Summary
Vi beskriver enkle metoder til at studere reguleringen af intestinal serotonin transporter (SERT) funktion og ekspression anvendelse af en in vitro cellekultur-model af Caco-2-celler dyrkes i 3D og en ex vivo model for muse tarmene. Disse metoder kan anvendes til studiet af andre epitel transportører.
Abstract
Tarmepitelet har vigtige transport- og barriere funktioner, der spiller afgørende roller i normale fysiologiske funktioner i kroppen, samtidig med at en barriere for fremmede partikler. Nedsat epitelial transport (ion, næringsstof eller narkotika) er blevet forbundet med mange sygdomme og kan have konsekvenser, der rækker ud over de normale fysiologiske funktioner på transportørerne, såsom ved at påvirke epitelial integritet og tarmen microbiome. Forståelse af funktion og regulering af transportproteiner er afgørende for udvikling af forbedrede terapeutiske interventioner. Den største udfordring i studiet af epitelial transport er ved at udvikle en egnet model, der sammenfatter vigtige elementer i de indfødte intestinale epitelceller. Adskillige in vitro-cellekultur modeller, såsom Caco-2, T-84, og HT-29-Cl.19A celler anvendes typisk i epitel transportforskning. Disse cellelinier repræsenterer en reduktionistisk tilgang til modellering af epithelium og har været brugt i mange mekanistiske undersøgelser, herunder deres undersøgelse af epitel-mikrobielle interaktioner. Men cellemonolag afspejler ikke celle-celle-interaktioner og in vivo mikromiljø. Celler dyrket i 3D har vist sig at være lovende modeller for permeabilitet lægemiddel undersøgelser. Vi viser, at Caco-2-celler i 3D kan bruges til at studere epiteliale transportører. Det er også vigtigt, at undersøgelser i Caco-2 celler er suppleret med andre modeller at udelukke cellespecifikke virkninger og tage hensyn til kompleksiteten af den native tarmen. Adskillige fremgangsmåder er tidligere blevet anvendt til at vurdere funktionaliteten af transportører, såsom udkrængede sac og optagelse i isolerede epitelceller eller i isolerede plasma membranvesikler. Under hensyntagen til udfordringerne på området med hensyn til modeller og måling af transport-funktion, vi demonstrerer her en protokol til at vokse Caco-2 celler i 3D og beskrive brugen af et Ussing kammer som eneffektiv fremgangsmåde til måling af serotonin transport, såsom i intakte polariserede intestinale epitel.
Introduction
Tarmepitelet er udstyret med forskellige transportproteiner (kanaler, ATPaser, co-transportører og varmevekslere), der udfører mange funktioner lige fra absorptionen af næringsstoffer, elektrolytter og lægemidler til sekretion af væske og ioner i lumen. Transportproteiner generere elektrokemiske gradienter, der tillader bevægelse af ioner eller molekyler i en vektorielt måde. Dette opnås ved de asymmetriske fordelinger af transportsystemerne i de apikale og basolaterale membraner af polariserede epitelceller. Desuden tight junctions, som tøjr tilstødende epitelceller, spiller en vigtig rolle i denne proces ved at tjene som en barriere for intramembrane diffusion af komponenter mellem de apikale og basolaterale membran domæner. Passende modelsystemer efterligner disse karakteristiske træk ved den indfødte tarmen (dvs. polaritet, differentiering og tight junction integritet) er afgørende for studiet af functionalitet af epitel transportsystemer.
Med hensyn til modeller, de typiske cellelinjer anvendes i øjeblikket i intestinal epitel transportforskning er Caco-2, en model af fuldt differentieret, absorberende små intestinale epitelceller; og T84 celler eller HT-29 subkloner, modeller af krypt-afledte store tarmepitelceller 1. Konventionelt er disse cellelinjer dyrket som monolag i plastoverflader eller coatede transwell inserts. Trans cellekulturplade skær til en vis grad ligner in vivo-miljø ved at lade polariserede celler at fodre basolateralt. en begrænsning i konventionelle 2D dyrkningssystemer er imidlertid, at cellerne er tvunget til at tilpasse sig en kunstig, flad og stiv overflade. Således er den fysiologiske kompleksitet native epitel ikke er korrekt gengivet i en 2D-system. Denne begrænsning er blevet overvundet ved fremgangsmåder at dyrke celler i 3D i et specifikt mikromiljø, såsom gelatinøse protein mixture, som indeholder en række ekstracellulære matrixkomponenter 2, 3. Ikke desto mindre kan de in vitro-kulturerne ikke simulere kompleksiteten af tarmepitelet, som har flere celletyper og områdespecifik arkitektur i tarmen. Således undersøgelser med anvendelse af cellekultur modeller kræver yderligere validering i native tarmen. Anvendelse af in vitro 3D cellekultur og mus tarmslimhinden beskriver vi her enkle metoder til at studere reguleringen af den intestinale serotonin transporter (SLC6A4, SERT).
Den SERT transportør regulerer ekstracellulære tilgængelighed af et vigtigt hormon og neurotransmitter, 5-hydroxytryptamin (5-HT), ved hurtigt at transportere den gennem en Na + / Cl - -afhængig proces. SERT er en kendt mål for anti-depressiva og har for nylig vist sig som en hidtil ukendt terapeutisk mål for GI lidelser, såsom diarré og tarmbetændelse.Metoder til at undersøge 5-HT-optagelse i intestinale epitelceller er tidligere blevet beskrevet. For eksempel er Caco-2 celler dyrket på plast understøtninger eller permeable indsatse vist sig at udvise fluoxetin-sensitive 3H-5-HT-optagelse i både apikale og basolaterale domæner 4. Målingen af SERT funktion i isolerede Brush membranvesikler (BBMVs) fremstillet fra humant organdonorens tyndtarmen er også blevet beskrevet af US 5. 3H-5-HT-optagelse i humane BBVMs blev vist at være fluoxetin-følsomme og Na + / Cl - -afhængig, og det udviste mætningskinetik med en Km på 300 nM 5. Ved hjælp af lignende fremgangsmåder vi også tidligere målt SERT funktion som 3H-5-HT-optagelse i muse intestinale BBMVs 6. Men fremstillingen af rene plasma membranvesikler kræver en stor mængde væv slimhinde,. Andre fremgangsmåder, såsom radiographic visualisering af 3H-5-HT optagelsessteder, er også tidligere blevet vist i marsvin og rotte tyndtarmen 7.
Ussing kammer giver en mere fysiologisk system til at måle transport af ioner, næringsstoffer og lægemidler i forskellige epitelvæv. Den største fordel ved Ussing kammer teknik er, at den muliggør præcis måling af de elektriske og transport parametre for intakt, polariseret tarmepitelet. Endvidere at mindske virkningen af den indre neuromuskulære system, kan udføres seromuscular stripning af tarmslimhinden til at undersøge reguleringen af transportører i epitelet 8.
Vi viser, at Caco-2 celler dyrket i 3D på gelatinøse protein udgøre en hul lumen udtrykker forskellige apikale og basolaterale markører. Disse celler udviser højere ekspression af SERT end 2D Caco-2-celler. Metoder til at vokse 3D-celler og til PErform immunfarvning eller RNA og protein-ekstraktion er beskrevet. Derudover beskriver vi metoder til at studere SERT funktion og regulering af TGF-β1, en pleiotropisk cytokin i tyndtarmens slimhinde ved at udnytte en Ussing kammer teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Undersøgelse af Intestinal Transporters i en 3D Kultur System af Caco-2: Dyrkning 3D Caco-2 Cell Culture på en Gelagtig Protein Blanding
- Tø vækstfaktor reduceret gelatinøse proteinblanding på is i 8 timer (eller O / N) ved 4 ° C. Når optøet, gør 1 ml eller 500 pi prøver til brug eller opbevares ved -20 ° C til senere brug.
- På dagen for kultur, forkøling dyrkningspladerne (for RNA og protein-ekstraktion) eller kamre objektglas (til immunfarvning) på is. Tilsæt 30 pi gelatinøse proteinblanding til hver brønd i en otte-brønds kamre-objektglas (eller 120 pi pr brønd af en 6-brønds plade) og fordeles jævnt. Pas på ikke at generere luftbobler under processen.
- Objektglassene anbringes / plader inde i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 15 - 30 min og lad den gelatinøse proteinblanding at størkne.
- Mens den gelatinøse proteinblandingen størkner, Trypsinisér et konfluent kolbe af Caco-2-celler.
- Tæl antalletaf celler og spin dem ved 500 xg i en bordcentrifuge i 5 minutter. Resuspender cellepelleten i 3D Caco-2 Medium efter behov.
- Seed glasset kammer dias på 4.000 celler per brønd (for plader, 20.000 per brønd). Lade cellerne vokse i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Skift medium hver 3. - 4 d.
2. Immunofluorescens Farvning for Epithelial Transporter i 3D Caco-2 celler: Dag 1
- Aspirer medium og fikseres cellerne med 400 pi 2% paraformaldehyd (PFA) (i PBS med pH justeret til 8,5 med NaOH) i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: PFA opløsning bør ikke opbevares i mere end 1 uge ved 4 ° C, og frisklavet løsning kan anvendes. ADVARSEL: PFA er meget giftigt og et potentielt kræftfremkaldende. Altid håndtere det med forsigtighed i en kemisk hætte og bruge personlige værnemidler. - Skyl brøndene to gange med 1 x PBS og opbevares objektglassene ved 4 ° C i PBS (400 pi /godt). Når faste, opbevare dem ved 4 ° C i op til en uge.
- Varm kammeret glider til RT (dette vil hærde gelatinøse protein blanding seng og gør det nemt at aspirat under vasketrinene).
- Permeabilisere cellerne med 0,5% Triton i PBS i ikke længere end 15 min.
- Forbered PBS-glycinbuffer (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO4, og 100 mM glycin). Skyl 3 x med 1x PBS-glycin i 10 min hver ved stuetemperatur.
- Forbered immunofluorescens puffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO4, 100 mM glycin, 7,7 mM NaN3, 0,1% BSA, 0,2% Triton® X-100 og 0,05% Tween-20 .
- Wash 3x i IF-buffer i 10 minutter hver ved stuetemperatur. Blok i 5% normalt gedeserum (NGS) i IF-buffer. Inkuber med primær antistof fortyndet i IF + 1% gedeserum, 200 pl / brønd, til 1 - 2 timer ved stuetemperatur. Vask med IF-buffer 3x i 10 min hver.
- Inkuber med sekundært antilegeme (1: 200) fortyndet i IF + 1% NGS, 200 pl / brønd, i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask med IF-buffer tre gange i 10 min hver. Hold dias i mørke fra dette trin på. Løft plastik kamre fra objektglas ved at placere kammeret slide i en sort holder og glidende en hvid løfter gennem holderen, indtil dens kant kontakter kant af brøndene. Træk forsigtigt op kamrene (holderen og løfteren bør komme med kultur dias).
- Monter med langsom anti-fade medium og lad det tørre i 10 min ved stuetemperatur.
- Når tørret helt, forsegle dias med neglelak og billede dem med konfokal mikroskopi. Opbevar objektglassene ved 4 ° C i to uger eller ved -20 ° C i flere måneder.
3. RNA og protein Udsugning fra 3D Caco-2-celler
- Behandle cellerne dyrket på gelatinøse proteinblanding i 12 - 14 d med et testmiddel, såsom TGF β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Efter behandling vaskes cellerne med 1x PBS. Holde cellerne på is i 30 min for at smelte den gelatinøse proteinblanding.
- Vask brøndene med afkølet PBS og opsamle cellerne i de enkelte centrifugerør. Opsamle cellerne under anvendelse lav hastighed centrifugering ved 500 xg og 4 ° C i 10 minutter. Ekstraher RNA under anvendelse af standardprocedurer og bruge realtid RT-PCR.
- For proteinet ekstraktion, lysere cellerne under anvendelse 1x cellelysebuffer suppleret med 1x protease cocktail inhibitor. Efter tilsætning cellelysis puffer til pelleten, lysere cellerne ved sonikering og fjern cellerester ved centrifugering ved 7.500 xg og 4 ° C i 10 minutter.
4. Måling af 5-HT Optagelse i Mouse ileum Anvendelse af en Ussing Afdeling: Intestinal Forberedelse og Seromuscular Stripping
- Efter eutanasi, dissekere musene og fjern tyndtarmen (efter maven og før coecum). Opdel tyndtarmen i tre dele. Kassér den midterste tredjedel, bruge den proksimale tredjedelsom jejunum, og bruge den distale tredjedel som ileum. Undgå at trække tarmen fra dens mesenterisk fastgørelse for at forhindre skader på epitel. Hold vævssnit kolde ved at dække den med iskold Krebs-Ringer bicarbonat (KBR) puffer.
- Åbn tarmen på langs med en saks. Inkuber frisk udtaget intestinale sektioner i iskold, gasning KBR indeholdende 1 uM indomethacin i 10 minutter før seromuscular stripping.
- Pin tarmstykke (~ 1 cm i længde) mucosal nedad til en plade indeholdende 7% agarose eller hærdet siliconeelastomer (0,5 cm tyk).
- Strip de seromuscular lag under en dissektion stereomikroskop med bund belysning. Skær seromuscular lag under anvendelse af en fjer skalpelblad. Brug fine tænger til opnåelse kanten af laget langs længdeaksen af tarmen.
BEMÆRK: Under stripping procedure, den nederste belysning af stereomikroskop med til at identificere og undgå områder med Peyerske plakes. - Efter afslutningen af den seromuscular stripping, montere slimhinden omhyggeligt på stifterne af en Ussing halvkammer. Under hele processen, sørge for at holde den afisolerede slimhindevævet i kanterne for at undgå at rive det.
5. Ligevægtsindstilling og Tissue Behandling
- Forbered Krebs 'opløsning: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 og 0,4 mM KH 2 PO 4 ved pH 7,4, gasset med 95% O2 / 5% CO2 ved 37 ° C. Tilsæt 10 mM glucose til serosa bad til at tjene som en energi substrat og 10 mM mannitol til den mucosale badet for at opretholde det osmotiske balance.
BEMÆRK: Krebs 'opløsning suppleret med L-ascorbinsyre (100 uM) og pargylin (100 uM, monoamin oxidase inhibitor) for at forhindre intracellulær 5-HT nedbrydning. - Sæt skyderen ind i kammeret for at eksponere både den apikale (luminale) side og den basolaterale (serosale) side af væv til Krebs 'opløsning.
- Efter en ækvilibreringsperiode på 10 min, forbehandle ilealvæv med fluoxetin (10 uM) i 30 minutter på den apikale side for J ms (mucosal-til-serosa flux).
- Behandl vævet med TGF-β1 (10 ng / ml) i 1 h på basolaterale side og derefter inkubere det med 3 [H] -5-HT (20 nM) i 30 min på den apikale side.
6. Kvantificering af mucosale til serosa Flux (J ms) og 3 [H] -5-HT Ophobning i vævet
- Saml 0,75 ml prøver fra serøse reservoir (alt 5 ml) for at måle radioaktiviteten i en væskescintillationstæller og at beregne mucosal-til-serosa (J ms) fluxhastigheder; fluoxetin-sensitive flux betegner SERT-medieret 3 [H] -5-HT-optagelse.
- For at undgå hydrostatiske trykforskelle over slimhinden under en flux periode, udtage prøver fra serøse side og replacere dem med identiske volumener bad medium.
BEMÆRK: flux beregning korrigerer for fortynding af enden prøve (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Til kvantificering af 3 [H] -5-HT akkumuleret i vævet, afmontere slimhinden fra skyderen, vaske det en gang med iskold KRB buffer, og læg den i glas kultur rør.
- Inkubér slimhinden i 0,5 ml 10% KOH natten over ved 37 ° C. Mål radioaktiviteten i 150 pi alikvoter af lysaterne (i triplikater) ved anvendelse af en væskescintillationstæller.
- Anvendes delprøver (3 - 5 pi) af lysaterne til måling proteinkoncentration ved hjælp af Bradford-metoden.
BEMÆRK: 10 ml inkubation medium indeholdende radioaktivt serotonin anvendes som standard. 5-HT tilbageholdt i vævet udtrykkes som pmol / mg protein / min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunofarvning i 3D Caco-2 cyster er vist i figur 1. Et repræsentativt billede af en XY-planet, der viser velafgrænsede lumen i 3D-cyste farvet med phalloidin actin er afbildet i figur 1A. Den side der vender lumen betegner den apikale side. Epitelceller dyrket i et 3D-miljø, resulterer i en robust epitel fænotype. Forskellige Caco-2 cyster på dag 12, når actin og SERT blev co-farvet, er vist i figur 1B. I denne gengivelse af en XY-planet (forskellig fra planet vist i figur 1A), SERT-farvning er synlig, overvejende den luminale membran, sammen med sub-apikal farvning. Figur 2 viser, at SERT proteinniveauer er højere i 3D cyster sammenlignet med Caco-2-celler dyrket som monolag på 12 th dag postplating. Disse data antyder, at 3D kultur af Caco-2-celler kan udløse signalering begivenheder, der efterligner native epiteler og resultere i øget SERT ekspression. Figur 3A afbilder generelt overblik og drift af en Ussing kammer-system og viser den monterede tyndtarmen i stifterne af åbningen. Denne teknik giver mulighed for evaluering af aktiviteten af epiteliale transportører i det native tarmen. Fordelen ved Ussing kammer fremgangsmåde er evnen til at vurdere funktionen af transportører udtrykt på luminale (mucosa) eller basolaterale (serosale) side. Figur 4 demonstrerer øget 5-HT J ms flux (A) og øget 5-HT akkumulering i ileal mucosa (B) som respons på TGF-β. Eftersom TGF-β1 forøgede bevægelse af radioaktivt mærket 5-HT fra den mucosale til serosa side, som repræsenteret ved J ms, er disse data tegn på en stigning i 5-HT-optagelse fra den luminale membran af ileum epitelceller. Dette er yderligere fremgår af en stigning i akkumulering af radioaktivt mærket 5-HT i cellen, hvilketvar følsom over for inhibering med fluoxetin, hvilket afspejler aktiviteten af SERT udtrykt på den luminale membran.
Figur 1: Caco-2 Dyrket på en gelatinøs proteinblanding ved 12 d Viser Distinct Lumen. Rød: actin. For immunfarvning af Caco-2 cyster dyrket i 3D, celler blev dyrket i en 8-brønds kamre objektglas og farvet med phalloidin (A), som tidligere beskrevet af Debnath et al. 9. For immunfarvning 3D Caco-2 kultur (B), blev cyster fikseret i 2% PFA i 30 minutter, behandlet med PBS-glycin og permeabiliseret med 0,5% Triton-X-100 i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter blokering blev cyster inkuberet i SERT antistof (1: 100) natten over ved 4 ° C. De blev derefter vasket og inkuberet med fluorescens-konjugeret sekundære antistoffer (1: 200) og phalloidin (1: 200)i 45 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev de monteret i antiblegemiddel indeholdende DAPI. Billeder blev taget med et konfokalt mikroskop. Scale bar: 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SERT Protein Expression i Caco-2 celler dyrket i 2D og 3D. Lysater fra Caco-2-celler dyrket på en plastbærer og Caco-2 3D sfærer blev løst ved SDS-PAGE blottet på nitrocellulosemembraner og analyseres med det SERT antistof og GAPDH. Klik her for at se en større version af dette tal.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figur 3: (A) Ussing kammer og "slider" med benene og blænde viser en monteret mus tyndtarmen. Slider blænde område = 0,30 cm2. Skyderen passer ind i de to halvdele af Ussing kammer, som er ruminddelt. Elektriske parametre, såsom transepitelialt spændingspotentiale (V t), måles af et potentiometer og elektroder (typisk calomel halvceller eller Ag-AgCl er forbundet med saltbroer til hvert kammer halvdel). Saltbroer er sammensat af 3% agar smeltede i fysiologisk buffer (fx KBR) anvendes til badning slimhinden for at undgå ændringer i den ioniske sammensætning af opløsningerne. (B) Skematisk af princippet om Ussing kammer. Den strippede tarmslimhinden blev monteret i de to halvdele af Ussing kammer adskiller de mukøse og serøse kamre. Radioaktivt sporstof blev tilsat til den mucosale side; optagelsen blev målt som mængden af radioaktivitet inkorporeret ved vævet, normaliseret til det totale proteinindhold. Fluxen blev evalueret ved måling af radioaktiviteten i serøse kammer over en tidsperiode. De viste i den skematiske elektroder giver mulighed for samtidig overvågning af elektriske parametre, den herunder strøm, spænding og modstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Måling af SERT Funktion i Ileal mucosa Stripped af Seromuscular Layer. Ex vivo virkninger af kortvarig TGF-β1 behandling på SERT funktion i muse ileum, hvilket kan påvises ved måling af 3 [H] -5-HT optag og 3 [H] -5-HT fluxer under anvendelse afUssing kammer. TGF-β1 behandling (10 ng / ml, 1 h), på den basolaterale side signifikant øget SERT funktion, som det fremgår af den øgede Na + -følsom mucosal-til-serosa flux (J ms) (A) og 3 [H] - 5-HT-optagelse (B). Fluoxetin behandling af ilealvæv inhiberede TGF-β1-stimuleret 5-HT-optagelse. Fluoxetin-sensitive optagelse blev forøget 2,5 gange ved TGF-β1 sammenlignet med kontrollen. Resultater er vist som middelværdien SEM. En envejs ANOVA Tukeys test blev anvendt til statistisk analyse. Beregning af J ms flux: [(CPM e - CPM s) x Fortyndingsfaktor] / [(. V std x konc af substrat) CPM std / xtxa]. CPM e: tællinger pr min ved udgangen af flux måling; CPM s: tællinger pr min ved starten af den flux måling; CPM std: tællinger pr min på standard (taget fra mucosale reservoir); V std: volumen of CPM std; t: tid af flux i h; a: areal af åbningen (0,3 cm2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fuldt differentierede Caco-2 cellemonolag stor udstrækning blevet anvendt som polariseret epiteliale monolag at studere intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Men for at efterligne den fysiologiske tilrettelæggelse af intestinale epitelceller, har der været betydelig interesse i udviklingen af en Caco-2 kultur i 3D. En række 3D cellekulturmodeller for intestinale epitelceller er for nylig blevet udviklet, der efterligner nativ celle-celle- og celle-ekstracellulær matrix (ECM) interaktioner med større fysiologiske relevans end 2D systemer 16. Således er ECM-baserede naturlige hydrogeler med fælles komponenter (såsom laminin, collagen IV, og heparinsulfatproteoglycan) udbredt anvendt til generering af 3D cellekulturer 16.
Protokollen beskrevet her demonstrerer egnethed 3D Caco-2 celler dyrket i gelatinøse protein blanding (en ECM-baserede naturlige hydrogel udvundet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) musetumorer) for epitelial transportforskning. Inden for 10 dage, cellerne begynder at udgøre en hul lumen omgivet af et lag af celler og show polaritet, med tydelige apikale og basolaterale domæner. Celledensiteten på tidspunktet for podning på en gelatinøs proteinblanding er kritisk for dannelsen af regelmæssige cyster med centrale lumen. Til farvning eksperimenter, vi tilføjet 4.000 celler / brønd af en 8-kammer slide (godt overfladeareal: 0,7 cm 2). Seeding celler på et højere resultater tæthed i uregelmæssige sfærer. De 3D Caco-2 cyster på 10 - 12 dage viser polaritet og mere differentiering end 2D Caco-2 celler dyrket på transbrøndene 17 (upublicerede observationer). Vi har vist en markant stigning i ekspressionen af SERT mRNA og protein niveauer som compared til fuldt differentierede 2D monolag. Også anvendelse af disse fremgangsmåder, har vi vist, at TGF-TGF-β1 forøger overfladen niveauer af SERT, som vist ved immunfluorescensfarvning 15.
Interessant nok har nylige undersøgelser vist, at 3D Caco-2 celler er mere følsomme over for patofysiologiske stimuli på grund af tilstedeværelsen af kritiske signal- komponenter, såsom TNF-receptor 2 og MyD88, og udgør en bedre model end den konventionelle 2D-systemet 17. Men et spørgsmål, der begrænser brugen af 3D Caco-2 i epitelial transportforskning er manglen på de forskellige celletyper og kompleksitet, der findes i den native tarmen. I denne henseende intestinale organoids (også kendt som enteroids / colonoids) fra mennesker eller museoprindelse repræsenterer en state-of-the-art model indeholder alle de forskellige celletyper af nativ epitel at studere transporten af ioner, næringsstoffer eller lægemidler. I forhold til organoids, vel-differentieret 3D Caco-2 cyster repræsenterer en type af epitelceller (dvs. absorberende enterocytter), og er helt sikkert egnet til undersøgelser, der fokuserer på de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer tarm transportører. Dette skyldes, at 3D Caco-2 celler er bekvemme at håndtere, er omkostningseffektive, og er lette at håndtere, såsom for transfektioner af plasmid-DNA og siRNA'er. En anden begrænsning af 3D Caco-2-celler i epitel transportforskning er vanskeligheden ved at få adgang til hulrummet. Midler, der binder til luminale membran receptorer eller smitstoffer der får adgang til epitelet fra den luminale side kan være en udfordring at studere i dette system. Denne begrænsning kan overvindes ved mikroinjektion agenterne i lumen, som det er sket tidligere i tilfælde af human intestinal organoide kultur for C. difficile-infektioner 18. Det er imidlertid vigtigt, at undersøgelser i in vitro cellekultur-modeller er valideret i det native Intestine hjælp in vivo eller ex vivo metoder.
I løbet af de sidste årtier har Ussing kammer i høj grad bidraget til anerkendelse af de funktionelle eller lovgivningsmæssige egenskaber af mange epitel transportører 19. Her viser vi egnethed Ussing kammer tilgang til måling 5-HT flux og 5-HT-optagelse i muse tarmslimhinde blottet for seromuscular lag 15. TGF-β1 behandling af ileal mucosa på den basolaterale side (10 ng / ml, 1 h) signifikant forøget SERT funktion, som det fremgår af forøget Na + -følsom mucosal-til-serosa flux (J ms) og 3H-5- HT optagelse. Fluoxetin behandling af ilealvæv inhiberede TGF-β1-medieret stimulering af 5-HT-optagelse.
Kritiske trin i denne teknik indbefatter montering vævet på objektglasset åbning som et intakt lag (uden nogen oprivning) for at achie ve nøjagtige målinger. Passende kirurgiske værktøjer, såsom bold saks, tynd-tip pincet og fjer kirurgiske knive, er vigtige for den rette håndtering og fjernelse af væv.
Denne metode anvendes til at studere funktionen af andre epitel transportører, såsom elektrolyt transportører (chlorid transportører, Na + / H + vekslere, transportører næringsstoffer, etc.). Specialiserede anvendelser af Ussing kammer-såsom pH-stat teknik, til at måle transepithelial bicarbonat sekretion, og den isotopiske flux metode til måling netto sekretion eller absorption af substrater-er gennemgået omfattende af Dr. Clarke et al. 8. De grundigt gennemgået anvendelse af Ussing kamre til studiet af stoftransport 19. Mini Ussing kamre er også blevet anvendt i klinisk relevante situationer, såsom at måle transportfunktion i biopsiprøverref "> 20. Den største fordel ved Ussing kammer teknik igen den udkrængede sac metode er evnen til samtidigt at måle de elektriske og transport parametre for intakt, polariseret tarmepitelet.
En bekymring med Ussing kammer metode er den begrænset levedygtighed og optimal funktion af en ex vivo intestinal forberedelse. Efter fjernelse fra dyret, kan ex vivo tarm forberedelse kun vare i op til 3 timer i en Ussing kammer 19. Således kan denne metode være begrænsninger i at teste virkningen af midler i længere tidsperioder. I sådanne tilfælde kan behandlingen udføres in vivo og isoleres derefter tarmene fra kontrol- og behandlingsgruppen kan anvendes til at måle transport parametre med Ussing-metoden. I alle tilfælde, kan størrelsen af G t (eller R t) være en realtid indikator for levedygtighed og kan være nyttige i at skelne mellemspecifikke og uspecifikke effekter af testede reagenser.
Sammenfattende kan de her beskrevne metoder lette vores forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer funktionen og reguleringen af epitelial transportører hos raske og syge tilstande, såsom tarmbetændelse, smitsom diarré, malabsorption eller metaboliske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O.
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
