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Bioengineering

सरल उत्तेजित पोत का उपयोग करने वाले अल्जीनेट मोती में स्तनधारी सेल का आदान-प्रदान

Published: June 29, 2017 doi: 10.3791/55280
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1, 1, 2
1Department of Chemical Engineering, McGill University, 2Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering, University of British Columbia, 3Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

Summary

इस वीडियो और पांडुलिपि में स्तनधारी कोशिकाओं को 0.5% से 10% एल्गिनेट मोती में समापित करने के लिए एक पायस-आधारित विधि का वर्णन किया गया है, जो साधारण संभ्रमित पोत का उपयोग करके बड़े बैचों में उत्पादित किया जा सकता है। इनक्रेमित कोशिकाओं को इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है या सेलुलर थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

Abstract

एल्गिनेट मोती में सेल इनकैप्सुलेशन का इस्तेमाल इन विट्रो में स्थिर सेल संस्कृति के लिए और साथ ही विवो में immunoisolation के लिए किया गया है । अग्नाशयी आइलेट के इनकैप्सुलेशन को व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है जो कि एलोोजेनिक या जीनोोजेनिक ट्रांसप्लांट्स में आइलेट अस्तित्व को बढ़ाने के साधन हैं। अल्जीनेट एनकैप्सुलेशन आमतौर पर नोजल एक्सट्रूज़न और बाहरी जेलेशन द्वारा प्राप्त की जाती है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, नलिका की नोक पर बने सेल युक्त एल्गनाइट बूंदों में द्विपक्षीय संबंधों वाले समाधान में आते हैं जो कि ionotropic alginate gelation के कारण होते हैं क्योंकि वे बूंदों में फैल जाते हैं। नोजल टिप पर छोटी बूंद के गठन की आवश्यकता को उच्चतम थ्रूपुट और एल्गनेट की एकाग्रता को प्राप्त किया जा सकता है जो प्राप्त किया जा सकता है। इस वीडियो में स्तनधारी कोशिकाओं को 0.5% से 10% एल्गनेट में 70% से 90% सेल अस्तित्व के साथ समापित करने के लिए स्केलेबल पायसीकरण विधि का वर्णन किया गया है। इस वैकल्पिक विधि से, कोशिकाओं और कैल्शियम कार्बोनेट वाले अल्जीनेट बूंदों को खनिज तेल में फेरबदल किया जाता है, folपीएच में कमी से आंतरिक कैल्शियम रिहाई और ionotropic alginate gelation के लिए अग्रणी। मौजूदा पद्धति से 20 मिनट के पायसीकरण के भीतर एल्गिनेट मोती के उत्पादन की अनुमति मिलती है। इनकैप्सिलेशन चरण के लिए जरूरी उपकरणों में अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध सरल उभारा बर्तन हैं।

Introduction

स्तनधारी कोशिका के इनकैप्सुलेशन को मोटे तौर पर प्रतिरक्षा अस्वीकृति 1 से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए या स्थिर सेल संस्कृति 2 , 3 , 4 के लिए तीन आयामी समर्थन प्रदान करने के साधन के रूप में अध्ययन किया गया है। अल्जीनेट मोती में अग्नाशयी आइलेट का उपयोग एल्ोजेनिक 5 , 6 या क्सीनोनिक 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 कृन्तकों में मधुमेह को उल्टा करने के लिए किया गया है। प्रकार 1 मधुमेह के इलाज के लिए समझाया अग्नाशयी आइलेट प्रत्यारोपण के पूर्व-क्लिनिकल और नैदानिक ​​परीक्षण चल रहे हैं 13 , 14 , 15 । प्रत्यारोपण के लिए आवेदन या बड़े स्केलइन इन विट्रो अबाधित सेल उत्पादन में, नोजल-आधारित मनका जनरेटर आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है। आम तौर पर, अल्जीनेट और कोशिकाओं का मिश्रण नलिका के माध्यम से पंप होता है जिससे बूंदों को उत्पन्न होता है जो एक उत्तेजित समाधान में पड़ते हैं जिनमें द्विपक्षीय संबंध होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बूंदों के बाहरी ज्वलन होता है। समाक्षीय गैस प्रवाह 16 , 17 , नोजल कंपन 18 , इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण 1 9 या घूर्णन तार 20 , नोक टिप पर छोटी बूंद बनाने की सुविधा प्रदान करते हैं।

परंपरागत मनका जनरेटर की मुख्य कमियां उनके सीमित थ्रूपुट और सोल्यूशन चिपचिपापन की सीमित रेंज हैं जो परिणामस्वरूप पर्याप्त बीड बनाने 21 उच्च प्रवाह दर पर, नोजल से निकलने वाला द्रव नोजल व्यास से छोटा बूंदों में टूट जाता है, आकार नियंत्रण कम करता है। मल्टी-नोजल बीड जेनरेटर का उपयोग थ्रूपुट बढ़ाने के लिए किया जा सकता है, लेकिननलिका में प्रवाह की समान वितरण और समाधान के उपयोग> 0.2 पास समस्याग्रस्त 22 है अन्त में, सभी नोजल-आधारित डिवाइसों से आइलेट्स को कुछ नुकसान पहुंचाने की संभावना है, क्योंकि नलिका का व्यास 100 माइक्रोन और 500 माइक्रोन के बीच है, जबकि ~ 15% मानव आईलेट्स 200 माइक्रोग्राम 23 से अधिक हो सकते हैं।

इस वीडियो में, हम स्तनधारी कोशिकाओं को ड्रॉप-बाय-ड्रॉप के बजाय एक एकल पायसीकरण चरण में बूंदों को बनाकर एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं। चूंकि मढ़वाया उत्पादन सरल हलचल वाले पोत में किया जाता है, इस विधि को छोटे (~ 1 एमएल) के लिए बड़े पैमाने पर (10 3 एल रेंज) मोल्ड उत्पादन कम उपकरण लागत 24 के साथ उपयुक्त है । इस पद्धति की वजह से अल्जीनेट चिपचिपाहट की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके उच्च गोलाकारता वाले मोतियों के उत्पादन की अनुमति देता है ( जैसे 20 मिनट) मनका पीढ़ी के समय इस पद्धति का मूल रूप से पोंसेलेट ए ए द्वारा विकसित किया गया थाएल। 25 , 26 और डीएनए 27 को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया, प्रोटीन 28 इंसुलिन 29 , और जीवाणु 30 सहित। हमने हाल ही में अग्नाशयी बीटा सेल लाइन 31 , 32 और प्राथमिक अग्नाशय के ऊतक 32 का उपयोग करते हुए स्तनधारी कोशिकाओं के इनकप्यूलेशन के लिए इन विधियों को अनुकूलित किया है।

इस पद्धति का सिद्धांत खनिज तेल में एलिननेट बूंदों से युक्त पानी में तेल के पायस को उत्पन्न करना है, जिसके बाद अल्जीनेट बूंदों ( चित्रा 1 ) का आंतरिक ज्वलन होता है। सबसे पहले एन्कैप्साइलन्ट ( जैसे, कोशिकाएं) एक अल्जीनेट समाधान में छितरी हुई है जिसमें प्रारंभिक प्रक्रिया पीएच पर कम विलेयता युक्त एक अच्छा अनाज कैल्शियम नमक होता है। एल्गिनेट मिश्रण तब एक उत्तेजित जैविक चरण में जोड़ा जाता है, जो एक पायसी बनाने के लिए होता है, आमतौर पर एक की उपस्थिति मेंपृष्ठसक्रियकारक। स्तनधारी सेल के मामले में, सीरम में मौजूद घटक सर्फटेक्ट्स के रूप में कार्य कर सकते हैं। इसके बाद, पीएच कम हो जाता है ताकि ऑक्साइड घुलनशील एसिड को जोड़कर कैल्शियम नमक को सुलझाया जा सके जिससे जलीय चरण में विभाजन हो। एक खनिज तेल / पानी विभाजन गुणांक <0.005 33 के साथ एसिटिक एसिड, तेल में पहले से भंग किया जाना चाहिए, फिर पायस में जोड़ा जाता है जहां इसे तेल चरण और मिश्रित चरण 34 में तेजी से विभाजित किया जाता है। चित्रा 2 चित्रा 2 रासायनिक प्रतिक्रियाओं और प्रसार है कि एसिडिफाइड और आंतरिक gelation कदम के दौरान जगह लेता है दिखाता है। अंत में, इनकॉप्लेटेड कोशिकाओं को चरण उलटा, चरण पृथक्करण द्वारा केन्द्रित किया जाता है, दोहराया धोने के चरणों और निस्पंदन द्वारा पुनर्प्राप्त किया जाता है। ये कदम इन विट्रो सेल संस्कृति और / या इनकैप्लेटेड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण में , गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के लिए मनका और सेल सैंपलिंग द्वारा पीछा किया जा सकता है।


चित्रा 1: स्तनपान कोशिकाओं को समापित करने के लिए पायसीकरण-आधारित प्रक्रिया के योजनाबद्ध। मोती को पहले खनिज तेल (चरण 1 और 2 में योजनाबद्ध) में एल्गनेट, सेल और सीएसीओ 3 मिश्रण के पायसीकारी द्वारा उत्पादित किया जाता है, जिससे एसिटिक एसिड (चरण 3) जोड़कर आंतरिक जलन पैदा हो सकता है। तब सूखने वाले मोती तेल से पृथक हो जाते हैं, जिससे एक चरण के व्युत्क्रम (चरण 4) ट्रिगर करने के लिए एक जलीय बफर जोड़कर, सेंटीफ्यूगेशन और तेल की आकांक्षा (चरण 5) के बाद, और फिर निस्पंदन (चरण 6) अंत में, फिल्टर पर एकत्र किए गए मोतियों को इन विट्रो संवर्धन या प्रत्यारोपण के लिए सेल संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2 चित्रा 2: प्रतिक्रियाओं और फैलाना कदम आंतरिक gelation दौरान होने वाली। (1) एसिटिक एसिड कार्बनिक चरण में जोड़ा जाता है और संवहन द्वारा अल्जीनेट की बूंदों में ले जाया जाता है। (2) जलीय चरण में एसिटिक एसिड विभाजन। (3) पानी की उपस्थिति में, एसिड गहरा नीला में दर्शाए गए CaCO 3 अनाज तक पहुंचने के लिए पृथक और फैलता है। (4) सीओ 2 + आयनों को जारी करने वाले सीओ 2 + आयनों के साथ H + आयनों का आदान-प्रदान किया जाता है। (5) कैल्शियम आयन तब तक फैल जाते हैं जब तक कि वे अखंडित अल्जीनेट से मुठभेड़ न करें, जिससे एलिकनेट श्रृंखलाओं के ionotropic क्रॉस-लिंकिंग के लिए अग्रणी हो। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

परंपरागत नोजल-आधारित सेल एनकैप्समलेटर्स के विपरीत, एक विस्तृत मनका आकार वितरण EXE हैउभरा हुआ पायसीकरण में छोटी बूंद गठन की व्यवस्था के कारण इस प्रक्रिया से निकल पड़े अनुप्रयोगों के एक सबसेट के लिए, यह आकार आकार वितरण समस्याग्रस्त हो सकता है उदाहरण के लिए, छोटे मोती में मनका सतह पर कोशिकाओं का एक बड़ा अंश उजागर हो सकता है। अगर पोषक तत्व ( उदा। ऑक्सीजन) की सीमाएं चिंता का विषय हैं, तो इन सीमाओं को बड़े मोती में बढ़ाया जा सकता है। संभ्रमित emulsification विधि का एक फायदा यह है कि औसत मनका आकार आसानी से आंदोलन के चरण के दौरान आंदोलन दर को बदलकर समायोजित किया जा सकता है। समरूप सेल प्रदर्शन पर मनका आकार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए व्यापक मनका आकार वितरण का भी फायदा उठाया जा सकता है।

पायसीकरण और आंतरिक ज्वलन द्वारा स्तनधारी कोशिका का कैप्पुलेशन, प्रयोगशालाओं के लिए एक दिलचस्प विकल्प है जो एक मनका जनरेटर से सुसज्जित नहीं हैं। इसके अलावा, यह विधि उपयोगकर्ताओं को प्रसंस्करण समय को कम करने का विकल्प देती है, या बहुत कम या बहुत उच्च अल्जीनेट कॉन्ट्रैडations।

नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल का वर्णन है कि 10 एमएम 4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) -1-पिपरीसिथेनएथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) बफर में तैयार किए गए 5% एल्गनेट समाधान के 10.5 एमएल में कोशिकाओं को कैप करने के तरीके। एलजीनेट में प्रत्यारोपण-ग्रेड एलवीएम (कम चिपचिपाहट के उच्च मान्नूरोनिक एसिड सामग्री) और एमवीजी (मध्यम चिपचिपाहट उच्च गुलूरोनिक एसिड सामग्री) एल्गनेट का 50:50 मिश्रण होता है। 24 एमएम के अंतिम एकाग्रता में कैल्शियम कार्बोनेट का प्रयोग भौतिक क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के रूप में किया जाता है। हल्की खनिज तेल जैविक चरण का गठन करते हैं, जबकि एसिटिक एसिड का उपयोग पायस को सिकुड़ने और आंतरिक जलन को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है। हालांकि, अल्जीनेट प्रकार और संरचना, साथ ही चयनित प्रक्रिया बफ़र वांछित अनुप्रयोग 32 पर निर्भर करते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ मोती का उत्पादन करने के लिए एल्गनेट प्रकार की एक किस्म (सामग्री की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया गया है

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Protocol

1. Alginate समाधान, सीएसीओ 3 सस्पेंशन और एसिडिफाइड ऑयल तैयार करें

  1. प्रक्रिया बफर और मध्यम तैयार करें
    1. 10 एमएम HEPES, 170 एमएम NaCl का उपयोग करने के लिए उच्च एकाग्रता alginate मोती उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया विशिष्ट प्रक्रिया बफर तैयार करें पीएच को 7.4 में समायोजित करें
    2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 6 मिमी ग्लूटामाइन, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डल्बेकेडो के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) का उपयोग करके ठेठ संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  2. 1.17 में मोती में अंतिम वांछित एकाग्रता में एल्नेटेट स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. सबसे पहले, एलिननेट पाउडर की उचित मात्रा का वजन। उदाहरण के लिए, 50:50 एलवीएम और एमवीजी अल्जीनेट के साथ 5% अल्जीनेट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 0.583 ग्राम एलवीएम एलिननेट पाउडर और 0.583 ग्राम एमवीजी एलिननेट पाउडर के संयोजन से कुल 1.17 जी सोडियम एल्नेटेट का वजन।
    2. एक एटोक में 20 एमएल प्रोसेस बफर रखेंएक चुंबकीय हलचल प्लेट पर लचीला ग्लास जार और ~ 200 आरपीएम पर आंदोलन। समाधान के लिए प्रगतिशील रूप से सोडियम अल्जेनेट पाउडर जोड़ें।
    3. कम गति पर रातोंरात क्रियान्वित समाधान छोड़ दें। यदि आवश्यक हो, तो फ्लास्क को हलचल प्लेट में जकड़ें।
    4. अगर समाधान अपूर्ण रूप से भंग हो गया है, तो बोतल को एक रोटरी मिक्सर पर जकड़ें और एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण जारी रखें।
    5. एल्गनीट समाधान को 30 मिनट के लिए एक पोत में आटोक्लाविंग करके जड़ें जो आधे से कम पूर्ण है। समाधान को प्राप्त करने से पहले तापमान 60 डिग्री सेल्सियस से कम होने की अनुमति दें।
    6. यदि आवश्यक हो, तो एल्गनेट समाधान को कमरे के तापमान तक पहुंचने से पहले आटोक्लेविंग के तुरंत बाद कण हटा दें, जबकि चिपचिपापन पर्याप्त रूप से कम रहता है।
  3. आंतरिक जेलेशन के लिए अंतिम वांछित एकाग्रता 21-गुना कैल्शियम कार्बोनेट निलंबन तैयार करें।
    1. CaCO 3 पाउडर बाहर वजन। उदाहरण के लिए, विज्ञापनडी 1 जी कैको 3 से 20 एमएल प्रोसेसर बफर 24 एमएम कैको 3 प्राप्त करने के लिए अंतिम जीलिंग एजेंट एकाग्रता के रूप में।
    2. 30 मिनट के लिए कैको 3 निलंबन आटोक्लेव करें
      नोट: सीसीओ 3 एकाग्रता बाइकार्बोनेट के कारण समय के साथ बदल जाएगी - सीओ 2 संतुलन। 10 से अधिक encapsulation प्रक्रियाओं के लिए एक ही स्टॉक कैको 3 निलंबन का उपयोग करने से बचें।
  4. पायसीकरण प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किए गए उभरे हुए पोत को आटोक्लेव करें। उपयोग करने से पहले स्पिनर फ्लास्क में शेष पानी के किसी भी निशान को हटा दें।
  5. Emulsification प्रक्रिया से ठीक पहले, अम्लीकृत तेल तैयार करें। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 11 एमएल खनिज तेल के साथ 44 μL एसिटिक एसिड भंग करें।
    नोट: एक आम गलती एसिटिक एसिड का अपूर्ण विघटन है। एसिटिक एसिड की थोड़ी मात्रा में पिपेट करने से बचें और यह सुनिश्चित करें कि एसिटिक एसिड पूरी तरह से तेल में दोहराया भंवरों से भंग हो जाता है।
    सावधानी: एसिटिक एसिड एक विषैला होता है डी अस्थिर एसिड इस अभिकर्मक को एक धूआं हुड के तहत संभाल लें और एसिटिक एसिड / ऑयल सॉल्यूशन को एक कंटेनर में रख दें, जब तक कि पायसीकरण कदम नहीं। अधिक जानकारी के लिए इस अभिकर्मक पर एमएसडीएस जानकारी देखें
  6. कक्ष के इनकैप्सुलेशन में जाने से पहले सभी समाधान कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।

2. एमिनेटेट बीड जनरेशन बाय इमल्सीफिकेशन एंड इंटरनल गेलेशन

  1. स्पिनर फ्लास्क में 10 एमएल लाइट खनिज तेल रखें और कम रोटेशन स्पीड पर आंदोलन शुरू करें (इस वीडियो में उपयोग किए जाने वाले स्पिनर फ्लास्क के लिए 250 आरपीएम)।
  2. यदि प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल की जाने वाली कोशिकाओं अनुयायित संस्कृतियों से हैं, तो कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए ट्रिप्सिन पर आवेदन करें। एफबीएस युक्त युक्त माध्यम या ट्रिप्सिन अवरोधक जोड़कर प्रतिक्रिया को समाप्त करें और सेल गणना के लिए नमूना एकत्र करें।
    1. ट्रांस्पैन नीले धुंधला हो जाने के बाद एक हेमोसैटमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता निर्धारित करें, जैसा कि पहले वर्णित हैAss = "xref"> 32
  3. 7 मिनट के लिए कोशिकाओं को 300 xg में अपकेंद्रित्र और सेल स्थिरीकरण के लिए वांछित माध्यम में एक बार उन्हें धो लें। यह सुनिश्चित करें कि इस माध्यम में एफबीएस या गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) जैसे पायसीटर शामिल हैं। उदाहरण के लिए, 10% FBS युक्त डीएमईएम का उपयोग करें
  4. मोती में वांछित अंतिम एकाग्रता 10.5 गुना प्राप्त करने के लिए एक ही माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करना।
  5. एल्गनेट समाधान के 9.9 एमएल के लिए 10.5 गुना केंद्रित सेल स्टॉक के 1.1 एमएल जोड़ें। फिर, कैको 3 के निलंबन के 550 μL को जोड़ने और कैरो 3 के एक भी वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक बाँझ रंग के साथ सरगर्मी करके मिलाएं।
  6. एग्रीनेट, सेल और सीएसीओ 3 मिश्रण के 10.5 एमएल को सिरिंज का उपयोग करके आंदोलनकारी तेल में तुरंत स्थानांतरित करें।
    नोट: बहुत चिपचिपा समाधान के लिए, हवा के बुलबुले से बचने के लिए मिश्रण को बहुत धीरे धीरे मारो और निकालें। कुछ मामलों में, फ्लास्क के मिश्रण को जोड़ने से बचने के लिए आंदोलन को रोकने के लिए बेहतर होगाप्ररित करनेवाला शाफ्ट पर एल्जेनेट entrainment
  7. अल्जीनेट, सेल और कैको 3 मिश्रण को तेल में जोड़ने के तुरंत बाद, आंदोलन दर में वृद्धि
    नोट: 5% एलवीएम के लिए: यहां इस्तेमाल किया जाने वाला एमवीजी एल्गनेट, 1025 आरपीएम की रोटेशन की गति लगभग 9 00 माइक्रोन व्यास के लिए उपयुक्त बनाने के लिए लागू की गयी थी, जो इन विट्रो संवर्धन 35 में उपयुक्त थी। उच्च रोटेशन की गति और कम अल्जीनेट सांद्रता, पिछले प्रकाशनों 25 , 32 में वर्णित के अनुसार औसत बीड व्यास के निचले स्तर तक पहुंच जाएंगे। प्ररित करनेवाला और पोत ज्यामिति में थोड़ा बदलाव, साथ ही साथ एल्गनेट गुण सामान्य बीड व्यास को प्रभावित कर सकते हैं। पोत कॉन्फ़िगरेशन या अल्जीनेट लॉट में प्रत्येक परिवर्तन के लिए, रोटेशन स्पीड के लिए सतह क्षेत्र पल औसत बीड व्यास से संबंधित एक मानक वक्र 32 उत्पन्न होनी चाहिए।
  8. टाइमर शुरू करें और 12 मिनट के लिए एल्गनेट को पायसीकृत करें
  9. 10 एमएल का टी जोड़ेंवह तेल और एसिटिक एसिड समाधान को पायस को सिकुड़ने के लिए, कैको 3 को भंग कर देता है और इसलिए शारीरिक रूप से एल्नेटेट को सिकुड़ा हुआ मोतियों से जोड़ता है। इस अम्लीकरण चरण के लिए 8 मिनट की अनुमति दें।

3. मोड़ रिकवरी

  1. आंदोलन दर को 400 आरपीएम में कम करें पीएच बढ़ाने और चरण उलटा पैदा करने के लिए 10% माध्यम के साथ मिश्रित प्रक्रिया बफर का 40 एमएल जोड़ें।
  2. 1 मिनट बाद आंदोलन को रोकें और मिश्रण को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अतिरिक्त 20 एमएल मध्यम के साथ स्पिनर फ्लास्क कुल्ला और ट्यूब में इसे जोड़ें। तेल के चरण के साथ मनका संपर्क को कम करने के लिए तेल चरण की महत्वाकांक्षा के पहले स्पिनर फ्लास्क से जितना संभव हो उतना जलीय चरण की इच्छाशक्ति।
    नोट: इस चरण में बड़े बोर विंदुक का प्रयोग करें ( जैसे 25 मिलीलीटर विंदुक) और इस बिंदु से मोतियों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए। छोटे संस्करणों के लिए, मनका निलंबन काट विंदुक युक्तियों से भी छेड़छाड़ किया जा सकता है। ऐसी युक्तियों को प्राप्त करने के लिए, कैंची के साथ विंदुक टिप का अंत कटौतीआईने नेत्र संरक्षण पहने।
  3. 3 मिनट के लिए ट्यूबों को 630 XG में अपकेंद्रित्र बनाने के लिए मनका निपटारा और चरण अलग करने में तेजी लाने के लिए।
  4. एक पाश्चर विंदुक के साथ महत्वाकांक्षी द्वारा तेल और अधिक जलीय समाधान निकालें।
  5. मध्यम के साथ कम से कम एक बार मोती धो लें। 40 सुक्ष्ममापी नायलॉन सेल स्ट्रेनर्स पर मनका निलंबन फ़िल्टर करें, और छलनी के नीचे से मोतियों से जुड़े अतिरिक्त तरल की तरक्की करें। एक बाँझ रंग के माध्यम से मादा की एक ज्ञात मात्रा में मोती को स्थानांतरित करें।
    नोट: न्यूनतम या बड़ा ताकना आकार फिल्टर का उपयोग इस चरण में किया जा सकता है, लक्ष्य न्यूनतम बीड व्यास के आधार पर। हालांकि, मोती हानि से बचने के लिए उप-माइक्रोन छिद्र आकार के फिल्टर के माध्यम से दबाव-निहित निस्पंदन के बजाय गुरुत्वाकर्षण निस्पंदन की सिफारिश की जाती है।
  6. मढ़वाया मात्रा के अनुसार मात्रा विस्थापन (मोती को जोड़ने के बाद मात्रा, मोती को जोड़ने से पहले मात्रा घटाएं) और ऊपरी मोती प्राप्त करने के लिए मध्यम ऊपर रखें: कुल मात्रा अनुपात, जो आम तौर पर 1: 5 या 1 एमएल मोती में होता है4 एमएल मध्यम इस बिंदु से, मोती को नुकसान पहुंचाने के लिए हमेशा बड़े बोर पिपेट का उपयोग करें।
  7. इन - इन विट्रो संवर्धन या प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए टी-फ्लास्क में समन्वित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।

4. गुणवत्ता नियंत्रण और अनुप्रयोग

नोट: समसामयिक सेल और मनका गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, प्रक्रिया के बाद मनका आकार वितरण और सेल का अस्तित्व मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। अधिक विश्लेषण के लिए मोतियों के भीतर से कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए जेल को पीछे करना सामान्यतः किया जाता है।

  1. मनका आकार के वितरण का आकलन करने के लिए, टोलिडिन ब्लू-ओ के साथ मोती दाग़ें।
    1. 10 एमएम प्रोसेस बफर में 0.5 एमएल मोती रखें, जिसमें 10% पूर्ण मध्यम है।
    2. प्रक्रिया बफर में तैयार एक 1 ग्रा / एल टोलुइडिन नीले समाधान के 500 μL जोड़ें।
    3. 50 आरपीएम पर रोटरी शेकर पर शंक्वाकार ट्यूब में 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. 5 एमएल प्रक्रिया बफर जोड़ें जिसमें 10% पूर्ण माध्यम और इमेड शामिल हैएक पेट्री डिश में मसालों और समाधानों को स्थानांतरित करना और एक कम-बढ़ाई हुई माइक्रोस्कोप पर छवियां या हाथ से पकड़े गए डिजिटल कैमरा का उपयोग करना। यदि आवश्यक हो, तो इसके विपरीत बढ़ाने और छाया से बचने के लिए हाथ से पकड़े गए कैमरे के साथ छवियों को प्राप्त करने से पहले एक पेटी डिश पर प्रकाश बॉक्स पर रखें।
    5. पहले वर्णित 32 के रूप में मढ़ी के आकार के वितरण को मापने के लिए छवि विश्लेषण करें, उदाहरण के लिए छवि विश्लेषण फ्रीवेयर 36 का उपयोग करें।
  2. सेल के अस्तित्व का गुणात्मक मूल्यांकन करने के लिए, जीवित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मृत कोशिकाओं और कैल्सन एएम की पहचान करने के लिए ethidium homodimer का उपयोग कर कोशिकाओं को दाग़ें।
    1. 10% पूर्ण माध्यम वाली प्रक्रिया बफर के 4 संस्करणों के लिए मोती का 1 मात्रा जोड़ें।
    2. क्रमशः 4 सुक्ष्ममापी और 2 माइक्रोन सांद्रता प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में कैल्सिन एएम और नैथिडियम होमोडीमर स्टॉक समाधान जोड़ें। कुछ मनका नमूने के लिए केवल एक अभिकर्मक जोड़कर एकल दाग नियंत्रण उत्पन्न करें।
    3. 20 मिनट के लिए बर्फ पर मोती सेते हैं
    4. मोतियों को संपीड़ित करने से बचने के लिए ओ-अंगूठी जैसे स्पेसर का उपयोग करते हुए एक स्लाइड और कंसलपट्टी के बीच का समाधान रखें।
    5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए आगे बढ़ें प्रतिदीप्ति खून बहने-के माध्यम से मूल्यांकन करने के लिए एकल दाग नियंत्रण का उपयोग करें। कैल्सेन एएम (494/517 एनएम) और डीएनए (528/617 एनएम) के लिए बंधे एथेडियम होमोडिमर से जुड़े उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के आधार पर उपयुक्त प्रतिदीप्ति फिल्टर का चयन करें।
  3. आगे के विश्लेषण के लिए मोती से कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए, सीगेट या अन्य चेलेटिंग समाधान का उपयोग करने वाले एजेनेट का डिगेल।
    1. पीएच 7.4 पर 55 मिमी सिट्रेट, 10 मिमी एचईपीईएस और 95 एमएम NaCl वाला डिगेलिंग समाधान तैयार करें।
    2. इस समाधान को 10% माध्यम से मिलाएं, और फिर मिश्रण के 9 एमएल के लिए 1 एमएल एलिननेट मोती जोड़ें।
    3. 20 मिनट के लिए 75 आरपीएम आंदोलन के साथ बर्फ पर मोती लगाओ
      नोट: कोशिकाओं को अब विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या degelled alginate solut से निकाला जा सकता हैआयन द्वारा सेंटीफ्यूगेशन। उदाहरण के लिए, degelling के बाद सेल व्यवहार्यता Trypan ब्लू धुंधला द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को केन्द्रित किया जा सकता है और धोया जा सकता है, इसके बाद एमआरएनए, डीएनए और / या प्रोटीन नमूनाकरण और विश्लेषण किया जा सकता है।

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Representative Results

पायसीकरण और आंतरिक छिद्र प्रक्रिया के अंत में, शुरुआती अल्जीनेट और सेल मिश्रण की मात्रा के समान एक मनका मात्रा वसूली जानी चाहिए। मोती कुछ दोषों ( चित्रा 3 ) के साथ बहुत गोलाकार होना चाहिए। मोती बड़े बोर pipettes के माध्यम से pipetting सामना करने के लिए पर्याप्त मजबूत होना चाहिए। मोती में उच्च अल्जीनेट सांद्रता में, अनाजयुक्त तेल या वायु बूंदों को देखा जा सकता है। यह संभवतः पायसीकरण चरण (तेल / पानी / तेल डबल पायस) के दौरान एल्गनेट बूंदों में तेल के प्रवेश के कारण होता है। हमारे हाथों में, मोती की मात्रा में ये मोती छोटे अंश (<5%) का प्रतिनिधित्व करते थे और मोती रिकवरी चरण के दौरान, उनके निचले घनत्व के कारण, तेल के दौरान महत्वाकांक्षी इन मोतियों को हटा दिया गया था।

चित्र तीन
अंजीर "> चित्रा 3 : प्रतिनिधि 5% एल्यूनानेट मोती जिसमें समापित βTC3 कोशिकाओं को पायसीकरण और आंतरिक छिद्र प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया गया है। 5 x 10 6 βTC3 कोशिकाओं / एमएल मोती वाले 5 % अल्जीनेट मोती की चरण विपरीत छवि। कृपया एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का संस्करण

प्राप्त मोतियों का आकार वर्दी नहीं होगा - यह हड़कंपे हुए पायस की एक आंतरिक विशेषता है ( चित्रा 4 ए )। अशांत प्रवाह में पायसीकरण के दौरान दबाव में उतार-चढ़ाव 37 , 38 की बूंदों को बाधित करने के लिए कार्य करता है, सतह के तनाव और विच्छेदन बलों को फैलाने वाले चरण 39 में बाधित करता है। चिपचिपा बलों गैर नगण्य हैं यदि छितराया हुआ चरण की चिपचिपाहारी वें की तुलना में बहुत अधिक हैई निरंतर चरण मान लें कि अधिकतम स्थानीय ऊर्जा अपव्यय दर पोत में औसत ऊर्जा अपव्यय दर के समानुपातिक है, अधिकतम स्थिर छोटी बूंद व्यास डी मैक्स (अगर कोलमोगोरोव पैमाने की तुलना में) की गणना 39 , 40 , 41 , 42 के अनुसार की जा सकती है
समीकरण 1
जहां ρ सी निरंतर चरण की घनत्व है, ε पोत में औसत ऊर्जा अपव्यय दर है, σ दो तरल पदार्थों के बीच अंतरीय तनाव है, μ डी फैलाने वाले चरण की चिपचिपाहट है और सी एक आनुपातिक स्थिरता है। सतह तनाव बल चिपचिपा बलों पर प्रबल होने पर, दाहिनी ओर सी को सरल बनाता है , जबकि अगर चिपचिपा बलों का प्रबल होना है तो यह सरल होता है:

उभड़ा हुआ जहाजों में, अशांत प्रवाह के नीचे ऊर्जा इनपुट प्रति यूनिट मात्रा प्रति विद्युत इनपुट के समानुपातिक है, अर्थात एन आई 3 डी 2 , जहां एन मैं आंदोलन दर है और डी आई इप्लोरर व्यास है। इसलिए, समीकरण 1 के साथ संयुक्त और एक निरंतर डी I दिया गया है, यदि सतह तनाव बलों ने डी मैक्स की प्रबलता को एन -1 -1.2 ( चित्रा 4 बी ) के आनुपातिक होने की भविष्यवाणी की है, जबकि एन आई -0.75 का आनुपातिक है अगर चिपचिपा बल मोती मुख्य धारणा शक्ति के रूप में प्रबल होते हैं आंकड़े 4 बी और 4 सी बताते हैं कि इंटरफेसियल प्रभाव डी को निर्धारित करते हैंकम अल्जीनेट सांद्रता के लिए छोटे आकार का आकार, जबकि चिपचिपा बल उच्च अल्जीनेट एकाग्रता ( जैसे सामग्री के तालिका में वर्णित # 3 एल्गनेट के लिए 5%) में अधिक प्रभावी हो जाते हैं। चूंकि यह डी अधिकतम प्रयोगात्मक निर्धारित करने के लिए अव्यावहारिक हो सकता है, व्यास का उच्च मात्रात्मक मान ( जैसे 95 वें परिमाण) या सतह क्षेत्र के क्षण का मतलब व्यास ( डी 32 ) का उपयोग किया जाता है, क्योंकि ये आम तौर पर डी अधिकतम 43 के आनुपातिक होते हैं।

कोशिकाओं को घेरने से पहले, यह अनुशंसा की जाती है कि एन 32 की एक कविका के रूप में एन आई का निर्माण ( चित्रा 4 बी ) उत्पन्न हो। यह वक्र एक वांछित औसत मनका आकार प्राप्त करने के लिए पर्याप्त एन आई का चयन करने में मदद करेगा। तेल या अल्जीनेट के अलग-अलग बैचों के लिए एक नया मानक वक्र की भी आवश्यकता होगी, या यदि अल्जीनेट कॉन्सनट्रेशन संशोधित है पोत ज्यामिति के आधार पर और अल्जीनेट सांद्रता पर, औसत मोटा व्यास की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला प्राप्त होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 2% ( चित्रा 2C Hoesli et al। 32 ) से 5% एल्गनेट ( चित्रा 4 ) के प्रयोग से 200 माइक्रोन और> 1 एमएम के बीच 32 मूल्यों को प्राप्त किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4 : मनका आकार वितरण। ( ए ) टोलुइडिन नीले-ओ दाग 5% alginate मोती। ( बी ) डी 32 आंदोलन दर ( एन आई ) के लिए 1.5% और 5% alginate मोती के 50:50 मिश्रण alginates # 1 और # 2 (सामग्री की तालिका देखें) के लिए के रूप में। 5% अल्जी के लिए एक बिंदु दिखाया गया हैनैट मोती ( सी ) डी 32 2% के लिए एन के एक समारोह के रूप में और 5% alginate # 3 (सामग्री की तालिका देखें)। त्रुटि सलाखों के नमूने (एन> 150 मोती) के भीतर मनका आकार के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पायसीकरण और आंतरिक छिद्रण प्रक्रिया से कोशिका का अस्तित्व मुख्य रूप से कोशिकाओं द्वारा अनुभव पीएच ड्रॉप की सीमा और अवधि पर निर्भर करता है। इस वीडियो में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, 76 ± 2% βTC3 सेल अस्तित्व 31 को मापा गया। जब 10 5 कोशिकाओं / एमएल एलिननेट से 10 7 कोशिकाओं / एमएल एलिननेट बीसिंग घनत्व में फैले हुए कोशिकाओं को फैलाया जाता है, तो सभी मोतियों में कोशिकाएं होनी चाहिए। जब अग्नाशयी कोशिकाओं के रूप में कोशिका समूहों का आवरण किया जाता है, तो मोती का एक सबसेट खाली होने की उम्मीद की जा सकती हैy। चित्रा 5 में इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए प्राप्त सामान्य जीवित कोशिका / मृत सेल धुंधला परिणाम दिखाई देता है। उच्चतर सेल अस्तित्व प्रक्रिया बफर क्षमता में वृद्धि करके और अम्लीकरण चरण की अवधि कम करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रक्रिया बफर के रूप में 60 मिमी मोप्स (3- (एन-मोर्फोलिन) प्रोपेनसल्फोनिक एसिड) का उपयोग करके 90 ± 2% MIN6 सेल अस्तित्व प्राप्त किया गया था और समग्र प्रक्रिया समय को 4 मिनट 32 तक घटा दिया गया था। हालांकि, पीएपी 31 में जारी सीए 2 + की बढ़ी हुई मात्रा की वजह से उत्पन्न मोतियों को 10 मिमी एचईपीईएस प्रक्रिया बफर के साथ काफी मजबूत किया गया था, जो 60 एमएम मोप्स प्रोसेस बफर के मुकाबले ज्यादा था। दोनों छोटी मोप्स प्रक्रिया और लंबे समय तक HEPES प्रक्रिया से मनकों को तैयार करना चाहिए जो कि इन विट्रो संस्कृति या प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर> 2 सप्ताह के लिए तैयार हों। हालांकि, मोती कम कैल्शियम या उच्च चेलेटर सांद्रता (उदाहरण के लिए) के साथ समाधान में पूरी तरह से सूज या गंज हो सकता है, कैल्शियम मुक्त फॉस्फेट-बफ़ेड खारा समाधान)।

इन विट्रो अबाधित सेल विस्तार में ~ 5-7 दिनों के बाद इन विट्रो , दृश्य कोशिकाओं में विकसित समसामयिक MIN6 कोशिकाओं के लिए और 2 सप्ताह के बाद ~ 150 माइक्रोन व्यास spheroids काटा जा सकता है। अल्जीनेट-अबाधित कोशिकाओं की वृद्धि दर गैर-स्थिर संस्कृतियों की तुलना में कम होने की उम्मीद है, विशेष रूप से ऊंचे अल्जीनेट एकाग्रता या उच्च गुलूरोनिक एसिड सामग्री वाले जैल के लिए।

चित्रा 5
चित्रा 5 : संसाधित कोशिकाओं को तुरंत प्रक्रिया के बाद ( ए ) लाइव सेल (हरा, कैल्सन एएम) और मृत कोशिका (लाल, नैथिडियम होमोडाइमर) समसामयिक कोशिकाओं के धुंधला हो जाना। ( बी ) एक ही मनका के चरण विपरीत छवि MIN6 कोशिकाओं को 2% में समझाया गया थाइस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 12 मिनट के पायस, 8 मिनट की अम्लताकरण और 10 मिमी HEPES बफर का उपयोग कर एग्जेनेट मोती। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

आंतरिक छिद्र प्रतिक्रिया के दौरान विभिन्न चरणों ( चित्रा 2 में दर्शाया गया) समग्र कैनेटीक्स सीमित कर सकते हैं। ~ 2.5 माइक्रोन से बड़ा कैल्शियम कार्बोनेट अनाज के लिए, कार्बोनेट विघटन की दर दर-सीमा 26 , 44 को दिखाया गया है। आंतरिक कैल्शियम रिलीज की ओर ले जाने वाले एसिडिफिकेशन चरण को सेल अस्तित्व 32 को प्रभावित करने वाली महत्वपूर्ण प्रक्रिया चर के रूप में दिखाया गया है। आंतरिक परिमाण की ओर बढ़ने वाली स्थिति इसलिए मनका गुणवत्ता के साथ-साथ सेल के अस्तित्व के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। मोतियों के लिए अंतिम आवेदन के आधार पर, विभिन्न इष्टतम प्रक्रिया शर्तों को चुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक उच्च पीएच ड्रॉप ( जैसे एल्नेटेट समाधान को बफर करने के लिए 10 एमएम HEPES का उपयोग करना) प्रत्यारोपण अनुप्रयोगों के लिए वांछनीय हो सकता है जहां मोतियों की दीर्घकालिक स्थिरता महत्वपूर्ण है। दूसरी तरफ, एक पीएच ड्रॉप कम होता है ( जैसे कि 60 एमएम एमओपीएस का प्रयोग बफ़ी तक करनाआर एल्नेटेट समाधान) इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए बेहतर होगा।

स्तर और अम्लीकरण की अवधि को समायोजित करने के अलावा, अन्य प्रक्रिया संशोधनों की कल्पना की जा सकती है। उदाहरण के लिए, अन्य संचरित पोत कॉन्फ़िगरेशन, अल्जीनेट सांद्रता, प्रक्रिया बफ़र्स, कार्बनिक चरण और एसिडिंग एजेंटों का उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि पहले चर्चा की गई, औसत मोती का आकार आसानी से आंदोलन के चरण के दौरान आंदोलन दर को बदलकर समायोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, लंबे समय तक emulsification के समय छोटे मनका आकार की ओर ले सकते हैं, लेकिन कम सेल व्यवहार्यता पैदा कर सकता है। पोंसेलेट एट अल द्वारा प्रकाशन 25 , 26 , 45 और होोसली एट अल 31 , 32 ने इन विकल्पों में से कुछ का परीक्षण किया और चर्चा की है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में थोड़ा बदलाव पर गहरा असर हो सकता हैमनका पीढ़ी, मनका गुणवत्ता और सेल अस्तित्व। तालिका 1 समस्याओं को समझने और हल करने के लिए एक समस्या निवारण मार्गदर्शिका प्रदान करता है।

मुसीबत विशिष्ट कारण सुझाए गए समाधान
इम्प्लेटर एल्जेनेट या एसिड तेल के अतिरिक्त दौरान घूमती रहती है पर्याप्त मिश्रण के लिए चुंबकीय क्षेत्र अपर्याप्त है या प्ररित करनेवाला शाफ्ट गलत तरीके से गुमराह किया हुआ है सुनिश्चित करें कि स्पिनर फ्लास्क मैग्नेटिक प्लेट पर अच्छी तरह से केंद्रित है और एल्नेटेट मिश्रण को जोड़ने से पहले इष्टतम स्थिति में प्लेट पर टेप किया जाता है। एग्जेनेट मिश्रण को जोड़ने से पहले उच्च आंदोलन दर का परीक्षण करें और फिर वांछित आंदोलन दर में कमी आई है।
सुनिश्चित करें कि प्ररित करनेवाला शाफ्ट अच्छी तरह से गठबंधन और स्थिर है। बेल के लिएएलसीए स्पिनर फ्लास्क, यह सुनिश्चित करें कि स्पिलर फ्लास्क कैप के दोनों ओर बोल्ट द्वारा प्ररित करनेवाला को मजबूती से रखा गया है। सुनिश्चित करें कि प्ररित करनेवाला आंदोलन रेडियल दिशा तक सीमित है (प्ररित करनेवाला शाफ्ट पर नहीं पहना चाहिए)
नहीं मोती प्राप्त अल्जीनेट गलत तरीके से पायसीकारी था सुनिश्चित करें कि एल्गिनेट माइक्रोड्रोपल्स पायसीकरण के दौरान दिखाई दे रहे हैं। यदि नहीं, तो सत्यापित करें कि तेल चरण घनत्व और पोत ज्यामिति 23 इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों के समान हैं। एक घने तेल चरण या पोत ज्यामिति जो पर्याप्त स्थानीय ऊर्जा अपव्यय प्रदान नहीं करता है, उचित एल्नेटनेट पायसीकरण की अनुमति नहीं दे सकता है।
नहीं मोती प्राप्त आंतरिक जेलिंग नहीं हुआ एक सामान्य त्रुटि तेल चरण में एसिटिक एसिड का अपूर्ण विघटन है। सुनिश्चित करें कि एसिड तेल का मिश्रण पर्याप्त रूप से भंवर है और कोई एसिटिक एसिड उस पर मनाया नहीं जाता हैट्यूब के नीचे
यदि प्ररित करनेवाला तेल तक नहीं पहुंचता है, तो अल्जीनेट जोड़ने से पहले अधिक तेल जोड़ा जा सकता है हालांकि, एसिटिक एसिड की मात्रा निम्नलिखित समीकरण के अनुसार समायोजित की जानी चाहिए:
समीकरण 3
कहा पे समीकरण 4 1 संशोधनों से पहले तेल / पानी के चरण अनुपात (10.5 एमएल एलिननेट के लिए 0.5 एमईएल + 10 एमएल एसिड तेल में)। समीकरण 4 2 प्रोटोकॉल के संशोधनों के बाद तेल / पानी का चरण अनुपात है, और डॉव दो चरणों के बीच एसिटिक एसिड वितरण गुणांक है। इस वितरण गुणांक को प्रयोगात्मक रूप से मापा जा सकता है या साहित्य से लिया मूल्यों के अनुमानित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हेप्टेन और पानी 46 के बीच एसिटिक एसिड का वितरण गुणांक 0.011 है।
कोई मोती नहींप्राप्त या मोती यंत्रवत् अस्थिर हैं अल्जीनेट समाधान शून्य-कतरनी चिपचिपाहट नीचे 0.004 पाल या 112 पाई के ऊपर है एल्गिनट लॉट के उच्च बैच-टू-बैच में परिवर्तनशीलता के कारण, एल्गनेट समाधानों के विभिन्न सांद्रता के चिपचिपापन को मापने के लिए सिफारिश की जाती है। कम चिपचिपाहट बैच के साथ एक उच्च-चिपचिपाहट बैच के संयोजन को एक लक्ष्य चिपचिपापन तक पहुंचने के लिए आवश्यक हो सकता है यहां 5% एलवीएम और एमवीजी मिश्रण का उपयोग किया गया, शून्य-कतरनी चिपचिपापन 3.3 पाई गई थी। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुत कम गुलुरोनिक एसिड ब्लॉक लंबाई या छोटी समग्र श्रृंखला लंबाई के साथ alginates जेल गठन की अनुमति नहीं दे सकता है।
मोती बहुत बड़ी या बहुत छोटी हैं पायस के दौरान आंदोलन की दर अल्जीनेट एकाग्रता या चिपचिपापन के इस्तेमाल के लिए बहुत कम या बहुत अधिक है आंदोलन दर को बढ़ाकर या चकरा देने से अशांति बढ़ने से मनका आकार कम हो जाएगा। अल्जीनेट एकाग्रता, अस्थायीनिकलता, पोत और प्ररित करनेवाला ज्यामिति सभी को मनका आकार प्राप्त होगा।
कई टूटे मोती मनाए जाते हैं हर्ष बीड हैंडलिंग, आंतरिक जेलेशन चरण या अपर्याप्त मनका शक्ति के दौरान क्षति। मोती को मैकेनिकल नुकसान से पहले गठबंधन की शुरुआत हो सकती है, जिससे मढ़वाया जा सकता है। एसिडिफिकेशन चरण के तुरंत पहले आंदोलन दर को कम करें और सुनिश्चित करें कि 25 एमएल पिपेट्स या कटौती युक्तियों के साथ 1000 μL pipettes का उपयोग करके मोतियों को धीरे-धीरे नियंत्रित किया जाता है। अगर क्षतिग्रस्त मोतियों को सावधानी से निपटने और अम्लीकरण के दौरान कम आंदोलन के साथ मनाया जाता है, तो मनका शक्ति अपर्याप्त हो सकती है। यह अपर्याप्त गुलूरोनिक एसिड सामग्री या अधूरा गिलिंग (जैसे अपर्याप्त अम्लीकरण) के कारण हो सकता है।
कम सेल व्यवहार्यता प्रारंभिक प्रक्रिया पीएच बहुत अधिक या अंतिम पीएच बहुत कम है पीएच ड्रॉप और एसिडिफिकेशन समय को सीमित करके स्तनधारी सेल प्रक्रिया का अस्तित्व बढ़ाया जा सकता है
छोटे मोती में कम सेल व्यवहार्यता अपर्याप्त अल्जीनेट समाधान बफरिंग क्षमता इन मोतियों के अधिक से अधिक सतह / मात्रा अनुपात के कारण बड़े मोती की तुलना में छोटे मोती में अधिक पीएच ड्रॉप की उम्मीद है। चूंकि पायस के लिए एसिटिक एसिड सीमित है, इसलिए उच्च एसिटिक एसिड सांद्रता को उसी माउंट के लिए छोटे मोती में अनुमानित किया जाता है। अल्जीनेट समाधान बफरिंग क्षमता बढ़ाना (जैसे 10 एमएम HEPES के बजाय 60 एमएम मोप्स का उपयोग करना) छोटे मोती 32 में सेल का अस्तित्व बढ़ा सकता है। उच्च सेल हानियों वाले छोटे मोती को बड़ी मात्रा में नुकसान होने के बिना निस्पंदन या अवसादन द्वारा चुनिंदा निकाला जा सकता है।
मैंअपूर्ण सीएसीओ 3 विघटन अपर्याप्त अम्लीकरण या अम्लीकरण का समय ध्यान दें कि अगर यह मस्तिष्क स्थिरता पर्याप्त है तो यह समस्या समस्याग्रस्त नहीं हो सकती है। अपूर्ण सीएसीओ 3 विघटन को इस प्रोटोकॉल 32 के बाद बड़े मोती में देखा गया है। कैको 3 का विघटन CaCO 3 अनाज के आकार के आधार पर भिन्न हो सकता है, प्रक्रिया के दौरान पीएच ड्रॉप, पीएच ड्रॉप की अवधि, साथ ही साथ एलजीनेट एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। इस समस्या को तब तक समस्याग्रस्त नहीं माना जाता है जब तक कि वांछित अनुप्रयोग के लिए मनका यांत्रिक स्थिरता पर्याप्त होती है। मनका क्रॉस-लिंकिंग बढ़ाने के लिए, सुनिश्चित करें कि सीएसीओ 3 अनाज पर्याप्त रूप से छोटा है (~ 2.5 माइक्रोन)। कैको 3 निलंबन को संक्रमित करने से समेकित अनाज 26 को बाधित करने में मदद मिल सकती है। बहुत कम या उच्च अल्जीनेट सांद्रता में, कैको 3 एकाग्रता में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। अन्त में, चेलेटर्स या कम के साथ समाधानद्विपक्षीय आयनों के स्तर से जेल में सीए 2 + के क्रमिक नुकसान हो सकता है। यदि मनका यांत्रिक स्थिरता का धीरे-धीरे नुकसान मनाया जाता है, तो पुष्टि करें कि मनका भंडारण या संस्कृति बफर में 2 मिमी सीए 2+ शामिल है

तालिका 1: समस्या निवारण मार्गदर्शिका समस्याओं की सूची, संभावित कारण और संभावित समाधान

स्तनधारी कोशिकाओं और प्रत्यारोपण के इन विट्रो संस्कृति के लिए पायसीकरण और आंतरिक जलन प्रक्रिया की संभावित सीमाएं शामिल हैं: (1) निम्न पीएच, (2) अवशिष्ट तेल को निकालने की आवश्यकता, (3) पॉलीइडेस्पेर्स बीड आकार वितरण, (4) अल्जीनेट छोटी बूंद के गठन के दौरान संभावित कतरनी तनाव और (5) बाहरी सुरीला मोतियों की तुलना में आंतरिक सुरीला मोतियों की उच्च porosity 47

उच्च सेल अस्तित्व और MIN6 और βTC3 का कार्य प्राप्त किया गया हैप्रक्रिया अनुकूलन के बाद 32 हालांकि, यह प्रक्रिया अधिक पीएच-संवेदनशील कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है। मोतियों से तेल का पूरा उन्मूलन भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) -प्राप्त तेल के प्रकारों को अंतिम नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है। पॉलिडिस्स्पर्स मनका आकार वितरण भी इम्यूनोइओलिओशन अनुप्रयोगों के लिए कुछ समस्याग्रस्त हो सकता है, जहां पूरा सेल इनकैप्सुलेशन और दीर्घकालिक सेल अस्तित्व वांछनीय है। जबकि छोटे मनका आकार सेल फलाव 48 हो सकता है , बड़े मोती पोषक तत्व प्रसार और / या सेल फ़ंक्शन 35 , 49 में बाधा डाल सकते हैं। दूसरी ओर, emulsification प्रक्रिया एक एकल प्रक्रिया में छोटे और बड़े मोतियों दोनों को पैदा करके प्रत्यारोपण के बाद सेल जीवित रहने पर मनका आकार के प्रभाव की जांच करने के लिए एक दिलचस्प अवसर प्रदान करता है। औसत मढ़क का आकार आसानी से आंदोलन दर दुरिन को संशोधित करके समायोजित किया जा सकता हैपायसीकरण चरण ( चित्रा 4 ) जी। अंत में, आंतरिक सूक्ष्मता वाले मोतियों की अधिक सरंक्षी भी immunoisolation के लिए हानिकारक हो सकती है, जहां एंटीबॉडी और साइटोकिन्स जैसे अणुओं को मोतियों से बाहर रखा जाना चाहिए। हालांकि, emulsification प्रक्रिया भी बहुत ध्यान केंद्रित alginate समाधान से bead पीढ़ी की अनुमति देता है, जिससे alginate मनका ताकना आकार को कम करने।

पायसीकरण और आंतरिक छिद्र प्रक्रिया प्रक्रिया के लिए प्रयोगशालाओं के लिए नोजल-आधारित एनकैप्साइलर्स के लिए एक दिलचस्प विकल्प है, जो कि सेल एनकैप्सुलेशन को बढ़ाना चाहते हैं या एक एनकैप्लुलेटर के लिए उपयोग की कमी रखते हैं। यह प्रक्रिया बहुत पतला या बहुत केंद्रित एल्नेटेट समाधानों का उपयोग करके एल्गिनेट मोतियों में कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए एक मजबूत और सरल विधि है। बाद के प्रयोगों में से कुछ जो अचल कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है सेल भाग्य के फैसलों पर एलगिनेट मैट्रिक्स के प्रभाव को निर्धारित करना है या यह निर्धारित करने के लिए कि मोती ट्रांसप्लेन्ट के बीच एक बाधा कैसे प्रदान करते हैंडी कोशिकाओं और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली। पायसीकरण और आंतरिक जलनाकरण पद्धति बड़े बैचों में प्राइमरी आइलेटों को आवृत करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस विधि से कोशिकाएं कम घनत्व के साथ अत्यधिक केंद्रित एल्गिनेट मोती में सांकेतिकरण की अनुमति देता है और इसलिए इनकैप्लेटेड कोशिकाओं तक एंटीबॉडी पहुंच कम हो जाती है। Emulsification और आंतरिक gelation विधि इसलिए समझाया चिकित्सीय कोशिकाओं की नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक मात्रा उत्पन्न करने के लिए एक नया साधन प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए emulsification प्रक्रिया और लॉरेन विल्किनसन पर जमीन-बिछाने के काम के लिए जिल ओसबोर्न का धन्यवाद करते हैं। हम डॉ। इगोर लाइकिक, डॉ टिमोथी जे किफर और डॉ। जेम्स डी। जॉनसन को उनके इनपुट और सहयोग के लिए धन्यवाद करते हैं। हम डायबेटे क्यूबेक, जेडीआरएफ, थीसेल, केंद्र क्विबेक्स सुर लेटे मैटिएरो फोनक्शनियल (सीक्यूएमएफ), नैचुरल विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (एनएसईआरसी), मानव आइलेट प्रत्यारोपण केंद्र और बीटा-सेल पुनर्जनन, कनाडाई स्टेम सेल नेटवर्क, माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च, ले फॉंड्स क्यूबेक्यूज़ डे ला रिकर्व ऑन ला प्रकृति और लेस टेक्नोलॉजीज और 865 वित्तीय सहायता के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade) Sigma A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM Life Technologies 11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin Thermo Fisher Scientific SH3039603
Glutamine Life Technologies 25030
Penicillin and streptomycin Sigma P4333-100ML
HEPES, cell culture tested Sigma H4034-100G
NaCl Thermo Fisher Scientific S271-1
Fine-grain CaCO3 Avantor Materials 1301-01 After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil Thermo Fisher Scientific O121-4 Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid Thermo Fisher Scientific A38-500 Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas Sigma CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm Thermo Fisher Scientific 08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes VWR 14673-043
Toluidine Blue-O Sigma T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks Bellco 1965-00100 The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed Bellco 7760-06005 The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter Innovatis Cedex AS20 This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box Artograph LightPad® PRO This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera Canon PowerShot A590 IS A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters Olympus IX81 Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software Molecular Devices Metamorph A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware CellProfiler Non-applicable A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

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References

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Hoesli, C. A., Kiang, R. L. J., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M. R., Piret, J. M. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).

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