צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.
Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.
הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).
מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.
כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.
ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.
פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ?…
The authors have nothing to disclose.
על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |