Summary
Denna video och manuskript beskriver en emulsionsbaserad metod för inkapsling av däggdjursceller i 0,5% till 10% alginatpärlor som kan framställas i stora satser med användning av en enkel omrörd kärl. De inkapslade cellerna kan odlas in vitro eller transplanteras för cellterapiapplikationer.
Abstract
Cellinkapsling i alginatpärlor har använts för immobiliserad cellodling in vitro såväl som för immunoisolering in vivo . Inkapsling av bukspottskörtel har studerats i stor utsträckning som ett medel för att öka överlevnad av öl i allogena eller xenogena transplantationer. Alginatinkapsling uppnås vanligen genom munstycksexstrudering och yttre gelning. Med hjälp av denna metod faller cellhaltiga alginatdroppar bildade vid munstyckets spets i en lösning innehållande divalenta katjoner som orsakar jonotrop alginatgelering när de diffunderar i dropparna. Kravet på droppbildning vid munstyckspetsen begränsar den volymetriska genomströmningen och alginatkoncentrationen som kan uppnås. Denna video beskriver en skalbar emulgeringsmetod för inkapsling av däggdjursceller i 0,5% till 10% alginat med 70% till 90% cellöverlevnad. Genom denna alternativa metod emulgeras alginatdroppar innehållande celler och kalciumkarbonat i mineralolja, folSänkt av en minskning av pH vilket leder till inre kalciumfrigöring och jonotrop alginat gelering. Den nuvarande metoden möjliggör framställning av alginatpärlor inom 20 min emulgering. Den utrustning som krävs för inkapslingssteget består av enkla rörda kärl som är tillgängliga för de flesta laboratorier.
Introduction
Däggdjurscellinkapsling har studerats i stor utsträckning som ett medel för att skydda transplanterade celler från immunavstötning 1 eller för att tillhandahålla ett tredimensionellt stöd för immobiliserad cellodling 2 , 3 , 4 . Pankreasöppning i alginatpärlor har använts för att reversera diabetes i allogena 5 , 6 eller xenogena 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 gnagare. Prækliniska och kliniska prövningar av inkapslad öltransplantation i pankreatisk öre för att behandla typ 1-diabetes är pågående 13 , 14 , 15 . För transplantationsapplikationer eller större skalE- in vitro- immobiliserad cellproduktion används i allmänhet munstycksbaserade pärlgeneratorer. Typiskt pumpas en blandning av alginat och celler genom ett munstycke för att bilda droppar som faller i en omrörd lösning innehållande divalenta katjoner, vilket resulterar i dropparnas yttre gelning. Koaxialgasflödet 16 , 17 , munstycksvibration 18 , elektrostatisk avstängning 19 eller roterande ledningar 20 underlättar droppbildning vid munstyckspetsen.
De huvudsakliga nackdelarna med konventionella pärlgeneratorer är deras begränsade genomströmning och det begränsade intervallet av lösningsviskositeter som kommer att resultera i tillräcklig pärlbildning 21 . Vid höga flödeshastigheter bryter vätskan från munstycket upp i droppar som är mindre än munstyckets diameter, minskande storlekskontroll. Multi-nozzle pearl generatorer kan användas för att öka genomströmningen, menDen enhetliga fördelningen av flödet mellan munstyckena och användningen av lösningar> 0.2 Pas är problematisk 22 . Slutligen förväntas alla munstycksbaserade anordningar ge viss skada på holmar, eftersom diametern hos de använda munstyckena är mellan 100 | im och 500 | im, medan ~ 15% av mänskliga holmar kan vara större än 200 | im 23 .
I denna video beskriver vi en alternativ metod för inkapsling av däggdjursceller genom att bilda droppar i ett enda emulgeringssteg istället för droppe. Eftersom pärlproduktionen utförs i ett enkelt rört kärl, är metoden lämplig för små (~ 1 ml) till storskalig (10 3 L-serie) pärlproduktion med låga utrustningskostnader 24 . Denna metod möjliggör produktion av pärlor med hög sfäricitet med användning av ett brett spektrum av alginatviskositeter med korta ( t.ex. 20 min) pärlgenereringstider. Denna metod har ursprungligen utvecklats av Poncelet et al. 25 , 26 och användes för att immobilisera DNA 27 , proteiner 28 innefattande insulin 29 och bakterier 30 . Vi har nyligen anpassat dessa metoder till inkapslingen av däggdjursceller med användning av pankreatiska beta-cellinjer 31 , 32 och primär pankreatisk vävnad 32 .
Metoden är att generera en vatten-i-oljemulsion bestående av alginatdroppar i mineralolja, följt av intern gelering av alginatdropparna ( Figur 1 ). Först dispergeras inkapslingsmedlet (t ex celler) i en alginatlösning innehållande ett finkornigt kalciumsalt med låg löslighet vid det ursprungliga process-pH. Alginatblandningen tillsättes därefter till en omrörd organisk fas för att skapa en emulsion, vanligen i närvaro av atensid. I fallet med däggdjurscellinkapsling kan komponenter närvarande i serum fungera som ytaktiva ämnen. Därefter reduceras pH för att solubilisera kalciumsaltet genom att tillsätta en oljelöslig syra som skiljer sig in i vattenfasen. Ättiksyra, med en partikelkoefficient av mineralolja / vatten <0,005 33 , bör förupplösas i olja, sedan tillsättas till emulsionen, där den blandas i oljefasen och skiljer sig snabbt i vattenfasen 34 . Figur 2 illustrerar de kemiska reaktionerna och diffusionen som äger rum under försurningen och det inre geleringssteget. Slutligen utvinns de inkapslade cellerna genom fasinversion, fasseparation accelererad genom centrifugering, upprepade tvättsteg och filtrering. Dessa steg kan sedan följas av pärl- och cellprovtagning för kvalitetskontrollanalyser, in vitro- cellodling och / eller transplantation av de inkapslade cellerna.
Figur 1: Schematisk av emulgeringsbaserad process för inkapsling av däggdjursceller. Pärlor framställs först genom att emulgera en alginat-, cell- och CaCO3-blandning i mineralolja (steg 1 och 2 i schematisk), vilket utlöser intern gelning genom tillsats av ättiksyra (steg 3). De gelerade pärlorna separeras sedan från oljan genom tillsats av en vattenhaltig buffert för att trigga fasinversion (steg 4), följt av centrifugering och oljepåvirkning (steg 5) och därefter filtrering (steg 6). Slutligen överförs de pärlor som samlas på filtret till cellodlingsmedium för in vitro- odling eller för transplantation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
I motsats till konventionella munstycksbaserade cellinkapslare är en bred pärlstorleksfördelning expeCted från denna process på grund av mekanismen för droppbildning i omrörd emulgering. För en delmängd av program kan den här pärlstorleksfördelningen vara problematisk. Till exempel kan en större fraktion av celler exponeras vid vulstytan i mindre pärlor. Om begränsningar av näringsämnen ( t.ex. syre) är ett problem kan dessa begränsningar förvärras i större pärlor. En fördel med det omrörda emulgeringsförfarandet är att medelstrålstorleken lätt kan justeras genom att ändra omröringshastigheten under emulgeringssteget. Den breda pärlstorleksfördelningen kan också utnyttjas för att studera effekten av pärlstorleken på inkapslad cellprestanda.
Däggdjurscellinkapsling genom emulgering och inre gelering är ett intressant alternativ för laboratorier som inte är utrustade med en pärlagenerator. Vidare ger denna metod användarna möjlighet att minska behandlingstiden eller generera pärlor vid mycket låg eller mycket hög alginatkoncentrations.
Protokollet som beskrivs nedan beskriver hur man kapslar celler i 10,5 ml 5% alginatlösning framställd i 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert. Alginatet består av en 50:50 blandning av LVM (låg viskositet med hög viskositetshalt) och MGG (medelviskositet med hög guluronsyrahalt) alginat. Kalciumkarbonat vid en slutlig koncentration av 24 mM användes som det fysikaliska tvärbindningsmedlet. Lätt mineralolja utgör den organiska fasen, medan ättiksyra används för att surgöra emulsionen och utlösa inre gelering. Emellertid beror alginatypen och -kompositionen, liksom den utvalda processbufferten, på den önskade applikationen 32 . En mängd olika alginattyper (se tabell över material) har använts för att framställa pärlor med detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Alginatlösningen, CaCO3-suspensionen och den sura oljan
- Förbered processen buffert och medium.
- Förbered den typiska processbufferten som användes för att generera alginatpärlor med hög koncentration med användning av 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Justera pH till 7,4.
- Förbered det typiska odlingsmediet med användning av Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin.
- Förbered alginatförrådslösningen vid 1,17 gånger den slutliga önskade koncentrationen i pärlorna.
- Först väger lämplig mängd alginatpulver. Till exempel, för att erhålla en slutlig koncentration av 5% alginat med 50:50 LVM och MVG-alginat, väger ut totalt 1,17 g natriumalginat genom att kombinera 0,583 g LVM-alginatpulver och 0,583 g MVG-alginatpulver.
- Placera 20 ml processbuffert i en autocLådbar glasburk på en magnetisk omröringsplatta och omrör vid ~ 200 rpm. Lägg gradvis natriumalginatpulveret i lösningen.
- Låt lösningen omröra över natten med låg hastighet. Om nödvändigt, fäst kolven på rörplattan.
- Om lösningen är ofullständigt upplöst, fäst flaskan på en roterande mixer och fortsätt blanda vid 37 ° C i ytterligare 24 timmar.
- Sterilisera alginatlösningen genom att autoklavera lösningen under 30 minuter i ett kärl som är mindre än halvfullt. Låt temperaturen sjunka under 60 ° C innan du hämtar lösningen.
- Om nödvändigt, avlägsna partiklar genom att filtrera alginatlösningen kort efter autoklavering innan den når rumstemperatur, medan viskositeten förblir tillräckligt låg.
- Förbered kalciumkarbonatsuspensionen vid 21 gånger den slutliga önskade koncentrationen för intern gelning.
- Väg ut CaCO 3- pulvret. Till exempel annonsD 1 g CaCO3 till 20 ml processbuffert för att erhålla 24 mM CaCO3 som den slutliga gelningsmedelkoncentrationen.
- Autoklaver CaCO3-suspensionen i 30 minuter.
OBS: CaCO 3- koncentrationen kommer att förändras över tiden på grund av bikarbonat-CO 2 -jämvikten. Undvik att använda samma lager CaCO 3 suspension för mer än 10 inkapslingsförfaranden.
- Autoklavera det omrörda kärlet som används för emulgeringsprocessen. Före användning, ta bort eventuella spår av återstående kondensvatten i spinnkolven.
- Omedelbart före emulgeringsprocessen, bereda den surgjorda oljan. Upplös 44 ul ättiksyra per 11 ml mineralolja placerad i ett 50 ml koniskt rör.
OBS! Ett vanligt misstag är ofullständig upplösning av ättiksyra. Undvik att pipettera små mängder ättiksyra och se till att ättiksyra är helt upplöst i olja genom upprepad virvelbildning.
VARNING: ättiksyra är en giftig an D flyktig syra. Hantera detta reagens under en spishäll och håll ättiksyra / oljelösningen i en sluten behållare tills emulgeringssteget. Se säkerhetsdatabladets information om detta reagens för ytterligare information. - Låt alla lösningar nå rumstemperatur innan de går vidare till cellinkapsling.
2. Alginatpärlgenerering genom emulgering och inre gelering
- Placera 10 ml lätt mineralolja i spinnkolven och börja agitera med låg rotationshastighet (t ex 250 varv per minut för spinnkolven som används i denna video).
- Om cellerna som används för processen är från vidhäftande kulturer, applicera trypsin för att suspendera cellerna. Avsluta reaktionen genom att tillsätta FBS-innehållande medium eller trypsininhibitor och samla ett prov för cellräkning.
- Bestäm cellkoncentrationen och livskraften efter Trypanblåfärgning med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare, som tidigare beskrivitsRöv = "xref"> 32.
- Centrifugera cellerna i 7 minuter vid 300 xg och tvätta dem en gång i det önskade mediet för cellimmobilisering. Se till att detta medium innehåller emulgeringsmedel som antingen FBS eller bovint serumalbumin (BSA). Använd till exempel DMEM innehållande 10% FBS.
- Åter suspendera cellpelleten i samma medium för att erhålla 10,5 gånger den önskade slutkoncentrationen i pärlorna.
- Tillsätt 1,1 ml av den 10,5-faldiga koncentrerade cellstocken till 9,9 ml av alginatlösningen. Sedan tillsätt 550 μL CaCO 3 suspension och blanda genom omrörning med en steril spatel för att säkerställa en jämn fördelning av CaCO 3 .
- Överför omedelbart 10,5 ml av alginat-, cell- och CaCO3-blandningen till omröringsoljan med användning av en spruta.
OBS! För mycket viskösa lösningar, aspirera och skaka ut blandningen mycket långsamt för att undvika luftbubblor. I vissa fall är det att föredra att stoppa omrörningen under tillsättning av blandningen till kolven för att undvikaAlginatintagning på pumphjulets axel. - Omedelbart efter tillsats av alginat-, cell- och CaCO3-blandningen till oljan ökar agitationshastigheten.
ANMÄRKNING: För 5% LVM: MVG-alginat som användes här applicerades en rotationshastighet av 1025 varv per minut för att alstra pärlor med en diameter av ca 900 pm lämplig för odling 35 in vitro 35 . Högre rotationshastigheter och lägre alginatkoncentrationer leder till lägre medelstråldiametrar, såsom beskrivits i tidigare publikationer 25 , 32 . Små förändringar i pumphjulet och kärlegeometrin, liksom alginategenskaper, kan i hög grad påverka den genomsnittliga pärldiametern. För varje förändring i kärlkonfiguration eller alginatparti bör en standardkurva som hänför sig till ytområdesmomentens genomsnittliga vulstdiameter till rotationshastigheten genereras 32 . - Starta timern och emulgera alginatet i 12 minuter.
- Tillsätt 10 ml tHan olja och ättiksyra lösning för att sura emulsionen, lösa CaCO3 och följaktligen fysiskt tvärbinda alginatet till gelerade pärlor. Tillåt 8 minuter för detta försurningssteg.
3. Bead Recovery
- Minska omröringshastigheten till 400 rpm. Tillsätt 40 ml processbuffert blandat med 10% medium för att öka pH och för att orsaka fasinversion.
- Stoppa omröringen 1 min senare och överför blandningen till 50 ml centrifugrör. Skölj spinnerflaskan med ytterligare 20 ml medium och tillsätt detta till röret. Aspirera så mycket vattenfas som möjligt från spinnkolven innan aspirering av oljefasen för att minimera vulstkontakt med oljefasen.
ANMÄRKNING: Använd en pipett med stor borrning (t ex 25 ml pipett) vid detta steg och från denna punkt för att undvika att pärlorna skadas. För mindre volymer kan pärlsuspensionen också manipuleras med skärpipettips. För att få sådana tips, klippa änden av pipettspetsen med sax whIle bär ögonskydd. - Centrifugera rören i 3 min vid 630 xg för att accelerera pärl-sedimentering och fasseparation.
- Ta bort oljan och överskott av vattenlösningen genom att suga på med en Pasteur pipette.
- Tvätta pärlorna minst en gång med medium. Filtrera pärlsuspensionen på 40 μm nyloncellspännare och aspirera överskottsvätska associerad med pärlorna nedanför silen. Överför pärlorna till en känd volym med hjälp av en steril spatel.
OBS! Mindre eller större porstorleksfilter kan användas vid detta steg, beroende på mållinjen med minsta diameter. Tyngdpunktsfiltrering rekommenderas dock snarare än tryckdriven filtrering genom filter med filter i porrfilm för att undvika att pärlorna skadas. - Mäta volymen volymvolymen (volym efter tillsats av pärlorna, minus volymen före tillsatsen av pärlorna) och fyll i mediet för att erhålla önskad pärla: total volymförhållande, vilket typiskt är 1: 5 eller 1 ml pärlor i4 ml medium. Från denna tidpunkt använd alltid stora borrpipetter för att undvika att skada pärlorna.
- Överför de inkapslade cellerna till T-kolvar för in vitro- odling eller transplantationsexperiment.
4. Kvalitetskontroll och applikationer
OBS! För att säkerställa inkapslad cell- och pärlekvalitet, bör pärlstorleksfördelningen och cellöverlevnaden efter processen kvantifieras. Återföring av gelén för att återvinna cellerna från insidan av pärlorna för vidare analys utförs vanligen.
- För att bedöma pärlstorleksfördelningen fläckar pärlorna med toluidinblått-O.
- Placera 0,5 ml pärlor i 4 ml processbuffert innehållande 10% komplett medium.
- Tillsätt 500 μL av en 1 g / 1 toluidinblå lösning framställd i processbuffert.
- Inkubera i 60 minuter i ett koniskt rör på en rotationsskakare vid 50 rpm.
- Tillsätt 5 ml processbuffert innehållande 10% komplett medium och immedÖverföra pärlorna och lösningen i en petriskål och förvärva bilder på ett litet förstoringsmikroskop eller med hjälp av en handhållen digitalkamera. Placera Petri-skålen på en ljuslåda om det behövs, innan du får bilder med en handkamera för att förbättra kontrasten och undvika skuggor.
- Utför bildanalys för att kvantifiera pärlstorleksfördelningen som tidigare beskrivits 32 , till exempel med hjälp av bildanalys freeware 36 .
- För att bedöma cellöverlevnad kvalitativt, fläck cellerna med etidium homodimer för att identifiera döda celler och calcein AM för att identifiera levande celler.
- Tillsätt 1 volym pärlor till 4 volymer processbuffert innehållande 10% komplett medium.
- Lägg till lämplig mängd kalcein AM och etidium homodimers stamlösningar för att erhålla 4 μM respektive 2 μM koncentrationer. Generera enskilda fläckkontroller genom att bara addera ett av reagenserna till några pärlprover.
- Inkubera pärlorna på is under 20 minuter.
- Placera lösningen mellan en glid och täckglas med hjälp av en spacer som en o-ring för att undvika att komprimera pärlorna.
- Fortsätt till fluorescensmikroskopi. Använd enkla fläck kontroller för att bedöma fluorescens blödning. Välj lämpliga fluorescensfilter baserat på excitations / utsläppsvåglängderna associerade med calcein AM (494/517 nm) och etidium homodimer bunden till DNA (528/617 nm).
- För att återvinna cellerna från pärlorna för vidare analys, dela alginatet med användning av citrat eller annan chelaterande lösning.
- Förbered en avhällande lösning innehållande 55 mM citrat, 10 mM HEPES och 95 mM NaCl vid pH 7,4.
- Blanda denna lösning med 10% medium och tillsätt sedan 1 ml alginatpärlor till 9 ml av blandningen.
- Degall pärlorna på is med 75 rpm omröring under 20 min.
OBS: Cellerna kan nu användas för analys eller avlägsnande från den bortförda alginatlösningenJon genom centrifugering. Till exempel kan celllevnadsförmåga efter avbrytning kvantifieras genom Trypan Blue-färgning. Alternativt kan cellerna centrifugeras och tvättas, följt av mRNA, DNA och / eller proteinprovtagning och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid slutet av emulgerings-och inre geleringsprocessen bör en kulvolym som liknar den initiala alginat- och cellblandningsvolymen utvinnas. Pärlorna ska vara mycket sfäriska med få defekter ( Figur 3 ). Pärlorna ska vara tillräckligt starka för att motstå pipettering genom storborrpipetter. Vid höga alginatkoncentrationer kan inkapslad olja eller luftdroppar observeras i pärlorna. Detta uppstår troligen på grund av att olja sitter i alginatdroppar under emulgeringssteget (olja / vatten / oljemulsemulsion). I våra händer representerade dessa pärlor en liten fraktion (<5%) av pärlvolymen och de flesta av dessa pärlor avlägsnades under aspirering av oljan under pärlåtervinningssteget på grund av deras lägre densitet.
Fig. 3 : Representativa 5% alginatpärlor innehållande inkapslade βTC3-celler erhållna genom emulgerings-och inre geleringsprocessen. Faskontrastbild av 5% alginatpärlor innehållande 5 x 10 ^ pTC3 celler / ml pärlor. Vänligen klicka här för att se en större Version av denna figur.
Storleken på de erhållna pärlorna kommer inte att vara likformig - detta är en inneboende egenskap hos omrörda emulsioner ( Figur 4A ). Under emulgering i turbulent flöde verkar tryckfluktuationer för att störa dropparna 37 , 38 , motverka ytspänningen och de viskösa krafterna i den dispergerade fasen 39 . Viskösa krafter är icke försumbar om viskositeten hos den dispergerade fasen är mycket högre än den för denE kontinuerlig fas. Om man antar att den maximala lokala energiförlängningshastigheten är proportionell mot den genomsnittliga energidissipationshastigheten i kärlet, kan den maximala stabila droppdiametern d max (om >> än Kolmogorov-skalan) beräknas enligt följande 39 , 40 , 41 , 42 
Där ρ c är densiteten hos den kontinuerliga fasen, är e den genomsnittliga energidissipationshastigheten i kärlet, o är gränsspänningen mellan de två vätskorna, μ d är viskositeten hos den dispergerade fasen och C är en proportionalitetskonstant. När ytspänningskrafter dominerar över viskösa krafter förenklas högra sidan till C , medan om de viskösa krafterna dominerar förenklas det för att:
I omrörda kärl är energitillförseln under turbulenta flödesskalor proportionell mot effektinmatningen per volymenhet, dvs till Ni3Di2 , där Ni är omröringshastigheten och Di är impellerdiametern. Därför förutses i kombination med ekvation 1 och givet en konstant D i , om ytspänningskrafter dominerar dm, är det proportionellt med N i -1,2 ( Figur 4B ), medan det är proportionellt mot N i -0,75 om viskösa krafter inom Pärlor överväger som den huvudsakliga kvarhållande kraften. Figurerna 4B och 4C föreslår att gränssnittseffekter bestämmer dRopletstorlek för lågalginatkoncentrationer, medan viskösa krafter blir mer dominerande vid högre alginatkoncentration (t ex 5% för alginat nr 3 beskrivet i materialetabell). Eftersom det kan vara opraktiskt att bestämma d max experimentellt har höga kvantilvärden (t ex 95: e kvantiteten) av diametern eller ytmomentens medeldiameter ( d 32 ) använts istället, eftersom de i allmänhet är proportionella mot d max 43 .
Före inkapsling av celler rekommenderas att en kurva av d 32 som en funktion av N jag genereras ( Figur 4B ). Denna kurva hjälper till att välja den lämpliga N i för att erhålla en önskad genomsnittlig pärlstorlek. En ny standardkurva kommer sannolikt att krävas för olika partier av olja eller alginat, eller om alginatkoncentrationenTration är modifierad. Beroende på kärlegeometrin och på alginatkoncentrationerna bör ett relativt brett intervall av medelstråldiametrar uppnås. Exempelvis kan d32- värden mellan 200 pm och> 1 mm erhållas med användning av 2% ( Figur 2C i Hoesli et al. 32 ) till 5% alginat ( Figur 4 ) med användning av det ovan beskrivna protokollet.
Figur 4 : Pärlstorleksfördelning. ( A ) Toluidin blå-O-färgade 5% alginatpärlor. ( B ) d 32 som en funktion av omröringshastigheten ( Ni ) för 1,5% och 5% alginatpärlor med användning av en 50:50 blandning av alginater # 1 och # 2 (se tabell över material). En enda punkt visas för 5% algiNate pärlor. ( C ) d 32 som en funktion av N i för 2% och 5% alginat # 3 (se tabell över material). Felstängerna representerar standardavvikelsen för pärlstorlekarna i ett prov (N> 150 pärlor). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Cellöverlevnaden från emulgerings-och inre geleringsprocessen beror huvudsakligen på omfattningen och varaktigheten av pH-droppet som upplevs av cellerna. Genom att använda processen som beskrivs i denna video uppmättes 76 ± 2% βTC3 cellöverlevnad 31 . Vid inkapsling av dispergerade celler vid 10 5 celler / mL alginat till 10 7 celler / ml alginat sådddensiteter bör alla pärlor innehålla celler. Vid inkapsling av cellkluster som pankreatiska celler kan en deluppsättning av pärlor förväntas vara empty. Figur 5 visar typiska levande cell- / dödcellsfärgningsresultat erhållna med användning av denna process. Högre cellöverlevnad kan uppnås genom ökning av processbuffertkapaciteten och genom minskning av försurningsstegets varaktighet. Till exempel erhölls 90 ± 2% MIN6-cellöverlevnad genom användning av 60 mM MOPS (3- (N-morfolino) propansulfonsyra) som processbufferten och genom minskning av den totala processtiden till 4 min 32 . Emellertid genererades pärlorna signifikant starkare med 10 mM HEPES-processbufferten än med 60 mM MOPS-processbufferten på grund av de ökade mängderna Ca 2+ som frisattes vid lägre pH 31 . Både den korta MOPS-processen och den längre HEPES-processen bör generera pärlor som är tillräckligt stabila för> 2 veckor in vitro- odling eller transplantation. Kulor kan emellertid svälla eller degelas helt i lösningar med lågt kalcium eller med höga chelatorkoncentrationer (till exempel, Kalciumfri fosfatbuffrad saltlösning).
För inkapslade MIN6-celler som odlas in vitro bildas synliga cellaggregat efter ~ 5-7 dagar in vitro- immobiliserad cellexpansion och ~ 150 pm diameter-sfäroider kan skördas efter 2 veckor. Tillväxten av alginatimmobiliserade celler förväntas bli lägre än i icke immobiliserade kulturer, särskilt för geler med högre alginatkoncentration eller högre guluronsyrahalt.
Figur 5 : Inkapslade celler omedelbart efter processen. ( A ) Levande cell (grön, calcein AM) och dödcell (röd, etidium homodimer) färgning av inkapslade celler. ( B ) Fas kontrastbild av samma pärla. MIN6-cellerna inkapslades i 2%Alginatpärlor med användning av 12 min emulgering, 8 min försurning och en 10 mM HEPES-buffert som beskrivs i detta protokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika steg (avbildat i figur 2 ) under den inre geleringsreaktionen kan begränsa den totala kinetiken. För kalciumkarbonatkorn större än ~ 2,5 μm har upplösningshastigheten för karbonat visat sig vara begränsningsbegränsande 26 , 44 . Syrringssteget som leder till inre kalciumfrisättning har också visat sig vara den kritiska processvariabel som påverkar cellöverlevnad 32 . De förhållanden som leder till inre gelering är därför avgörande både för pärlekvalitet och cellöverlevnad. Beroende på den slutliga applikationen för pärlorna kan olika optimala processbetingelser väljas. Exempelvis kan en högre pH-minskning (t ex med användning av 10 mM HEPES för att buffra alginatlösningen) vara önskvärt för transplantationsapplikationer där den långsiktiga stabiliteten hos pärlorna är avgörande. Å andra sidan, en lägre pH-minskning (t ex med användning av 60 mM MOPS till bufféR alginatlösningen) kan vara att föredra för in vitro- applikationer.
Förutom att justera nivån och varaktigheten av försurning kan andra processändringar förutse. Till exempel kan andra omrörda kärlkonfigurationer, alginatkoncentrationer, processbuffertar, organiska faser och surgörande medel användas. Såsom diskuterats tidigare kan den genomsnittliga pärlstorleken lätt justeras genom att ändra omröringshastigheten under emulgeringssteget. Dessutom kan längre emulgeringstider leda till mindre pärlstorlekar, men kan orsaka minskad cellleabilitet. Publikationerna från Poncelet et al. 25 , 26 , 45 och Hoesli et al. 31 , 32 har testat och diskuterat några av dessa alternativ.
Små förändringar i protokollet som beskrivs ovan kan ha en djupgående inverkan påPärla generation, pärla kvalitet och cell överlevnad. Tabell 1 innehåller en felsökningsguide för att förstå och lösa problem som kan uppstå.
| Problem | Typisk orsak | Föreslagna lösningar |
| Pumphjulet slutar rotera under tillsats av alginat eller syraolja | Magnetfältet är otillräckligt för tillräcklig blandning eller pumphjulets axel är feljusterad | Se till att spinnkolven är centrerad på magnetplattan och tappad på plattan i en optimal position före tillsatsen av alginatblandningen. Testa mycket höga omröringshastigheter och sänka sedan till önskad omrörning före tillsats av alginatblandningen. |
| Se till att pumphjulets axel är väl inriktad och stabil. För BelLino spinnerflaskor, se till att pumphjulet hålls ordentligt fast med bultar på båda sidor av spinnerflaskans lock. Kontrollera att pumphjulets rörelse är begränsad till radiell riktning (pumphjulet ska inte vrida på axeln). | ||
| Inga pärlor erhållna | Alginatet emulgerades felaktigt | Se till att alginatmikrodroppar är synliga under emulgeringen. Om inte, kontrollera att oljefasetätheten och kärlegeometrin 23 liknar de som beskrivs i detta protokoll. En tät oljefas eller kärlegeometri som inte ger tillräcklig lokal energidissipation får inte tillåta korrekt alginatemulsifiering. |
| Inga pärlor erhållna | Den inre gelningen uppträdde inte | Ett vanligt fel är ofullständig upplösning av ättiksyra i oljefasen. Se till att syraoljeblandningen är tillräckligt virvlad och ingen ättiksyra iakttas vidBotten av röret. |
Om pumphjulet inte når oljan, kan mer olja tillsättas före tillsatsen av alginatet. Mängden ättiksyra bör dock justeras enligt följande ekvation:  Var  1 är olje / vattenfasförhållandet före modifikationer (t ex 0,525 för 10,5 ml alginat i 10 ml olja + 10 ml sur olja), 2 är olje / vattenfasförhållandet efter modifikationer av protokollet och Dow är ättiksyrafördelningskoefficienten mellan de två faserna. Denna fördelningskoefficient kan mätas experimentellt eller approximeras av värden som tas från litteraturen. Exempelvis är fördelningskoefficienten för ättiksyra mellan heptan och vatten 46 0,011. | ||
| Ingen pärlaS, eller pärlorna är mekaniskt instabila | Alginatlösningen med nollskjuvningsviskositet ligger under 0,004 Pa · s eller över 112 Pa · s | På grund av den varierande variationen av alginatpartierna i stor mängd, rekommenderas att man mäter viskositeten hos olika koncentrationer av alginatlösningar. Kombinationen av en sats med hög viskositet med en sats med låg viskositet kan krävas för att nå en målviskositet. För den 5% LVM- och MVG-blandningen som användes här var nollskjuvviskositeten 3,3 Pa · s. Det bör noteras att alginater med för korta guluronsyrablocklängder eller korta totala kedjelängder inte tillåter gelbildning. |
| Pärlorna är för stora eller för små | Omröringshastigheten under emulgeringen är för låg eller för hög för alginatkoncentrationen eller viskositeten som användes | Ökande turbulens genom att öka omröringshastigheten eller tillsätta bafflar kommer att minska pärlstorleken. Alginatkoncentrationen, tempEratur, fartyget och pumphjul geometrin kommer alla att påverka den erhållna pärlstorleken. |
| Många trasiga pärlor observeras | Hård pärlhantering, skada under det inre geleringssteget eller otillräcklig pärlstyrka. | Mekanisk skada på pärlorna kan leda till pärlbrott när intern gelering initieras. Minska omröringshastigheten omedelbart före försurningssteget och se till att pärlorna hanteras försiktigt med 25 ml pipetter eller 1000 μL pipetter med snitttopp. Om skadade pärlor observeras även med noggrann hantering och minskad omröring under försurning, kan pärlstyrkan vara otillräcklig. Detta kan bero på otillräcklig guluronsyrahalt eller ofullständig gelning (t.ex. otillräcklig försurning). |
| Lågcells livskraft | Initialt process pH för högt eller slutligt pH för lågt | Överlevnad av däggdjursceller kan ökas genom att man begränsar pH-minskningen och försurningstiden |
| Lågcellslivbarhet i de mindre pärlorna | Otillräcklig buffertkapacitet för alginatlösning | En större pH-minskning förväntas i de mindre pärlorna än i de större pärlorna på grund av det större yt / volymförhållandet hos dessa pärlor. Eftersom ättiksyra som tillsatts till emulsionen är begränsad, förutses högre ättiksyrakoncentrationer i mindre pärlor för samma CaCO3-koncentration. Ökning av alginatlösningsbuffertkapaciteten (t.ex. användning av 60 mM MOPS istället för 10 mM HEPES) kan öka cellöverlevnaden i de mindre pärlorna 32 . Små pärlor med högcellsförluster kan selektivt avlägsnas genom filtrering eller sedimentering utan att medföra stora volymetriska förluster. |
| jagFullständig CaCO3-upplösning | Otillräcklig försurning eller försurningstid. Observera att det här problemet inte är problematiskt om pärlstabiliteten är tillräcklig. | Otillräcklig CaCO3-upplösning har observerats i de större pärlorna enligt detta protokoll 32 . Omfattningen av CaCO 3- upplösningen kan variera beroende på CaCO 3- kornstorleken, pH-minskningen under processen, varaktigheten av pH-minskningen, liksom den använda alginatkoncentrationen. Denna fråga anses inte vara problematisk så länge som den mekaniska stabiliteten hos pärlan är tillräcklig för den önskade applikationen. För att öka korsförbindningen, se till att CaCO 3- kornet är tillräckligt liten (~ 2,5 μm). Sonicating CaCO 3 suspensionen kan hjälpa till att störa aggregerade korn 26 . Vid mycket låga eller höga alginatkoncentrationer kan justeringar i CaCO3-koncentrationen krävas. Slutligen, chelatorer eller lösningar med lågaNivåer av divalenta joner leder till gradvis förlust av Ca2 + i gelén. Om gradvis förlust av pärlens mekaniska stabilitet observeras, kontrollera att pärlförvaringen eller odlingsbufferten innehåller> 2 mM Ca 2+ . |
Tabell 1: Felsökningsguide. Lista över problem, sannolika orsaker och potentiella lösningar.
Potentiella begränsningar av emulgerings-och inre geleringsprocessen för in vitro- odling av däggdjursceller och transplantationsapplikationer innefattar: (1) nödvändigheten av övergående exponering för lågt pH, (2) behovet av att avlägsna kvarvarande olja, (3) polydisperse pärlstorleken Fördelning, (4) den potentiella skjuvspänningen under alginatdroppbildning och (5) den högre porositeten hos internt gelade pärlor jämfört med externt gelade pärlor 47 .
Högcellsöverlevnad och funktion av MIN6 och pTC3 har erhållitsEfter processoptimering 32 . Denna process kan dock inte vara lämplig för fler pH-känsliga celler. Den fullständiga elimineringen av olja från pärlorna kan också vara utmanande, och FDA-godkända oljetyper krävs för eventuella kliniska tillämpningar. Polydisperse-pärlstorleksfördelningen kan också vara något problematisk för immunoisoleringsapplikationer, där fullständig cellinkapsling och långsiktig cellöverlevnad är önskvärda. Medan småpärlstorlekar kan leda till cellprotesen 48 kan stora pärlor hindra näringsdiffusion och / eller cellfunktion 35 , 49 . Å andra sidan erbjuder emulgeringsprocessen en intressant möjlighet att undersöka effekten av pärlstorleken på cellöverlevnad efter transplantation genom att alstra både små och stora pärlor i en enda process. Den genomsnittliga pärlstorleken kan lätt justeras genom modifiering av omrörnings-durinG emulgeringssteget ( figur 4 ). Slutligen kan den högre porositeten hos internt gelade pärlor också vara skadlig för immunoisolering, där molekyler såsom antikroppar och cytokiner bör uteslutas från pärlorna. Emulgeringsprocessen möjliggör emellertid också pärlbildning från mycket koncentrerade alginatlösningar, varigenom alginatpärlporstorleken reduceras.
Emulgerings-och inre geleringsprocessen är ett intressant alternativ till munstycksbaserade inkapslar för laboratorier som vill skala upp inkapsling eller sakna tillgång till en inkapslare. Denna process är en robust och enkel metod för att immobilisera celler i alginatpärlor med användning av mycket utspädda eller mycket koncentrerade alginatlösningar. Några av de efterföljande försöken som kan utföras med de immobiliserade cellerna är att bestämma alginatmatrisens effekt på beslut av celldöd, eller för att bestämma i vilken utsträckning pärlorna ger en barriär mellan transplantatD-celler och värdimmunsystemet. Emulgerings- och inre geleringsmetoden tillhandahåller ett nytt tillvägagångssätt för inkapsling av primära öar i stora satser. Metoden möjliggör också cellinkapsling i högkoncentrerade alginatpärlor med reducerad porositet och därigenom reducerad antikroppsaccess till de inkapslade cellerna. Emulgerings- och inre geleringsmetoden tillhandahåller därför ett nytt sätt att generera kliniskt relevanta kvantiteter inkapslade terapeutiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jill Osborne för sitt grundläggningsarbete på emulgeringsprocessen och Lauren Wilkinson för teknisk support. Vi tackar Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer och Dr. James D. Johnson för deras inmatning och samarbete. Vi tackar Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Forskningsrådet för naturvetenskap och teknik (NSERC), Centret för mänsklig isetransplantation och beta-cellregenerering, det kanadensiska stamcellsnätverket, Michael Smith Foundation för hälsoforskning, le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies och COST 865 för ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and consumables | |||
| LVM alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #1" in the results. |
| MVG alginate (transplantation-grade) | Novamatrix | Non-applicable | Referred to as "alginate #2" in the results. |
| Alginate (cell culture-grade) | Sigma | A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) | A2033 is referred to as "alginate #3" in the results. |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin | Thermo Fisher Scientific | SH3039603 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| HEPES, cell culture tested | Sigma | H4034-100G | |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | S271-1 | |
| Fine-grain CaCO3 | Avantor Materials | 1301-01 | After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month. |
| Light mineral oil | Thermo Fisher Scientific | O121-4 | Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use. |
| Glacial acetic acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | Handle with caution: refer to MSDS. |
| Sterile spatulas | Sigma | CLS3004-100EA | |
| Sterile nylon cell strainers, 40 µm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001 | |
| Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Toluidine Blue-O | Sigma | T3260 | |
| Equipment | |||
| 100 mL microcarrier spinner flasks | Bellco | 1965-00100 | The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet. |
| Magnetic stir plate with adjustable speed | Bellco | 7760-06005 | The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use. |
| Cell counter | Innovatis | Cedex AS20 | This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer. |
| LED light box | Artograph | LightPad® PRO | This item can be replaced by other types of illuminators. |
| Handheld camera | Canon | PowerShot A590 IS | A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images. |
| Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters | Olympus | IX81 | Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives. |
| Image aquisition software | Molecular Devices | Metamorph | A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images. |
| Image analysis freeware | CellProfiler | Non-applicable | A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ). |
References
- Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
- Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
- Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
- Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
- Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
- Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
- Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
- Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15 (2001).
- Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
- Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
- Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
- Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
- Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
- Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
- Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
- Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
- Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
- Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
- Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
- Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
- Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
- Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
- Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
- Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
- Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
- Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
- Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
- Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
- Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
- Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
- Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
- Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
- Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
- Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
- Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
- Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
- Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
- Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
- Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
- Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
- Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
- Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
- De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
- Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).
