Anlegget intercellulære tilkoblinger, plasmodesmata (Pd), spille sentrale roller i anlegget fysiologi og plante-virus interaksjoner. Kritisk til Pd transport sorterer signaler som direkte proteiner til Pd. Vår kunnskap om disse sekvensene er imidlertid fortsatt i sin barndom. Vi beskriver en strategi for å identifisere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.
Plasmodesmata (Pd) er celle til celle tilkoblinger som fungerer som inngangsporter gjennom små og store molekyler transporteres mellom anlegget celler. Mens Pd transport av små molekyler, som ioner og vann, antas å oppstå passivt, celle-til-celle transport av biologiske makromolekyler, slik proteiner, sannsynligvis skjer via en aktiv mekanisme som involverer målretting sender på den transporteres molekylet. Knapphet på identifiserte plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har sterkt begrenset forståelse av protein-sortering trasé involvert i plante celle til celle macromolecular transport og kommunikasjon. Fra et vell av endogene og virale proteiner kjent trafikk gjennom Pd, bare tre PLSs er rapportert til dags dato, alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Det er derfor viktig å utvikle en pålitelig og systematisk eksperimentelle strategi for å identifisere en funksjonell PLS sekvens, som er både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting, direkte i levende anlegget celler. Her beskriver vi en slik strategi med som et paradigme celle til celle bevegelse protein (MP) av tobakk mosaikk virus (TMV). Disse eksperimentene, som identifisert og preget første anlegget viral PLS, kan tilpasses for oppdagelse av PLS sekvenser i mest Pd målrettede proteiner.
Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport av viktige regulatorer anlegget og morphogenesis, alt fra transkripsjonsfaktorer mRNA og små RNA molekyler. Videre er benyttes denne macromolecular kapasitet av Pd av de fleste plante virus for deres intercellulære spredning under infeksjon; Hvis du vil flytte Pd, har plante virus utviklet spesialiserte proteiner, kalt bevegelse proteiner (MPs), som spesifikt mål Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylær veier av Pd transport sannsynligvis er nært sammen med bestemte sekvensene som mål transportert proteiner i disse veiene. Identifikasjon av disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan dermed være diagnostiske av den tilsvarende Pd transport veien. Dette er ved analogi Pd transport8, for eksempel å forskjellige kjernefysiske import trasé, som kan være spesifikke for ulike kjernefysiske lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Konseptuelt, representerer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellular målretting sekvenser som er nødvendig og tilstrekkelig for målretting. Men i motsetning til NLSs11er sekvens informasjon om PLSs sterkt begrenset. Spesielt, er bare fire protein sekvenser involvert i Pd målretting rapportert, med alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Den første som representeres av et homeobox-domene KN112 -en transkripsjon faktor som flytter fra indre lag til overhuden anlegg blad13 -og dens KNOX homologs14. Andre er også fra en transkripsjon faktor, Dof, som inneholder en antatte PLS beskrevet som intercellulære smugling (IT) motiv15. Den tredje sekvensen er fra PDLP1 plasmodesmata-bolig type 1 membran protein, og det er representert ved en transmembrane domene16. Til slutt, fjerde Pd målretting sekvensen ble nylig rapportert for glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankret proteiner og det er representert ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) endring signal17.
Interessant, har ingen PLSs inntil ganske nylig, er rapportert for viral MPs. Tidligere studier angitt tilstedeværelsen av antatte PLS sekvenser i anlegget viral MPs18,19, men ingen sanne PLS, dvsen minimal aminosyresekvens både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting av en urelaterte Last molekyl ( f.eks., CFP) har blitt identifisert i en viral MP. Enda var en av disse proteinene, MP av tobakk mosaikk virus (TMV), først som Pd lokalisering og transport har vært demonstrert20.
For å dekke dette gapet, utviklet vi en eksperimentell strategi for å identifisere TMV MP PLS. Denne strategien var basert på tre konsepter. (i) vi definert PLS som en minimal aminosyresekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for protein målretting til Pd21. (ii) fordi TMV MP først mål Pd og deretter translocates gjennom disse kanalene22, rettet vi mot uncoupling disse to aktivitetene og identifisere bona fide PLS, som fungerer bare for Pd målretting, og ikke for påfølgende transport. (iii) vi analysert de identifiserte PLS for aminosyre rester viktig for sin Pd målretting aktivitet, enten strukturelt eller funksjonelt. Bruker denne tilnærmingen, avgrenset vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerer som bona fide PLS. Dette ble gjort ved å produsere en rekke TMV MP fragmenter som mettet hele lengden av protein, merking deres carboxyl-termini med CFP og transiently uttrykker dem i anlegget vev. PD lokalisering av testet fragmenter ble bestemt av coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Minste fragmentet som fortsatt lokalisert til Pd, men ikke går Pd, ble ansett som representerer PLS. Endelig var PLS alanin skannet å finne viktig aminosyre rester kreves for sin struktur og funksjon.
Mens her vi illustrere denne tilnærmingen ved å beskrive identifikasjon av TMV MP PLS, kan det brukes å oppdage PLSs i noen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet av plante-patogener eller planter selv; Dette er fordi vår metode ikke dra nytte av viral MPs med hensyn til deres evne til å målrette unike funksjoner Pd.
Denne protokollen har fire core bestanddeler: begrepet identifisere en sekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for målretting for Pd, systematisk arbeidsdeling protein av interesse i fragmenter som gradvis reduseres i lengde, blander den testet fragmenter til en autofluorescent protein som tjener både som koden og macromolecular Last og funksjonelle analysen for Pd målretting i levende plante vev etter forbigående uttrykk for testet fusion proteiner. Merk at Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk generer…
The authors have nothing to disclose.
Vi sitert det meste oversiktsartikler av mangel på plass, og vi beklager til våre kolleger som originale arbeider ikke ble nevnt. Arbeidet i V.C. laboratorium støttes av tilskudd fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C. og delefilter laboratoriet støttes av NIH og midler fra avdelinger av anlegget patologi og plante-mikrobe biologi til delefilter
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |