en snabbverkande, mycket virulent entomopatogen svamp viktiga steg. Entomopatogena svampar, som Metarhizium, Beauveria och Nomurea , som verkar genom kontakt, passar bättre än Bacillus thuringiensis eller nukleopolyhedrosvirus (NPV), som måste intas av insekterna. I det nuvarande arbetet isolerade vi 68 Metarhizium- stammar från infekterade insekter med hjälp av en jordutspädning och betesmetod. Isolaten identifierades genom amplifiering och sekvensering av ITS1-5.8S-ITS2- och 26S-rDNA-regionen. Den mest virulenta stammen av Metarhizium anisopliae valdes utifrån median dödlig koncentration (LC 50 ) och tid (LT 50 ) erhållen vid insekts bioassays mot III-instarlarver från Helicoverpa armigera.Massproduktionen av sporer av den valda stammen utfördes med fermentering med fast tillstånd (SSF) med användning av ris som ett substrat i 14 dagar. Sporer extraherades från den sporulerade biomassen med användning av 0,1% tween-80, och olika formuleringar av sporerna framställdes. Fältförsök av formuleringarna för kontroll av en H. armigera- infestation i duvaärter utfördes genom randomiserad blockdesign. Infestationskontrollnivåerna erhållna med olja och vattenhaltiga formuleringar (78,0% respektive 70,9%) var bättre än 63,4% erhållna med kemisk bekämpningsmedel.
Introduction
Från införandet av organiska klorpesticider i 1940-talet i Indien har användningen av bekämpningsmedel ökat många gånger 1 , med skadedjur som fortfarande har kostat miljarder rupier 2 årligen när det gäller avkastningsminskning i jordbruksproduktionen. Den utbredda och oskäliga användningen av syntetiska bekämpningsmedel är ett kontinuerligt hot mot miljön och människors hälsa 1 . Den oskäliga användningen av bekämpningsmedel leder till rester i jorden och utarmning av naturliga skadedjur. Det tjänar också som ett kraftigt urvalstryck för att förändra den genetiska sminken av en skadedjurspopulation, vilket leder till utvecklingen av resistans 1 . Trots de enorma fördelarna med den gröna revolutionen, som krävde höga insatser, som gödselmedel och bekämpningsmedel, fortsätter skadedjur att vara en stor biotisk begränsning. En generell uppskattning av registrerade årliga växtförluster i Indien och i världen är USD 12 miljarderEf "> 2 respektive USD 2.000 miljarder 3 respektive.
När kemiska bekämpningsmedel har skadliga effekter när de används för att bekämpa skadedjur, är det viktigt att söka efter alternativa metoder som är ekologiskt sunda, tillförlitliga, ekonomiska och hållbara. Biologisk kontroll erbjuder ett lämpligt alternativ och inkluderar användning av parasiter, rovdjur och mikrobiella patogener 4 . Svampar är till exempel kända för att infektera ett brett spektrum av insekter skadedjur, inklusive lepidopteraner, hymenopteraner, coleopteraner och dipteraner, vilket ofta resulterar i naturliga epizootier. I motsats till andra bakteriella och virala insektsbekämpningsmedel är dessutom verkningsmekanismen hos insektspatogena svampar genom kontakt 5 . Dessa svampar innefattar en heterogen grupp av över 100 genera, med cirka 750 arter rapporterade bland olika insekter. De viktiga svamppatogenerna är: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii och Hirsutella sp., För att nämna några 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin är den näst mest använda entomopatogena svampen vid biokontroll. Det är känt att attackera över 200 arter av insekter 7 .
I denna studie presenteras olika steg som är involverade i den kunskapsbaserade utvecklingen av en mykoprotid med användning av M. anisopliae . Detta innefattar: 1) identifiering av en källa ( dvs mark eller mycosed insekter) för virulenta entomopatogener, 2) entomopatogen identifiering och urval, 3) strategier för att upprätthålla sin virulenta natur och effektivitet i laboratorie bioanalys och inom området, 4 ) Den kostnadseffektiva formuleringen av infektiva propaguler, 5) utvecklingen av unika kvalitetskontrollparametrar för virulent preparering, och 6) bioprospektering och värdetillsats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Entomopathogenic Svampar
- Jordutspädningsmetod
- Samla markproverna och mycosed insekter från olika grödor ( Tabell 1 ). Isolera de entomopatogena svamparna från markproverna med hjälp av jordutspädningsmetoden 8 .
Obs: I denna studie samlades prover från Pune (18 ° 31'''N, 73 ° 51'24''E) och Buldhana (19 ° 58'36''N 76 ° 30'30''E ) Distrikt, Maharashtra, Indien. - Väg 10 g av varje markprov och tillsätt dem separat till 90 ml steril 0,1% (vikt / volym) Tween-80.
- Blanda proven noggrant med en magnetomrörare under 60 minuter för att släppa bort sporerna vidhäftade med jordpartiklar.
- Efter blandning sprida 100- till 200 μl alikvoter från varje prov på selektivt medium innehållande (g / L): pepton, 10; Glukos, 20; Agar, 18; Streptomycin, 0,6; Tetracyklin, 0,05; cycLohexamid, 0,05; Och dodin, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Inkubera plattorna vid 28 ° C i 3-7 dagar.
- Välj och subkultur de individuella sporulerande kolonierna på samma medium för att erhålla rena kulturer.
- Samla markproverna och mycosed insekter från olika grödor ( Tabell 1 ). Isolera de entomopatogena svamparna från markproverna med hjälp av jordutspädningsmetoden 8 .
- Från mycosed insekter
- Samla mycosed insekter från fältet.
Obs! En hård larvkropp är sannolikt smittad med entomopatogen svamp. Med bakteriell eller virusinfektion är den döda insektsdelen mjuk. - Samla levande insekter med onormalt beteende, dålig samordning och ryckande rörelser.
- Håll insekterna fram till döden och överför dem sedan till fuktiga kamrar för ytterligare mykos och sporulation, om det finns någon, vid 28 ° C och 70-80% RH.
- Stråla sporerna från de sporulerande kadavarna på ovan nämnda selektiva medium och erhålla rena kulturer genom ytterligare subkultur 2-3 gånger på samma medium.
- Samla mycosed insekter från fältet.
- Bete metod
- I enInjektionsflaska (3,85 x 6,0 cm) innehållande 60 g markprov, tillsätt 4 rismal larver ( Corcyra cephalonica ) och förvara injektionsflaskorna vid 25 ± 2 ° C under 14 dagar.
- Vänd flaskorna upp och ner varje dag. Efter 14 dagar, skärm markproverna för närvaron av mycosed rismal larver. Isolera den entomopatogena svampen genom streaking sporer från sporulerande kadaver på selektivt medium.
- Efter att ha erhållit rena kulturer, överför isolaten till plattor av potatisdextrosagar (PDA) och inkubera vid 28 ° C och 70-80% RH under 7 dagar för att möjliggöra sporulering. Efter sporulation behåll moderkulturerna vid 8 ° C tills användning.
2. Identifiering av Entomopathogenic Svampar
- Identifiera entomopatogena svampar genom att observera morfologiska egenskaper ( dvs asexual spore storlek och form och arrangemang av sporer på conidiophores); Isolat av 3 huvudgenera, Metarhizium , Beauv Eria och Nomuraea , kan identifieras.
- För molekylär identifiering av Metarhizium- stammar extrahera det genomiska DNAet från mycelbiomassan med användning av ett DNA-isoleringskit; Följ tillverkarens instruktioner (se materialet ). Kontrollera kvaliteten på genomiskt DNA genom att utföra elektrofores på en 0,8% agarosgel.
- PCR-amplifiera ITS1-5.8S-ITS2- och 26S-rDNA-regionen. Använd genomiskt DNA som en mall, med ITS1 framåt (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) och ITS4 omvänd (TCCTCCGCTTATTGATATGC) primers 10 .
- Gel-eluera och rena amplikoner med förväntade storlekar med hjälp av ett gel-extraktionssats; Följ tillverkarens instruktioner (se materialet ). Kvantifiera den renade ampliconen och sekvensen.
- Läs och redigera sekvenserna med hjälp av programvaran och utför en BLAST-sökning av nukleotidsekvenserna i NCBI GenBank databibliotek för att analysera den nära homologin= "Xref"> 11.
- Sätta in sekvenserna av identifierade entamopatogena isolat till NCBI GenBank-databasen för att hämta anslutningsnumren.
3. Screening av Metarhizium Isolates Against H. Armigera
- Insektsuppfödning
- Upprätta den ursprungliga kulturen av H. armigera genom att samla friska larver och puppar från insekten från fältet.
- För uppfödning odlar larverna individuellt i sterila polypropylenflaskor (3,85 x 6,0 cm, 50 ml kapacitet) innehållande bitar av okra desinficerad med 0,5% (volym / volym) natriumhypoklorit i 10 min 12 .
- Samla insektsäggen som läggs under uppfödning och sterilisera dem med 0,5% (v / v) natriumhypoklorit.
- Underhålla larverna vid 25 ± 2 ° C och 65 ± 5% RH.
- Insekts bioassay
Anmärkning: För insekts bioassay är produktionen av sporer,Och fältprestandestudier användes de första subkulturerna av Metarhizium- stammar från mycosed H. armigera larver, om inte annat anges.- För insekts bioassays använder du III-instarlarverna av H. armigera .
- Doppa en uppsättning av 30 larver i tre exemplar individuellt i en 10 ml sporsuspension av Metarhizium- isolat (1 x 10 7 sporer / ml, om inte annat nämns, livskraft> 90%) under 5 s.
- Efter behandling, överför varje larva individuellt till en separat, steril flaska för att undvika kannibalism. Till varje injektionsflaska lägger du till fuktigt Whatmann filterpapper nr 1 och en bit desinficerad okra som matning. Byt papper och mata på andra dagar.
- Förvara larverna vid 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH och 16: 8 ljus: mörkt i 14 dagar eller tills de dör.
- Överför de döda larverna till sterila petriplattor innehållande fuktig bomullspinne och håll dem vid 28 ° C och 70-80% RH i 3-7 dagar för att tillåta myceli och sporerBildande över kadaverna.
- För en kontroll, behandla en uppsättning 30 larver i triplicat med 0,1% (vikt / volym) Tween-80 i sterilt destillerat vatten.
- Utför allt experiment i triplicat med användning av nyberedda spore suspensioner. Samla in och samla data om procentuell mortalitet från tre experiment för att få medelvärden. Beräkna den korrigerade procentuella mortaliteten med hjälp av Abbots formel 13 .
- Utför experimenten med hjälp av en randomiserad komplett blockdesign (RCBD), med varje behandling innehållande en uppsättning 30 larver i triplikat. Baserat på procentuell mortalitet mot H. armigera , välj Metarhizium isolat för ytterligare screening av det bästa isolatet för kommersiell produktion.
- Välj isolaten som visar> 90% mortalitet mot H. armigera III-instar larver.
Obs! Här valdes 12 isolat. - Bestäm LT 50 av dessa isolat och välj isolaten demonBetygsätta den snabbaste döden (på kortare tid).
Obs! Här valdes 5 isolat från de 12 mest potenta isolaten. - Bestäm LC 50- värdena för de valda isolaten med fyra olika koncentrationer (dvs 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 och 1 × 10 9 sporer / ml) sporsuspension.
- Bestäm LC 50 av metarhiziumisolaten mot III-instarlarverna av H. armigera för att öka möjligheten att identifiera skillnaden i virulens av isolat med höga mortalitetsvärden som kan bli oupptäckta om endast en enstaka dos används.
4. Produktion av sporer av Metarhizium Isolera för fältteatervetenskap
- Produktion av metarhiziumsporer av SSF
- För SSF, förbered inokulatet genom att tillsätta 2 x 107 sporer av Metarhizium- isolaten till200 ml YPG (0,3% jästextrakt, 0,5% pepton och 1,0%, glukos) medium. Inkubera kolvarna vid 28 ° C med skakning (180 rpm) under 48 timmar.
- För massproduktion av sporer av SSF, använd ris som substrat om inget annat anges.
- För SSF, fyll autoklaver påsar (typ / 14 med ett enda mikroventilerat filter på 0,5 μm, 2 kg kapacitet, 64 × 36 cm) med 2 kg ris. Tillsätt 1000 ml destillerat vatten till riset i påsarna och blöt över natten 14 . Autoklavera påsarna med det blötta riset vid 121 ° C under 45 min 15 .
- Inokulera påsarna med 48-h gammalt mycel-inokulum (10% inokulum, 200 ml för 2 kg ris) och inkubera vid 28 ° C och 70-80% RH i 14 dagar.
- Skörda sporerna genom flytande extraktion med 0,1% Tween-80. Lägg till innehållet i påsen till 0,1% Tween-80 (3 liter per 1 kg ris), blanda noga, separera sporerna från vätskan genom centrifugering och torka vid 37 ° C i 2 dagar. < / Li>
- Alternativt torkar påsarna som innehåller ris med sporerna och lite myceli vid 37 ° C i 2 dagar för att minska fuktinnehållet (<20%). Skörda sporerna med en mykoskördare eller vibro-sifter.
- Livskraftstudier
- Bestäm den procentuella lönsamheten hos de skördade sporerna med olika metoder 15 . För detta, förbered sporeruspensionerna i 0,1% (vikt / volym) Tween-80 och justera räkningen till 1 x 10 3 sporer / ml.
- Spread suspensions (0,1 ml) på PDA-plattor i triplicat och inkubera vid 28 ° C och 70-80% RH i 72 timmar.
- Räkna manuellt de isolerade kolonierna och bestäm det totala livsdugliga antalet för respektive prov.
- Spor sedimenteringshastighet
- För en likformig dosering krävs den homogena sporsuspensionen; Bestämma spor sedimentationshastigheterna för Metarhizium isolat som beskrivs"Xref"> 16. Kontrollera sedimentationshastigheterna hos sporer i 0,2 M ammoniumsulfat och 0,1% Tween-80.
- Justera sporesuspensionens räkning till ~ 7 × 107 sporer / ml för att erhålla en initial absorbans av 0,6 vid 540 nm. Låt kyvetterna stå ostörda i 6 timmar för att sporerna ska lösa sig.
- Spela in absorbansen i upp till 6 timmar. Uttryck sedimenteringshastigheten i procent och beräkna tiden som krävs för 50% sedimentering (ST 50 ). Upprepa experimentet tre gånger med användning av nyligen framställda spore suspensioner.
5. Field Performance Studies av förmågan hos den utvalda M. anisopliae isolera till kontroll H. armigera i duva ärter
- Vätbar pulverformulering av M. anisopliae M 34412 sporer
- Förbered 2,5-5% vätbar pulverformulering genom att blanda sporerna med talk.
- Justera det slutliga bärbara talet (TVC) till 1 x 10 12 spoRes per kg formulering.
- Fältprestanda studier av M. anisopliae M 34412 sporer
- För fältprestandestudier av förmågan hos det valda M. anisopliae- isolatet för att kontrollera H. armigera- infestation i duva, använd en RCBD med fyra replikationer.
Anm .: Här utfördes vid Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E). - Använd två olika sprayformuleringar, en oljepreparation av sporer (5 x 10 12 sporer / 3 liter diesel: solrosolja, 7: 3) och en vattenhaltig formulering i Tween-80 (0,1%). Spraya oljeblandningen med en ultra-låg volym (ULV) spruta (70 min, 3 liter / ha) vattenhaltiga formuleringen med en ryggsäckspruta (5 x 10 12 sporer, 500 L / ha).
Anmärkning: Här registrerades larvalpopulationerna en dag före sprayen och 3 och 7 dagar efter appliceringen av varje spray till 5 slumpmässigt valda växter. Den totala befolkningen var tFormade till kvadratroten av n + 1 för den statistiska analysen.- Enligt jordbruksmetoder för duvaärtskörden, utför den första sprutningen mellan 10 och 15 d efter äggläggning och 2 gånger med 14 dagars intervall. Utför sprutningen mellan 16:00 och 18:00 h IST. Övervaka vindriktningen och vid behov använd tyggardiner för att undvika sporer i spåren i närliggande tomter.
- För jämförelse, spraya de kemiska insektsmedlen med en hand-kompressions ryggsäckspray.
- Bestäm inokulumets persistens i fältet genom att samla H. armigera larverna 0, 3, 5, 7 och 14 dagar efter sprayning.
- Förvara dessa larver under observation i 14 dagar och efter döden, överför dem till en plastflaska innehållande fuktigt filterpapper. Inkubera vid 25 ± 2 ° C och 70 ± 10% RH för att observera mykos.
- Bestäm inoculums uthållighet på larvalpopulationen baserat på p Uppkomst av dödligheten hos larverna som samlats in från fältet efter sprayning.
- Utvärdera fältstudierna med utgångspunkt i procent effekt 17 , procent skador på skador och procentuellt utbyte 18 .
Obs! Här registrerades data för parametrarna, såsom temperatur, luftfuktighet, vindhastighet (km / h), solsken (h), regn (mm), regniga dagar och avdunstning (mm) under en provning vid en Jordbruksuniversitetet (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E).
- För fältprestandestudier av förmågan hos det valda M. anisopliae- isolatet för att kontrollera H. armigera- infestation i duva, använd en RCBD med fyra replikationer.
- Jordbrukarnas deltagande program
- Välj antal bönder för demonstrationsproverna. Leverera duven ärtor (BSMR-736) tillsammans med gödselmedel till bönderna.
Obs! I denna studie var 20 bönder inblandade. By: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). - Använd samma sprayformuleringar och antal sprutor som i steg 5.2.
- Välj antal bönder för demonstrationsproverna. Leverera duven ärtor (BSMR-736) tillsammans med gödselmedel till bönderna.
- Observera effekten av mycoinsekticidspray, om någon, på duven ärter lämnar.
- Samla jordens leddjur och bladbevuxna insekter 1 dag efter varje behandling i de obehandlade tomterna och i tomterna behandlade med M. anisopliae .
- Samla de jordboende leddjuren med fallgropar inom 24 timmar efter behandling och samla de lövbebyggda insekterna med ett sopnät på morgonen efter behandlingen ( dvs. ca 15-18 h efter behandling).
- Håll dem individuellt i cylindriska plastlådor med diametrar på 3,5 cm och höjder på 4,0 cm. Kontrollera insekterna dagligen för infektion och mata dem med lämplig mat.
- Anteckna närvaron av M. anisopliae , om alls, och isolera svampen.
7. Identifiering av parametrar för kvalitetskontroll
- Kontrollera spårbarheten genom att mäta sporerökningen på PDA vid 28 °; C.
- Mät nedbrytningsnedbrytande enzymaktiviteter, såsom kitinas, kitin-deacetylas, kitosanas, proteas och lipas, framställda i YPG- och kitinmediet, såsom beskrivits tidigare 15 .
- Bestäm procentuell mortalitet hos H. armigera i ett laboratorie bioanalys 15 .
- Använd molekylära markörer, såsom ett PCR-RFLP-mönster av kitinaser ( chit 1 , 2 och 4 ) och proteas ( Pr1A ) -gener, som virulensegenskaper för M. anisopliae .
- Extrahera genomiskt DNA från mycelbiomassan med användning av ett DNA-isoleringskit 15 . PCR-amplifiera Chitl- och Chit2- genfragmenten med användning av genomiskt DNA som en mall, med primerpar Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) och Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). För Chit4 , använd primerparet Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG).
- För amplifiering av Pr1A-genen, använd METPR2- och METPR5-primerparet (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG).
- Utför restriktionsmältningen 19 av Chitl- genen med BsaJI , BstUI och ScrFI ; Av Chit2- genen med AluI , HpyCH4IV och HpyCH4V och av Chit4- genen med BstUI , HaeIII och MboI . För digestionen av Pr1A- genen, använd RsaI , Ddel och MspI 20 .
- Observera restriktionsfragmentlängdspolymorfismen (RFLP) mönstret på 1,5% agarosgel genom elektrofores för varje gen för de flesta virulenta stammar (> 90% mortalitet); Detta kan användas som virulensmarkör för valet av M. anisopliae .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under undersökningarna isolerades olika stammar av Metarhizium, Beauveria och Nomuraea genom olika isoleringsmetoder (data ej visade) 6 , 14 Eftersom Metarhizium- stammar befanns vara mer effektiva vid kontroll av H. Armigera , ett fruktansvärt skadedjur i pulserna 6 , 14 , Var ytterligare isoleringar inriktade på att isolera metarhiziumstammar från olika grödor och insekter ( tabell 1 ). Totalt erhölls 68 Metarhizium- isolat identifierade med kulturella och morfologiska egenskaper och genom ITS 1-5,8S-ITS 4-sekvensering. Baserat på> 90% mortaliteten hos H. armigera i laboratorie bioassays testades 12 metarhiziumisoler ytterligare för sporproduktion, livskraft, LC 50 , LT 50 och ST 50 . Tabell 2 beskriver dataFör 3 potentiella isolat, M34311, M34412 och M81123; M34412 visade sig vara det bästa isolatet.
Bland de testade substraten, såsom ris, sorghum, majs och vete, stödde ris den maximala sporuleringen vid Metarhizium- isolat (60-75 g sporer / kg, 4-4,4 x 10 10 sporer / g sporepulver) .
Under fältförsöket för kontroll av H. armigera i duvaärter erhölls 78,0% och 70,9% effektiviteter med respektive M. anisopliae M34412 olja och vattenhaltiga formuleringar . Podskadorna i M. anisopliae- behandlade tomter visade sig vara mindre (8,76%) än i de obehandlade kontrollplottorna (23,63%) och de kemiskt behandlade tomterna (10,24%). Genomsnittlig utbyte (q / ha) i den obehandlade kontrollen var 7,31 q / ha, vilket var mindre än det efter behandling med M. anisopliae M34412 (14,04 q / ha). Behandling med kemikalie gav ett utbyte av 12,78 q / ha ( tabell 3 ).
Observationerna som registrerats för fytotoxicitetssymptom visade att inga behandlingar visade en fytotoxisk effekt på duvaärtsgrödet efter 3 sprutor av M. anisopliae- formulering. Av 57 insamlade jordbäddsjorddjur (fältcrickets och spindlar), ingen infekterades. Av 590 samlade baldakthusande leddjur befanns två individer av ordningen Heteroptera (= 0,3% av de samlade artropoderna) infekteras med M. anisopliae ( Tabell 4 ). Varken spindlar eller Coccinellider gav sig till svampen.
| Jord (58 isolat) | ||
| Isolera nr | Beskära | Antal isolat |
| M1311, M1322, M1333, M2104, M2305, M2416, M2427, M2508, M42014, M45115, M45216, M45317, M79120, M79221, M79322 | Tomat | 15 |
| M3419, M34210, M34311, M34412, M34513, M171264 | Vaniljsås äpple | 6 |
| M81123, M91124, M91225, M91326, M91528, M91427, M91629, M91730, M91831, M91932, M111145 | Sockerrör | 11 |
| M101133, M101234, M101335, M101436, M101537, M101638, M101739, M101840, M101941, M102042, M102143, M102244 | Brinjal | 12 |
| M51118, M51219 | okra | 2 |
| M131150, M141151, M141252, M151153 | Duva ärter | 4 |
| M121146, M121247, M121348, M121449 | Kikärt | 4 |
| M183365 | Bomull | 1 |
| M193166 | Jawar | 1 |
| Insektsvärden (10 isolat) | ||
| M16255, M16356, M16457, M16558, M16659 | Pigeon Pea-fettig cutworm | 5 |
| M16154, M16760 | Sockerrör-mjödig insekt | 2 |
| M16861 | Sugarcane-white grub | 1 |
| M16962 | Sockerrör-skalbagge | 1 |
| M161063 | Sockerrör-Pyrilla perpussila | 1 |
Tabell 1. Urkomst av Metarhizium- stammar. 68 Metarhizium- stammarna isolerades från olika grödor (58 stammar) och mycerade insekter från grödorna (10 stammar).
| Isolera | Utbyte (g / kg ris) | Lönsamhet (%) | LC 50 (x 103 sporer / ml) | LT 50 (dagar) | Dödlighet (%) | |
| Medel ± SD | Medel ± SD | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | (Fiducial Limit) | ||
| M34311 | 60,00 ± 2.64a | 92,00 ± 2.64a | 2,47 (2,26-2,69) | 2 (0,4-10,3) | 3,5 (3,2-3,7) | 96,67 |
| M34412 | 67,00 ± 3.46b | 97,00 ± 1.73a | 2,3 (2,11-2,52) | 1,4 (0,1-1,9) | 3,3 (3,0-3,6) | 96,67 |
| M81123 | 75,00 ± 3.60c | 93,00 ± 1.73a | 2,65 (2,43-2,90) | 5,7 (1,2-26,7) | 3,3 (3,1-3,6) | 95,56 |
| Numrer följt av samma bokstav i kolumnen är inte statistiskt annorlunda. | ||||||
| ST 50, tiden som krävs för sedimentering av 50% sporer i 0,1% (vikt / volym) Tween 80. | ||||||
| Numrer följt av samma bokstav i kolumnen är inte statistiskt annorlunda. SD, standardavvikelse. T80, Tween 80 (0,1%, vikt / volym). | ||||||
| LC 50 , den mediana dödliga koncentrationen av sporer beräknad att orsaka 50% mortalitet av H. armigera efter 14 dagar. | ||||||
| LT 50 , den mediana dödliga tiden för sporer beräknad att orsaka 50% mortalitet av H. armigera . | ||||||
Tabell 2. Urval av tre mest effektiva metarhiziumisoler. H. armigera 3 rd- instar larver.
| Fältförsök $ | ||
| Behandling | % Effektivitet * | Utbyte (q / ha) |
| Vattenhaltig M. anisopliae M34412 (5x 10 12 sporer / ha) 500L | 70,93 ± 4,19 | 14,04 |
| Oljepreparat ( M. anisopliae ) (5x10 12 sporer / ha) 3 L | 78,02 ± 4,61 | 15,53 |
| Kemisk bekämpningsmedel / Jordbrukarnas övning (2 ml / L, 500 L / ha) | 63,43 ± 0,85 | 12,78 |
| Obehandlad kontroll | - | 7,31 |
| Demonstrationstest i (Farmers Participatory Program) $$ | ||
| Behandling | % Podskada | Utbyte (q / ha) |
| Vattenhaltig formulering ( M. anisopliae ); Område 4.2 ha | 15,9 ± 1,26 | 10,75 |
| Oljepreparat ( M. anisopliae ); Område 0,4 ha | 17,74 | 12,5 |
| Jordbrukarnas övning; Område 11ha | 22,72 ± 3,37 | 7,55 |
| Bevattad gröda | ||
| $ Randomized Block Design | ||
| * Efter Henderson och Tilton (1955) | ||
| # HaNPV, H. armigera nukleopolyhedrovirus | ||
| $$ NUmber av bönder som deltog i demonstrationproverna var 20. Duvorna frö (BSMR - 736) levererades tillsammans med gödselmedel till bönderna. By: Deolali Pravara, Tal. Rahuri. Dist. A'Nagar (MS) (19,473 ° N 74,6 ° E) | ||
Tabell 3. Fältprestanda för M. anosopliae (M34412) stam mot H. armigera . Effekten av olika formuleringar av M. anisopiae jämfördes med kemiska pesticidbehandlingar mot H. armigera- infestation i duvaärter under fältbetingelser.
| Parameter | Fält 1 | Fält 2 | Fält 3 |
| Plottstorlek (m) | 12 x 17 | 10 x 10 | 10 x 15 |
| replikat | 2 | 2 | 2 |
| # Arthropoder från fallgropsfångare testas | 20 | 22 | 15 |
| % Infekterad med M. anisopliae (fallgropsfällor) | ND | ND | ND |
| # Arthropods från sop netto samling testad | 193 | 171 | 226 |
| % Infekterad med M. anisopliae (insprutning av nätet) | ND | ND | 0,9 |
| ND, Ej detekterad Fält 1, Jordbrukshögskolan, Pune; Fält 2, NGO 1, Tulapur, Pune; Fält 3, NGO 2, Aalandi, Pune. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under 1880-talet gjordes det första försöket att använda Metarhizium för att styra scarabafeln, Anisoplia austriaca och sockerbetorskurculio, Cleonis punctiventris 21 . I detta protokoll var en av förutsättningarna att isolera en virulent stam, antingen från jorden eller från smittade insekter. Faktum är att andra parametrar, såsom LC 50 , LT 50 och ST 50 , väsentligt bidrog till kostnadseffektiviteten hos produkten 22 , 23 . För optimering av sporeproduktionen behölls en delikat balans mellan antal sporer, livskraft och virulens 24 .
Eftersom jordbruket är en produkt med hög volym och låg kostnad, är kvalitetsuppfattning, acceptans av slutanvändare och hållbarhet för sporer de viktigaste problemen. Värdsspecificitet är fördelaktig för att undvika icke-mål-effekter= "Xref"> 14. Undvikandet av upprepad subkultur på artificiellt medium och tillfällig passage genom insektsvärden bibehöll virulensen och effektiviteten hos Metarhiziumsporerna i fält 22 . Den presenterade metoden har begränsningar: förberedelsen är effektivare när den ekonomiska tröskelnivån är ~ 2-3 larver per växt, och sporerökningen är maximal i närvaro av hög fuktighet och relativt låga temperaturer.
Här är svamppreparatet effektivt efter kontakt, medan bakteriella (Bt) och virala preparat (-HaNPV) endast är effektiva när de smälts. När det gäller kvalitetskontrollparametrar har förutom första gången föreslagits att biokemiska och molekylära markörer baserade på nedbrytnings-nedbrytande enzymaktiviteter och specifika restriktionsmältningsmönster av samma enzymgener säkerställer effektivitet i fältet. Kvalitets-kontrOl parametrar som föreslås är: (a) spore-livskraften, mätt som spore-spiring (bör vara> 90% på PDA efter 16 timmar vid 28 ° C och 70-80% RH); (B) den procentuella mortaliteten hos H. armigera (bör vara> 90%, med 1 x 107 sporer i laboratorie bioassay); (C) chitinasaktiviteten i kitinmediet efter 72 timmar (bör vara> 3,5 x 10 ^ U / ml); Och (d) PCR-RFLP-mönstret av kitinasgener. Detta manuskript har väsentligen beskrivit protokollen, från isoleringen av en entomopatogen svamp till genereringen av effektdata mot målsjukdomen i fältet. Detta är en av förutsättningarna för att registrera någon biopesticidformulering med Central Insecticide Board of India och så småningom för kommersialisering.
Serien av experiment som beskrivs här kommer att vara användbar för utvecklingen av en potentiell mycoinsekticid. Vidare kan, efter extraktionen av sporerna, avfallsmycelbiomassan användas förVäxtförädling eller för isolering av kitosan eller glukosaminpolymerer för hälsovårdstillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner bidrag från samarbetspartnerna från det biotekniska institutets indo-schweiziska samarbete i bioteknik (ISCB), Institutionen för bioteknik, New Delhi och det schweiziska byrån för utveckling och samarbete, Bern, Schweiz. Bidrag från projektstuderande och personal som deltar i utvecklingen av mycoinsekticiden, inklusive Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane och Abhijeet Lande, erkänns. EKP och SGT tackar universitetsbidragskommissionen, Indien och rådet för vetenskaplig och industriell forskning (CSIR), Indien, respektive för forsknings stipendier. MVD erkänner stödet från rådet för industriell och vetenskaplig forskning, New Delhi för Emeritus Scientist Scheme. Författarna är tacksamma för Institutionen för bioteknik, New Delhi, Indien för det ekonomiska stödet enligt ISCB och SBIRI-programmen. Vi är tacksammaGranskare för deras ingångar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Hi-Media | RM666 | Reagent |
| Ammonium sulphate | Thomas Baker | 11645 | Reagent |
| DNA analyzer | Applied biosystem | ABI prism 3730 | Instrument |
| DNA islation kit | Qiagen | 69104 | Reagent |
| Dodine | Sigma | 45466 | Reagent |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28604 | Reagent |
| Glucose | Hi-Media | GRM077 | Reagent |
| Knapsac sparyer | Kaypee | HY-16L (1004) | Instrument |
| Peptone | Hi-Media | RM006-500G | Reagent |
| Polypropylene vials | Laxbro | SV-50 | Plasticware |
| Potato dextrose agar (PDA) | Hi-Media | M096-500G | Reagent |
| Tween-80 | SRL | 28940 | Reagent |
| Ultra low volume sparyer | Matabi | INSECDISK | Instrument |
| Unicorn-bags | Unicorn | UP-140024-SMB | Autoclavalbe bag for SSF |
| Yeast extract | Hi-Media | RM027-500G | Reagent |
| Chromas 2.1 | software |
References
- Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario. Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).
- Popp, J., Peto, K., Nagy, J. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).
- van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. Integrated pest and disease management in greenhouse crops. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).
- Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).
- Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).
- Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. Frontiers in industrial mycology. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).
- Goettel, M., Inglis, G. D. Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).
- Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR-Protocols: A guide to methods and applications. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).
- Basic Local Alignment Search Tool. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (2017).
- Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans. J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).
- Abbott, W. S. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).
- Nahar, P. Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137 (2004).
- Kulkarni, S. A., et al. Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea. Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).
- Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation. Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).
- Henderson, C. F., Tilton, E. W. Tests with acaricides against the brow wheat mite. J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).
- Hassani, M. Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae). , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).
- Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae. J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).
- Bidochka, M. J., Melzer, M. J. Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains. Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).
- McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).
- Nahar, P. B., et al. Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae). Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).
- Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).
- Deshpande, M. V. Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges. Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).
