Mammalcellekapsling i alginatperler ved hjelp av et enkelt omrørt fartøy

Summary

Denne videoen og manuskriptet beskriver en emulsjonsbasert metode for innkapsling av pattedyrceller i 0,5% til 10% alginatperler som kan fremstilles i store batcher ved bruk av en enkel omrørt beholder. De innkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres for cellulære terapiapplikasjoner.

Abstract

Celleinnkapsling i alginatperler har vært brukt for immobilisert cellekultur in vitro, så vel som for immunoisolering in vivo . Innkapsling av bukspyttkjertelen er studert omfattende som et middel for å øke isletes overlevelse i allogene eller xenogene transplantasjoner. Algininkapsling oppnås vanligvis ved dyseekstrudering og ekstern gelering. Ved hjelp av denne metoden faller celleholdige alginatdråper dannet ved spissen av dyser inn i en løsning som inneholder divalente kationer som forårsaker ionotrop alginat gelering som de diffunderer i dråpene. Kravet på dråpeformasjon ved dysespissen begrenser volumetrisk gjennomstrømning og alginatkonsentrasjon som kan oppnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsmetode for å inkapslere pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative metode emulgeres alginatdråper inneholdende celler og kalsiumkarbonat i mineralolje, folSenket av en reduksjon i pH som fører til intern kalsiumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nåværende metoden tillater fremstilling av alginatperler innen 20 minutter av emulgering. Utstyret som kreves for innkapslingstrinnet, består i enkle omrørte kar som er tilgjengelige for de fleste laboratorier.

Introduction

Mammalcelleinnkapsling har blitt bredt studert som et middel for å beskytte transplanterte celler fra immunavstøtning ¹ eller for å gi en tredimensjonal støtte for immobilisert cellekultur ^{2 , 3 , 4} . Bukspyttkjertelinnkapsling i alginatperler har blitt brukt til å reversere diabetes i allogene ^{5 , 6} eller xenogene ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} gnagere. Prækliniske og kliniske studier av innkapslet pankreas-øktransplantasjon for å behandle type 1-diabetes pågår ^{13 , 14 , 15} . For transplantasjonsapplikasjoner eller større skalEn in vitro immobilisert celleproduksjon, dysebaserte perlegeneratorer, blir generelt brukt. Vanligvis pumpes en blanding av alginat og celler gjennom en dyse for å danne dråper som faller i en omrørt oppløsning inneholdende divalente kationer, noe som resulterer i den eksterne gelering av dråpene. Koaksialgasstrømmen ^{16 , 17} , dysevibrering ¹⁸ , elektrostatisk avstøtning ¹⁹ eller roterende ledninger ²⁰ letter dråpedannelse ved dysespissen.

De viktigste ulempene ved konvensjonelle vulstgeneratorer er deres begrensede gjennomstrømning og det begrensede området av løsningsviskositeter som vil resultere i tilstrekkelig perleformasjon ²¹ . Ved høye strømningshastigheter bryter væsken som kommer ut av dysen opp i dråper som er mindre enn dysediameteren, og reduserer størrelsesreguleringen. Multi-nozzle bead generatorer kan brukes til å øke gjennomstrømningen, menDen ensartede fordeling av strømmen mellom dysene og bruken av løsninger> 0.2 Pas er problematisk ²² . Til slutt forventes alle dysebaserte enheter å forårsake noen skade på øyer, siden diameteren av dysene som brukes er mellom 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% av menneskelige øyer kan være større enn 200 μm ²³ .

I denne videoen beskriver vi en alternativ metode for innkapsling av pattedyrceller ved å danne dråper i et enkelt emulgeringstrinn i stedet for drop-by-drop. Siden beadproduksjonen utføres i et enkelt omrørt kar, er metoden egnet for liten (~ 1 ml) til storskala (10 ³ L-serie) perleproduksjon med lave utstyrskostnader ²⁴ . Denne metoden tillater fremstilling av perler med høy sfærisk form ved bruk av et bredt spekter av alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metoden ble opprinnelig utviklet av Poncelet et al. ^{25 , 26} og pleide å immobilisere DNA ²⁷ , proteiner ²⁸ innbefattende insulin ²⁹ og bakterier ³⁰ . Vi har nylig tilpasset disse metodene til innkapslingen av pattedyrceller ved bruk av pankreas-betacellelinjer ^{31 , 32} og primær pankreasvev ³² .

Prinsippet med metoden er å danne en vann-i-olje emulsjon bestående av alginatdråper i mineralolje, etterfulgt av intern gelering av alginatdråper ( figur 1 ). Først blir inkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) dispergert i en alginatoppløsning inneholdende et fint kornkalsiumsalt med lav oppløselighet ved den første prosess-pH. Alginatblandingen blir så tilsatt til en omrørt organisk fase for å danne en emulsjon, vanligvis i nærvær av aoverflateaktivt middel. I tilfelle av pattedyrcellekapsling kan komponenter som er tilstede i serum virke som overflateaktive midler. Deretter reduseres pH for å oppløseliggjøre kalsiumsaltet ved å tilsette en oljeoppløselig syre som skiller seg i vannfasen. Eddiksyre, med en mineralolje / vann-partisjonskoeffisient <0,005 ³³ , bør foroppløses i olje, deretter tilsatt emulsjonen hvor den blandes i oljefasen og skiller seg raskt i vannfasen ³⁴ . Figur 2 illustrerer de kjemiske reaksjonene og diffusjonen som finner sted under forsurende og indre geleringstrinn. Til slutt utvinnes de innkapslede celler ved faseinversjon, faseseparasjon akselerert ved sentrifugering, gjentatte vaske-trinn og filtrering. Disse trinnene kan deretter følges av perle- og celleprøvetaking for kvalitetskontrollanalyser, in vitro- cellekultur og / eller transplantasjon av de innkapslede celler.

Figur 1: Skjematisk av emulgeringsbasert prosess for innkapsling av pattedyrceller. Perler fremstilles først ved å emulgere en alginat, celle og CaCO3-blanding i mineralolje (trinn 1 og 2 i skjematisk), utløsende intern gelering ved å tilsette eddiksyre (trinn 3). De gelerte perler separeres deretter fra oljen ved å tilsette en vandig buffer for å utløse faseinversjon (trinn 4), etterfulgt av sentrifugering og olje-aspirering (trinn 5) og deretter filtrering (trinn 6). Til slutt overføres perlene oppsamlet på filteret til cellekulturmedium for in vitro- kultur eller transplantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Reaksjoner og diffusjonstrinn som oppstår under intern gelering. (1) Eddiksyre tilsettes til den organiske fasen og transporteres til alginatdråpene ved konveksjon. (2) Eddiksyre fordeler seg i vannfasen. (3) I nærvær av vann dissocierer og diffuserer syren for å nå CaCO _3- kornene som er avbildet i mørk blå. (4) H ⁺ -jonene utveksles med Ca2 ⁺ -ioner i CaCO3, frigjør Ca2 ⁺ -ioner. (5) Kalsiumioner diffunderer til de møter uomsatt alginat, som fører til ionotrop kryssbinding av alginatkjedene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I motsetning til konvensjonelle dysebaserte celleinnkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponertCted fra denne prosessen på grunn av mekanismen for dråpedannelse i omrørt emulgering. For en delmengde av applikasjoner, kan denne perlestørrelsesfordelingen være problematisk. For eksempel kan en større brøkdel av celler bli eksponert ved vulstoverflaten i mindre perler. Hvis næringsstoffer ( f.eks. Oksygen) begrensninger er en bekymring, kan disse begrensningene forverres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsmetode er at gjennomsnittlig vulststørrelse lett kan justeres ved å endre omrøringshastigheten under emulgeringstrinnet. Breddistribusjonsfordelingen kan også utnyttes for å studere effekten av perlestørrelse på innkapslet celleytelse.

Mammalisk celleinnkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ for laboratorier som ikke er utstyrt med en vulstgenerator. Videre gir denne metoden brukere muligheten til å redusere behandlingstiden eller generere perler ved svært lav eller meget høy alginatkoncentreringasjon.

Protokollen beskrevet nedenfor beskriver hvordan man skal innkapslere celler i 10,5 ml 5% alginatløsning fremstilt i 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består av en 50:50 blanding av transplantasjonskvalitet LVM (lav viskositet høy mannuronsyreinnhold) og MVG (medium viskositet høy guluronsyreinnhold) alginat. Kalsiumkarbonat i en sluttkonsentrasjon på 24 mM brukes som det fysiske tverrbindingsmiddel. Lett mineralolje utgjør den organiske fasen, mens eddiksyre brukes til å syre emulsjonen og utløse intern gelering. Imidlertid er alginatypen og -blandingen, så vel som den valgte prosessbuffer, avhengig av den ønskede anvendelse ³² . En rekke alginattyper (se tabell over materialer) har blitt brukt til å produsere perler med denne protokollen.

Protocol

1. Forbered Alginate Solution, CaCO ₃ Suspension og Syret Olje

1. Forbered prosessbufferen og mediumet.
   1. Forbered den typiske prosessbufferen som brukes til å generere høykonsentrasjonsalginatperler ved bruk av 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4.
   2. Forbered det typiske dyrkingsmediet ved bruk av Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
2. Forbered alginatstamppløsningen ved 1,17 ganger den endelige ønsket konsentrasjon i perlene.
   1. Først veier du riktig mengde alginatpulver. For eksempel, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% alginat med 50:50 LVM og MVG-alginat veier totalt 1,17 g natriumalginat ved å kombinere 0,583 g LVM-alginatpulver og 0,583 g MVG-alginatpulver.
   2. Plasser 20 ml prosessbuffer i en autocLavbar glassburk på en magnetisk røreplate og agitere ved ~ 200 rpm. Legg gradvis natriumalginatpulveret til løsningen.
   3. La løsningen røre natten over ved lav hastighet. Fest om nødvendig kolben til røreplaten.
   4. Hvis løsningen er uoppløst oppløst, fest flasken på en roterende mikser og fortsett å blande ved 37 ° C i ytterligere 24 timer.
   5. Steriliser alginatoppløsningen ved autoklavering av løsningen i 30 minutter i et fartøy som er mindre enn halvfullt. La temperaturen synke under 60 ° C før du henter løsningen.
   6. Fjern eventuelt partikler ved å filtrere alginatoppløsningen kort tid etter autoklavering før den når romtemperatur, mens viskositeten forblir tilstrekkelig lav.
3. Forbered kalsiumkarbonatsuspensjonen ved 21 ganger den endelige ønsket konsentrasjon for intern gelering.
   1. Vekt CaCO ₃ pulveret. For eksempel, annonseD 1 g CaCO3 til 20 ml prosessbuffer for å oppnå 24 mM CaCO3 som den endelige geleringsmiddelkonsentrasjonen.
   2. Autoklaver CaCO ₃ suspensjon i 30 min.
      MERK: CaCO ₃ konsentrasjonen vil endres over tid på grunn av bikarbonat - CO ₂ likevekt. Unngå å bruke samme lager CaCO ₃ suspensjon for mer enn 10 innkapslingsprosedyrer.
4. Autoklaver det omrørte beholderen som brukes til emulgeringsprosessen. Før bruk, fjern eventuelle rester av kondensert vann som er igjen i spinnerflasken.
5. Umiddelbart før emulgeringsprosessen, lag den surgjorte oljen. Oppløs 44 μL eddiksyre pr. 11 ml mineralolje plassert i et 50 ml konisk rør.
   MERK: En vanlig feil er ufullstendig oppløsning av eddiksyre. Unngå å pipettere små mengder eddiksyre og sørg for at eddiksyre er fullstendig oppløst i olje ved gjentatt vortexing.
   FORSIKTIG: eddiksyre er en giftig an D flyktig syre. Håndter dette reagenset under en avtrekksvifte og hold eddiksyre / olje-oppløsningen i en lukket beholder til emulgeringstrinnet. Se MSDS-informasjonen på dette reagenset for ytterligere informasjon.
6. La alle løsningene nå romtemperatur før de går videre til cellekapsling.

2. Alginat Bead Generation ved emulgering og intern gelering

1. Plasser 10 ml lett mineralolje i spinnerflasken og start agitasjon med lav rotasjonshastighet ( f.eks. 250 rpm for spinnerflasken som brukes i denne videoen).
2. Hvis cellene som brukes til prosessen er fra vedhengende kulturer, gjelder trypsin for å suspendere cellene. Avslutt reaksjonen ved å legge til FBS-holdig medium eller trypsininhibitor og samle en prøve for celleoppregning.
   1. Bestem cellekonsentrasjonen og levedyktigheten etter trypanblåfarging ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celle-teller, som tidligere beskrevetAss = "xref"> 32.
3. Sentrifuger cellene i 7 minutter ved 300 xg og vask dem en gang i det ønskede medium for celleimmobilisering. Sørg for at dette mediet inneholder emulgeringsmidler som enten FBS eller bovint serumalbumin (BSA). For eksempel bruk DMEM som inneholder 10% FBS.
4. Suspensér cellepellet i samme medium for å oppnå 10,5 ganger den ønskede endelige konsentrasjonen i perlene.
5. Tilsett 1,1 ml av den 10,5-ganger konsentrerte cellelager til 9,9 ml av alginatoppløsningen. Deretter tilsettes 550 μL CaCO ₃ suspensjon og blandes ved omrøring med en steril spatel for å sikre en jevn fordeling av CaCO ₃ .
6. Overfør straks 10,5 ml av alginat-, celle- og CaCO3-blandingen i omrøringsoljen ved hjelp av en sprøyte.
   MERK: For høyt viskøse løsninger, aspirer og skyll ut blandingen veldig sakte for å unngå luftbobler. I noen tilfeller er det foretrukket å stoppe omrøringen mens blandingen tilsettes i kolben for å unngåAlginat innblanding på pumpehjulet akselen.
7. Umiddelbart etter å ha tilsatt alginat-, celle- og CaCO3-blandingen til oljen, øker omrøringshastigheten.
   MERK: For 5% LVM: MVG-alginatet som brukes her, ble en rotasjonshastighet på 1025 rpm påført for å generere perler med en diameter på ca. 900 μm egnet for in vitro- kultur ³⁵ . Høyere rotasjonshastigheter og lavere alginatkonsentrasjoner vil føre til lavere gjennomsnittlige vulstdiametere, som beskrevet i tidligere publikasjoner ^{25 , 32} . Små endringer i pumpehjul og fartøy geometri, samt alginat egenskaper kan i stor grad påvirke gjennomsnitts perle diameter. For hver endring i fartøyskonfigurasjon eller alginatparti bør en standardkurve som relaterer overflatearealets gjennomsnittlige perlediameter til rotasjonshastigheten genereres ³² .
8. Start timeren og emulger alginatet i 12 minutter.
9. Tilsett 10 ml tHan olje- og eddiksyreoppløsning for å syre emulsjonen, oppløse CaCO3 og dermed fysisk tverrbind alginatet til gelerte perler. Tillat 8 minutter for dette forsurende trinnet.

3. Bead Recovery

1. Reduser omrøringshastigheten til 400 rpm. Tilsett 40 ml prosessbuffer blandet med 10% medium for å øke pH og for å forårsake faseinversjon.
2. Stopp omrøringen 1 min senere og overfør blandingen til 50 ml sentrifugerør. Skyll spinnerflasken med ytterligere 20 ml medium og legg dette til røret. Aspirer så mye vannfase som mulig fra spinnerflasken før aspirering av oljefasen for å minimere perlekontakt med oljefasen.
   MERK: Bruk en pipette med stor boring ( f.eks. 25 ml pipette) på dette trinnet og fra dette punktet for å unngå skade på perlene. For mindre volumer, kan perlesuspensjonen også bli manipulert med kuttpipettespisser. For å få slike tips, kutt du enden av pipettespissen med saks hvIle har øyevern.
3. Sentrifuger rørene i 3 minutter ved 630 xg for å akselerere perleoppgjør og faseseparasjon.
4. Fjern olje og overflødig vandig løsning ved å aspirere med en Pasteur pipette.
5. Vask perlene minst en gang med medium. Filtrer perlesuspensjonen på 40 μm nyloncellestrømmer, og aspirer overflødig væske assosiert med perlene fra under silen. Overfør perlene til et kjent volum medie ved hjelp av en steril spatel.
   MERK: Mindre eller større porestørrelsesfiltre kan brukes i dette trinnet, avhengig av målet minimale perle diameter. Imidlertid anbefales tyngdekraftfiltrering i stedet for trykkdrevet filtrering gjennom sub-mikron porestørrelsesfiltre for å unngå skade på perlene.
6. Mål volumvolumet for volumet per volum (volum etter å ha tilsatt perlene, minus volumet før du legger perlene) og fyll opp mediet for å oppnå ønsket perle: total volumforhold, som vanligvis er 1: 5 eller 1 ml perler i4 ml medium. Fra dette punktet må du alltid bruke store borepipetter for å unngå skade på perlene.
7. Overfør de innkapslede cellene til T-kolber for in vitro- kultur eller transplantasjonsforsøk.

4. Kvalitetskontroll og applikasjoner

MERK: For å sikre innkapslet celle- og perlekvalitet, skal perlestørrelsesfordelingen og celleoverlevelsen etter prosessen kvantifiseres. Omvendt gelen for å gjenvinne cellene fra perlene for videre analyse utføres vanligvis.

1. For å vurdere perlestørrelsesfordelingen, flekker perlene med toluidinblå-O.
   1. Legg 0,5 ml perler i 4 ml prosessbuffer inneholdende 10% komplett medium.
   2. Tilsett 500 μl av en 1 g / l toluidinblå oppløsning fremstilt i prosessbuffer.
   3. Inkuber i 60 minutter i et konisk rør på en roterende shaker ved 50 rpm.
   4. Tilsett 5 ml prosessbuffer inneholdende 10% komplett medium og immedOverfør perlene og løsningen til en petriskål og kjøp bilder på et lav forstørrelsesmikroskop eller ved hjelp av et håndholdt digitalkamera. Hvis nødvendig, plasser Petri-tallerken på en lysboks før du får bilder med et håndholdt kamera for å forbedre kontrasten og unngå skygger.
   5. Utfør bildeanalyse for å kvantifisere perlestørrelsesfordelingen som tidligere beskrevet ³² , for eksempel ved hjelp av bildeanalyse freeware ³⁶ .
2. For å vurdere celleoverlevelse kvalitativt, flekker cellene ved bruk av etidium homodimer for å identifisere døde celler og calcein AM for å identifisere levende celler.
   1. Tilsett 1 volum perler til 4 volumer prosessbuffer inneholdende 10% komplett medium.
   2. Tilsett riktig mengde calcein AM og ethidium homodimer stamløsninger for å oppnå henholdsvis 4 μM og 2 μM konsentrasjoner. Generer single stain kontroller ved å legge bare ett av reagensene til noen perle prøver.
   3. Inkuber perlene på is i 20 minutter.
   4. Plasser løsningen mellom et lysbilde og deksel med et mellomrom som en o-ring for å unngå å komprimere perlene.
   5. Fortsett til fluorescensmikroskopi. Bruk single stain kontrollene for å vurdere fluorescens bløt gjennom. Velg passende fluorescensfiltre basert på eksitasjons- / utslippsbølgelengdene assosiert med calcein AM (494/517 nm) og etidium homodimer bundet til DNA (528/617 nm).
3. For å gjenvinne cellene fra perlene for videre analyse, degeler alginatet ved hjelp av citrat eller en annen chelateringsløsning.
   1. Klargjør en nedbrytningsoppløsning inneholdende 55 mM citrat, 10 mM HEPES og 95 mM NaCl ved pH 7,4.
   2. Bland denne løsningen med 10% medium, og tilsett deretter 1 ml alginatperler til 9 ml av blandingen.
   3. Degel perlene på is med 75 rpm omrøring i 20 minutter.
      MERK: Cellene kan nå brukes til analyse eller fjernes fra den nedbrytte alginatoppløsningenIon ved sentrifugering. For eksempel kan cellens levedyktighet etter nedbrytning kvantifiseres ved Trypan Blue-farging. Alternativt kan cellene sentrifugeres og vaskes, etterfulgt av mRNA, DNA og / eller proteinprøvetaking og analyse.

Representative Results

Ved slutten av emulgerings-og intern geleringsprosessen, bør et vulstvolum lik det innledende alginat og celleblandingsvolumet utvinnes. Perlene bør være svært sfæriske med få feil ( figur 3 ). Perlene skal være tilstrekkelig sterke til å tåle pipettering gjennom storboringspipetter. Ved høye alginatkonsentrasjoner kan innkapslede olje- eller luftdråper observeres i perlene. Dette oppstår sannsynligvis på grunn av innfesting av olje i alginatdråper under emulgeringstrinnet (olje / vann / olje-dobbeltemulsjon). I våre hender representerte disse perlene en liten brøkdel (<5%) av vulstvolumet, og de fleste av disse perler ble fjernet mens aspirering av oljen ble under vulstgjenvinningstrinnet på grunn av deres lavere tetthet.

Fig. "> Figur 3 : Representative 5% alginatperler inneholdende innkapslede βTC3-celler oppnådd ved emulgeringen og den indre geleringsprosessen. Fase-kontrastbilde av 5% alginatperler inneholdende 5 x 10 ⁶ p3C3 celler / ml perler. Vennligst klikk her for å se en større Versjon av denne figuren.

Størrelsen på perlene som er oppnådd, vil ikke være ensartet - dette er en egen egenskap ved omrørte emulsjoner ( figur 4A ). Under emulgering i turbulent strømning virker trykkfluktuasjoner for å forstyrre dråpene ^{37 , 38} , motvirke overflatespenningen og de viskøse kreftene i den dispergerte fase ³⁹ . Viskøse krefter er ikke ubetydelige hvis viskositeten til den dispergerte fasen er mye høyere enn den for denE kontinuerlig fase. Forutsatt at den maksimale lokale energidissipasjonshastigheten er proporsjonal med den gjennomsnittlige energidissipasjonshastigheten i fartøyet, kan den maksimale stabile dråpediameter d _max (hvis >> enn Kolmogorov-skalaen) beregnes som følger ^{39 , 40 , 41 , 42}

Hvor ρ _c er tettheten av den kontinuerlige fasen, er e den gjennomsnittlige energidissipasjonshastigheten i fartøyet, σ er grensespenningen mellom de to væskene, μ _d er viskositeten til den dispergerte fase og C er en proportionalitetskonstant. Når overflatespenningskrefter dominerer over viskøse krefter, forenkler høyre side til C , mens hvis de viskøse kreftene dominerer, forenkles det til:

I omrørte beholdere er energitilførselen under turbulente strømningsskala proporsjonal med effektinngangen per volum, dvs. til N _i ³ D _i ² , hvor N _i er omrøringshastigheten og D _i er hjulets diameter. Derfor, i kombinasjon med ligning 1 og gitt en konstant D _i , dersom overflatespenningskreftene dominerer, antas d _max å være proporsjonal med N _i ^-1,2 ( Figur 4B ), mens den er proporsjonal med N _i ^-0,75 dersom viskøse krefter i Perler dominerer som hovedretentiv kraft. Figur 4B og 4C antyder at grenseffekter bestemmer dRopletstørrelse for lave alginatkonsentrasjoner, mens viskøse krefter blir mer dominerende ved høyere alginatkonsentrasjon ( f.eks. 5% for alginat nr. 3 beskrevet i materialetabellen). Siden det kan være upraktisk å bestemme d _max eksperimentelt, har høye kvantileverdier ( f.eks. Den 95. kvantilen) av diameteren eller overflateområdets midlere diameter ( d ₃₂ ) blitt brukt i stedet, da de generelt er proporsjonale med d _max ⁴³ .

Før innkapsling av celler anbefales det at en kurve av d ₃₂ som en funksjon av N blir generert ( Figur 4B ). Denne kurven vil hjelpe til med å velge den tilstrekkelige N _{i for} å oppnå en ønsket gjennomsnittlig perle størrelse. En ny standardkurve vil også sannsynligvis være nødvendig for forskjellige partier olje eller alginat, eller hvis alginatkoncentratetTration er endret. Avhengig av beholdergeometrien og på alginatkonsentrasjonen, bør det oppnås et relativt bredt spekter av gjennomsnittlige perlediametere. For eksempel kan d ₃₂ verdier mellom 200 pm og> 1 mm oppnås ved anvendelse av 2% ( figur 2C i Hoesli et al. ³² ) til 5% alginat ( figur 4 ) ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor.

Figur 4 : Beadstørrelsesfordeling. ( A ) Toluidin blå-O-farget 5% alginatperler. ( B ) d ₃₂ som en funksjon av omrøringshastigheten ( Ni ) for 1,5% og 5% alginatperler ved bruk av en 50:50 blanding av alginater nr. 1 og nr. 2 (se tabell over materialer). Et enkelt punkt er vist for 5% algiNate perler. ( C ) d ₃₂ som en funksjon av N _i for 2% og 5% alginat nr. 3 (se tabell over materialer). Feilbarene representerer standardavviket for perleformatene i en prøve (N> 150 perler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Celleoverlevelsen fra emulgerings-og intern geleringsprosessen avhenger hovedsakelig av omfanget og varigheten av pH-dråpet som oppleves av cellene. Ved å bruke prosessen beskrevet i denne videoen ble 76 ± 2% βTC3 celleoverlevelse målt ³¹ . Ved innkapsling av dispergerte celler ved 10 ⁵ celler / ml alginat til 10 ⁷ celler / ml alginat-seedettheter, bør alle perler inneholde celler. Når innkapsling av celleklynger som bukspyttkjertelceller, kan en delmengde av perler forventes å være empty. Figur 5 viser typiske levende celle- / dødcellefargingsresultater oppnådd ved anvendelse av denne prosessen. Høyere celleoverlevelse kan oppnås ved å øke prosessbufferkapasiteten og ved å redusere varigheten av forsurende trinn. For eksempel ble 90 ± 2% MIN6-celleoverlevelse oppnådd ved bruk av 60 mM MOPS (3- (N-morfolino) propansulfonsyre) som prosessbufferen og ved å redusere den totale prosesstid til 4 min ³² . Imidlertid ble de dannede perler signifikant sterkere med 10 mM HEPES-prosessbufferen enn med 60 mM MOPS-prosessbufferen på grunn av de økte mengder Ca ²⁺ frigjort ved lavere pH ³¹ . Både den korte MOPS-prosessen og den lengre HEPES-prosessen bør generere perler som er tilstrekkelig stabile for> 2 uker in vitro- kultur eller transplantasjon. Perler kan imidlertid svulme eller degel helt i løsninger med lavt kalsium eller med høye chelatorkonsentrasjoner (for eksempel, Kalsiumfri fosfatbuffet saltoppløsning).

For innkapslede MIN6-celler dyrket in vitro , dannes synlige celleaggregater etter ~ 5-7 dager in vitro immobilisert celleutvidelse og ~ 150 μm diameter sfæroider kan høstes etter 2 uker. Vekstraten for alginat-immobiliserte celler forventes å være lavere enn i ikke-immobiliserte kulturer, spesielt for geler med høyere algininkonsentrasjon eller høyere guluronsyreinnhold.

Figur 5 : Innkapslede celler umiddelbart etter prosessen. ( A ) Levende celle (grønn, calcein AM) og dødcelle (rød, etidium homodimer) farging av innkapslede celler. ( B ) Fase kontrast bilde av samme perle. MIN6-cellene ble innkapslet i 2%Alginatperler ved bruk av 12 minutter emulgeringen, 8 minutter surgjøring og en 10 mM HEPES buffer som beskrevet i denne protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Ulike trinn (vist i figur 2 ) under den interne geleringsreaksjonen kan begrense den totale kinetikken. For kalsiumkarbonatkorn større enn ~ 2,5 μm, har karbonatoppløsningen vist seg å være begrensningsbegrensende ^{26 , 44} . Syringstrinnet som fører til intern kalsiumfrigivelse har også vist seg å være den kritiske prosessvariabel som påvirker celleoverlevelse ³² . Betingelsene som fører til intern gelering er derfor avgjørende både for perlekvalitet og celleoverlevelse. Avhengig av den endelige søknaden for perlene, kan forskjellige optimale prosessforhold velges. For eksempel kan en høyere pH-reduksjon ( f.eks. Ved bruk av 10 mM HEPES for å buffere alginatoppløsningen) være ønskelig for transplantasjonsapplikasjoner hvor den langsiktige stabiliteten av perlene er avgjørende. På den annen side, en lavere pH-reduksjon ( f.eks. Ved bruk av 60 mM MOPS å buffeR alginatoppløsningen) kan være å foretrekke for in vitro applikasjoner.

I tillegg til å justere nivået og varigheten av surgjøring, kan andre prosessendringer forutse. For eksempel kan andre omrørte beholderkonfigurasjoner, alginatkonsentrasjoner, prosessbuffere, organiske faser og surgjørende midler anvendes. Som diskutert tidligere kan den gjennomsnittlige vulststørrelsen lett justeres ved å endre omrøringshastigheten under emulgeringstrinnet. I tillegg kan lengre emulgeringstider føre til mindre perle størrelser, men kan føre til redusert celle levedyktighet. Publikasjonene fra Poncelet et al. ^{25 , 26 , 45} og Hoesli et al. ^{31 , 32} har testet og diskutert noen av disse alternativene.

Små endringer i protokollen beskrevet ovenfor kan ha en dyp innvirkning påPerlegenerering, perlekvalitet og celleoverlevelse. Tabell 1 gir en feilsøkingsguide for å forstå og løse problemer som kan oppstå.

Problem	Typisk årsak	Foreslåtte løsninger
Pumpehjulet stopper roterende under alginat- eller sur olje-tilsetning	Magnetfeltet er utilstrekkelig for tilstrekkelig blanding eller pumpehjulet er feiljustert	Sørg for at spinnerflasken er sentrert på magnetplaten og festet på platen i en optimal posisjon før tilsetning av alginatblandingen. Test meget høy omrøringshastighet og deretter redusert til ønsket omrøringshastighet før tilsetning av alginatblandingen.
		Pass på at pumphjulet er godt justert og stabilt. For BelLino spinnerflaskene, sørg for at pumpehjulet holdes fast på plass med bolter på begge sider av spinnerflaskekappen. Pass på at pumpehjulets bevegelse er begrenset til radialretningen (pumpehjulet skal ikke vri på akselen).
Ingen perler oppnådd	Alginatet ble feil emulgert	Sørg for at alginatmikrodråper er synlige under emulgeringen. Hvis ikke, bekreft at oljefase-tettheten og karrieregeometrien 23 er lik de som er beskrevet i denne protokollen. En tett oljefase eller beholdergeometri som ikke gir tilstrekkelig lokal energidissipasjon, kan ikke tillate riktig alginatemulgering.
Ingen perler oppnådd	Den interne geleringen oppsto ikke	En vanlig feil er ufullstendig oppløsning av eddiksyre i oljefasen. Sørg for at syreoljeblandingen er tilstrekkelig vortexet og ingen eddiksyre blir observert vedBunnen av røret.
		Hvis pumpehjulet ikke når oljen, kan mer olje tilsettes før tilsetning av alginatet. Imidlertid bør mengden eddiksyre justeres i henhold til følgende ligning: Hvor 1 er olje / vannfaseforholdet før modifikasjoner (f.eks. 0,525 for 10,5 ml alginat i 10 ml olje + 10 ml sur olje) 2 er olje / vannfaseforholdet etter modifikasjoner til protokollen, og Dow er eddiksyrefordelingskoeffisienten mellom de to faser. Denne fordelingskoeffisienten kan måles eksperimentelt eller tilnærmet av verdier hentet fra litteraturen. For eksempel er fordelingskoeffisienten av eddiksyre mellom heptan og vann 46 0,011.
Ingen perleEr oppnådd, eller perler er mekanisk ustabile	Alginatoppløsningen med nullskjær er under 0,004 Pa · s eller over 112 Pa · s	På grunn av den høye batch-to-batch variabiliteten av alginatpartier, anbefales det å måle viskositeten til forskjellige konsentrasjoner av alginatløsninger. Kombinasjonen av et høyviskositetsparti med lavviskositetsparti kan være nødvendig for å nå en målviskositet. For den 5% LVM- og MVG-blandingen som ble benyttet her, var nullskjæringsviskositeten 3,3 Pa · s. Det bør bemerkes at alginater med for korte guluronsyreflekslengder eller korte samlede kjedelengder muligens ikke tillater geldannelse.
Perlene er for store eller for små	Omrøringshastigheten under emulgeringen er for lav eller for høy for alginatkonsentrasjonen eller viskositeten som benyttes	Økende turbulens ved å øke omrøringshastigheten eller legge til baffler vil redusere perlestørrelsen. Alginatkonsentrasjonen, tempEratur, fartøyets og impeller geometri vil alle påvirke perlen størrelse oppnådd.
Mange brutte perler blir observert	Kraftig perlehåndtering, skade under det interne geleringstrinnet eller utilstrekkelig vulststyrke.	Mekanisk skade på perlene kan føre til beadbrudd når intern gelering er påbegynt. Reduser agitasjonshastigheten umiddelbart før surgjøringstrinnet og sørg for at perlene håndteres forsiktig ved å bruke 25 ml pipetter eller 1000 μL pipetter med kuttespisser. Hvis skadede perler blir observert selv med forsiktig håndtering og redusert agitasjon under surgjøring, kan perlestyrken være utilstrekkelig. Dette kan skyldes utilstrekkelig guluronsyreinnhold eller ufullstendig gelering (f.eks. Utilstrekkelig forsuring).
Lav celle levedyktighet	Første prosess pH for høy eller endelig pH for lav	Overlevelse av mammaliancelleprosesser kan økes ved å begrense pH-dråpet og surgjøringstiden
Lavcellens levedyktighet i de mindre perlene	Utilstrekkelig alginatoppløsningsbufferkapasitet	En større pH-dråpe forventes i de mindre perlene enn i de større perler på grunn av det større overflate / volumforholdet mellom disse perlene. Siden eddiksyre tilsatt til emulsjonen er begrenset, forutses høyere eddiksyrekonsentrasjoner i mindre perler for den samme CaCO3-konsentrasjonen. Økning av alginatoppløsningsbufferkapasiteten (f.eks. Ved bruk av 60 mM MOPS i stedet for 10 mM HEPES) kan øke celleoverlevelse i de mindre perler 32 . Små perler med høye celletab kan fjernes selektivt ved filtrering eller sedimentering uten å påføre store volumetriske tap.
JegKomplett CaCO3 oppløsning	Utilstrekkelig forsuring eller forsuringstid. Vær oppmerksom på at dette problemet kanskje ikke er problematisk hvis perle stabilitet er tilstrekkelig.	Ufullstendig CaCO3 oppløsning er observert i de større perler som følger denne protokollen 32 . Omfanget av CaCO 3 oppløsning kan variere avhengig av CaCO 3 kornstørrelsen, pH-dråpet under prosessen, varigheten av pH-dråpet, samt alginatkonsentrasjonen som anvendes. Dette problemet betraktes ikke som problematisk så lenge perlemekanisk stabilitet er tilstrekkelig for den ønskede applikasjonen. For å øke vulstens kryssbinding, sørg for at CaCO 3- kornet er tilstrekkelig lite (~ 2,5 μm). Sonicating CaCO 3 suspensjonen kan bidra til å forstyrre aggregerte korn 26 . Ved meget lave eller høye alginatkonsentrasjoner kan det være nødvendig med justeringer i CaCO3 konsentrasjonen. Til slutt, chelators eller løsninger med lavtNivåer av divalente ioner vil føre til gradvis tap av Ca 2+ i gelen. Hvis gradvis tap av perle mekanisk stabilitet observeres, kontroller at perlenlagring eller kulturbuffer inneholder> 2 mM Ca 2+ .

Tabell 1: Feilsøkingsveiledning. Liste over problemer, sannsynlige årsaker og potensielle løsninger.

Potensielle begrensninger av emulgeringen og den interne geleringsprosessen for in vitro- kultur av pattedyrceller og transplantasjonsapplikasjoner inkluderer: (1) nødvendigheten av forbigående eksponering for lav pH, (2) behovet for å fjerne resterende olje, (3) polydisperse perle størrelse Fordeling, (4) det potensielle skjærspenning under alginatdråpedannelse og (5) den høyere porøsiteten av internt gelerte perler sammenlignet med eksternt gelerte perler ⁴⁷ .

Høycelleoverlevelse og funksjon av MIN6 og pTC3 er blitt oppnåddEtter prosessoptimalisering ³² . Imidlertid kan denne prosessen ikke være egnet for flere pH-sensitive celler. Fullstendig eliminering av olje fra perlene kan også være utfordrende, og FDA-godkjente oljetyper kreves for eventuelle kliniske anvendelser. Polydisperse perlestørrelsesfordelingen kan også være noe problematisk for immunoisoleringsapplikasjoner, hvor komplett celleinnkapsling og langsiktig celleoverlevelse er ønskelig. Mens små perlestørrelser kan føre til cellefremspring ⁴⁸ , kan store perler hindre næringsdiffusjon og / eller cellefunksjon ^{35 , 49} . På den annen side gir emulgeringsprosessen en interessant mulighet til å undersøke effekten av perlestørrelse på celleoverlevelse etter transplantasjon ved å generere både små og store perler i en enkelt prosess. Den gjennomsnittlige vulststørrelsen kan lett justeres ved å modifisere omrøringshastigheten durinG emulgeringstrinnet ( figur 4 ). Til slutt kan den høyere porøsiteten av internt gelerte perler også være skadelig for immunoisolering, hvor molekyler som antistoffer og cytokiner bør utelukkes fra perlene. Imidlertid tillater emulgeringsprosessen også perlegenerering fra meget konsentrerte alginatløsninger, og derved reduseres alginatperlens porestørrelse.

Emulgeringen og den interne geleringsprosessen er et interessant alternativ til dysebaserte innkapslingsapparater for laboratorier som ønsker å oppskalere celleinnkapsling eller mangler tilgang til en innkapslingsapparat. Denne prosessen er en robust og enkel metode for å immobilisere celler i alginatperler ved bruk av meget fortynnede eller meget konsentrerte alginatløsninger. Noen av de påfølgende eksperimenter som kan utføres med immobiliserte celler, er å bestemme effekten av alginatmatrisen på beslutninger om celleflyt, eller for å bestemme i hvilken grad perlene gir en barriere mellom transplantatD-celler og vertsimmunsystemet. Emulgerings- og intern geleringsmetoden gir en ny tilnærming til innkapsling av primære øyer i store batcher. Metoden tillater også celleinnkapsling i høyt konsentrerte alginatperler med redusert porøsitet og dermed redusert antistofftilgang til de innkapslede celler. Emulgerings- og intern geleringsmetoden gir derfor et nytt middel for å generere klinisk relevante mengder innkapslede terapeutiske celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).