Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

doi: 10.3791/55305 Published: July 17, 2017

Summary

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

Abstract

מקרופאגים הם phagocytes מקצועי מזרוע מולדת של המערכת החיסונית. במצב יציב, מקרופאגים נינוחים נמצאים ברקמות מבוגר שבו הם פועלים כמו זקיפים קו הקדמי של זיהום נזק לרקמות. בעוד תאי חיסון אחרים מתחדשים ללא הרף מן גזע ההמטופויטים ותאי האב (HSPC) הממוקמים במח העצם, השושלת של מקרופאגים, הידועה כמקרופאגים מקומיים, הוכחה כמתוחזקת בעצמה ברקמות ללא קלט ממחלת HSPCs של מח עצם. השושלת הזו מודגמת על ידי מיקרוגליה במוח, תאי קופפר בכבד ובתאי לנגרהנס באפידרמיס. המעי הגס ומעי הגס lamina propria הם רק רקמות מבוגר ללא מקרופאגים תושב עצמאי HSPC. מחקרים שנערכו לאחרונה זיהו כי מקרופאגים תושב שמקורם hematopoiesis חלמון עובריים מחוץ עובריים (מ) נבדל תאי גזע עובריים hematopoietic (HSC). בין heletopoiesis שק החלמון סופי, eאבות rythromyeloid (EMP) לעורר הן erythroid תאים מיאלואידים, מקרופאגים תושב בפרט. EMP נוצרים רק בתוך שק החלמון בין E8.5 ו E10.5 ימים של פיתוח והם נודדים לכבד העובר כבר בתחילת המחזור, שם הם מתרחבים ומבדילים עד לפחות E16.5. צאצאיהם כוללים אריתרוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן, אך רק מקרופאגים שמקורם ב- EMP נמשכים עד לבגרות ברקמות. אופי חולף של הופעת EMP ואת חפיפה הזמני עם הדור HSC הופך ניתוח של אבות אלה קשה. הקמנו טמוקסיפן- inducible מיפוי פרוטוקול מיפוי מבוסס על ביטוי של מקרופא ציטוקין קולטן Csf1r האמרגן לאפיין EMP ו EMP הנגזרות תאים in vivo על ידי cytometry הזרימה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ישנם מספר גלים רצופים אך חופפים של אבות hematopoietic במהלך התפתחות הצאצאים myeloid להישאר בבגרות. ראשית, אבות "פרימיטיביים" יוצאי דופן מופיעים בשק החלמון העכבר 1 , 2 בין E7.5-E8.25 ו להוליד מקרופאגים עובריים ללא כל ביניים monocytic. אם מקרופאגים נגזר אבות פרימיטיביים להתמיד במוח המבוגר כמו microglia נשאר נושא של חקירה פעילה. שנית, Erythro-Myeloid מבשרי (EMPs) להתעורר בשק החלמון ב E8.5, להיכנס למחזור הדם ליישב את העובר. EMPs לצאת מתוך האנדותל hemogenic שק חלמון במעבר האנדותל ל- hematopoietic Runx1 תלויי 3 , 4 . בעוד EMP יכול להבדיל לתוך מקרופאגים בתוך שק החלמון, הם גם ליישב את הכבד עוברית מיום עובריים (E) 9 5 ו differentenTiate לתוך erythrocytes, megakaryocytes, מקרופאגים, מונוציטים גרנולוציטים ותאי התורן 6 . מקרופאגים הנובעים EMPs התערוכה קיבולת השגשוג ברקמות התפתחותיות ומבוגרים. אם מקרופאגים נגזרות EMP לעקוף את השלב מונוציטים של בידול עדיין שנוי במחלוקת כמו מעט מאוד ידוע על מסלול ההבחנה שלהם 7 , 8 . לבסוף, תאים גזעיים ההמטופויטים (HSCs) מופיעים ב E10.5 בתוך העובר הנכון מאזור אבי העורקים- gonad-mesonephros ו נודדים לכבד העובר. HSCs עם יכולת repopulation לטווח ארוך מזוהים רק לאחר E11 (על הבמה זוג 42 somite) 9 . שם הם מתפשטים ומבדילים בין E12.5 עד שהמטופויזיס המוחלט מתחיל לעבור למוח העצם, אשר הופך להיות האתר השולט של ייצור תאי הדם למשך החיים שלאחר הלידה 10 .

את spAtial ו חפיפה זמנית בהופעתה, כמו גם סמנים immuno-phenotypic משותף יש עד כה הפריע ביכולתנו להבחין התרומות הספציפיות של גלים אלה של אבות hematopoietic עובריים. בעוד ששניהם EMP ו- HSC נוצרים באופן תלוי ב- Runx1 ומבטאים את גורם התעתוק Myb ואת מקדם גדילה Csf1r (קולוני-מגרה פקטור 1 קולטן, הידוע גם בשם מקרופאג קולוני מגרה פקטור קולטן) בין היתר, EMPs ניתן להבחין HSCs על ידי היעדר הפוטנציאל הלימפה, הן במבחנה והן in vivo , חוסר שלהם לטווח ארוך repopulating פוטנציאל וחוסר ביטוי פני השטח של השושלת סמן Sca-1 11 . מודלים מיפוי גורל גנטי נדרשים לאפיין ontogenny מקרופאג שכן הם מאפשרים מיקוד אבות עובריים באופן ספציפי תא ספציפי זמן. כאן אנו מציגים את פרוטוקול מיפוי הגורל המשמש במעבדה שלנו כדי להפלות בין שני השושלתS של מקרופאגים נמצא רוב הרקמות למבוגרים: HSC הנגזר מקרופאגים מקרופאגים תושב עצמאי HSC.

מקרופאגים תושב רקמות כבר נעוצים תאים מבשר מייב עצמאית להביע את הקולטן ציטוקינים Csf1r 12 ו נמצאים העובר ב E8.5-E10.5 באמצעות שלוש משלימות גורל מיפוי אסטרטגיות 6 . כדי ללמוד hematopoiesis שקית חלמון ללא תיוג HSCs עוברי, אנו משתמשים זן מהונדס, Csf1r MeriCreMer , להביע חלבון היתוך טמוקסיפן- inducible של recombinase "משופר" Cre ושני קולטנים אסטרוגן העכבר (Mer-iCre-Mer) תחת שליטה של את Csf1r האמרגן. לפיכך, recombinase Cre יהיה פעיל בתאים Csf1r -expressing במהלך חלון זמן מוגבל. כאשר נעשה שימוש עם זן כתב המכיל חלבון פלואורסצנטי במורד של קוקס lox-stox-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), זה יוביל את הקבועתיוג גנטי של התאים הנוכחים בזמן אינדוקציה, אלא גם של צאצאיהם. מינהל ב- E8.5 של הצורה הפעילה של טמוקסיפן, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), תוויות EMPs ומקרופאגים, ללא תיוג של חלמון שן "אבות פרימיטיביים" חסרי אונים או HSCs עוברית. בכך, יש לנו אפיינו את אימונופנוטיפ של EMPs וצאצאיהם במהלך ההתפתחות העוברית, כמו גם להעריך את תרומתו של מקרופאגים שק חלץ נגזר לבריכות macrophage מבוגר. עבודה נוספת נדרשת לאפיין אם מקרופאגים נגזרים פרימיטיביים אב מתויגים גם באמצעות גישה זו והאם הם יכולים לתרום בריכות מקרופאג מבוגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נהלי בעלי חיים בוצעו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימושים מוסדיים של מכון פסטר (CETEA).

1. ב Utero דופק תיוג ב Csf1r MeriCreMer רוזה LSL-YFP עוברים

  1. הכן את הפתרון המניות של 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 מ"ג / מ"ל).
    1. תחת fumehood, לפתוח את בקבוקון 25 מ"ג של OH-TAM ולהוסיף 250 אתנול μL (100%).
    2. מעבירים את הפתרון OH-TAM לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם קצה חתוך וורטקס במהירות מקסימלית במשך 10 דקות.
    3. Sonicate 30 דקות אמבטיה sonicator.
    4. הוסף 250 μL של שמן קיק PEG-35 תחת fumehood כדי לקבל פתרון מניות 50 מ"ג / מ"ל.
      הערה: שמן קיק PEG-35 הוא ממס עם תכונות amphiphilic שקושר מולקולות הידרופובי solubilizes אותם ממיסים מימיים.
    5. וורטקס כ 5 דקותבמהירות מקסימלית sonicate 30 דקות אמבטיה sonicator.
    6. Aliquot 90 μL (4.5 מ"ג) לכל צינור microcentrifuge (1 aliquot לכל זריקה).
    7. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע 1 או ב -20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך כפי שתואר לעיל 13 .
  2. הכן את הפתרון המניות של פרוגסטרון (10 מ"ג / מ"ל)
    1. הוסף 250 μL של אתנול 100% ל 25 מ"ג של פרוגסטרון להכין 10 מ"ג / 100 ההשעיה μL תחת fumehood. וורטקס בעדינות.
    2. הוסף 2250 μL שמן חמניות autoclaved לעשות פתרון 10 מ"ג / מ"ל ​​פרוגסטרון מתחת למכסה המנוע.
    3. וורטקס כ 5 דקות במהירות מקסימלית, aliquot ו חנות ב 4 ° C. שים לב שהפתרון ברור כאשר מאוחסן.
  3. טמוקסיפן
    הערה: התפתחות עובריים נאמדה בהתחשב ביום היווצרות תקע הנרתיק כמו יום עובריים (E) 0.5. רקומבינציה הוא המושרה על ידי הזרקת יחיד ב E8.5להריון בהריון Csf1r MeriCreMer נקבות 12 . תוסף OH-TAM עם 37.5 מיקרוגרם לכל גרם של פרוגסטרון כדי להפחית את שיעורי ההפלה לאחר הממשל טמוקסיפן. להזריק בשעה 13 (עבור הנרתיק תקע נצפו בבוקר).
    1. בבוקר הזרקת, sonicate aliquot של פתרון OH-TAM במשך 10 דקות (או עד resuspended לחלוטין).
    2. הוסף 360 μL NaCl 0.9% תחת fumehood להשיג 10 מ"ג / מ"ל ​​פתרון OH-TAM ו מערבולת ביסודיות. Sonicate עד הפתרון ברור לחלוטין resuspended (לפחות 30 דקות).
    3. טרום חם פרוגסטרון לטמפרטורת החדר.
    4. מערבבים 450 μL של OH-TAM ו 225 μL של פרוגסטרון בצינור microcentrifuge. מְעַרבּוֹלֶת.
    5. Sonicate לפחות 10 דקות לטעון על מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G.
    6. במתקן החיות, לשקול את ההריון הנשי ( Csf1r MeriCreMer הנקבות נמצאים רקע גנטי FVB inbred ו טיפוסי לשקול betweEn 25 ו 33 גרם).
    7. בצע הזרקת תוך צפצפה על ידי הזרקת לאט את נפח מחושב לתוך העכבר. לאחר משיכת המחט, לחץ בעדינות על הפצע לנקב ועסה את הבטן כדי להפיץ את OH-TAM.
      הערה: מינון ההזרקה של OH-TAM הוא 75 מ"ג לק"ג, והמינון של פרוגסטרון הוא 37.5 מ"ג לק"ג. טבלה 1 מספקת את נפח להזריק לתוך הנקבות בהריון.
</ Tr>
משקל עכבר (g) נפח הכולל להזריק מתערובת (μL)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

טבלה 1: נפח הזרקה של 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). נפח נדרש זריקה אחת ב E8.5 של 75 מיקרוגרם לכל גרם (משקל גוף) של OH-TAM בתוספת 37.5 מיקרוגרם לכל גרם של פרוגסטרון.

2. Dissection של חלמון Sac (YS) ו עוברית כבד (FL)

הערה: טכניקות סטריליות קפדניות אינם נחוצים כאשר מניפולציה עוברים, אלא אם הם הולכים לשמש לתרבות לטווח ארוך. עם זאת, אזור העבודה חייב להיות נקי ומכוסה בנייר מתחת לנייר סופג.

  1. הכן פוספט קר כקרח שנאגרו מלוחים (PBS) ו עיכול לערבב (PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​collagenase D, 100 U / מ"ל ​​Deoxyribonuclease אני (DNase I) ו 3% בסרום שור עוברית).
  2. להקריב נקבות בהריון על ידי קרנקע ויקלי ביום ההיריון הנדרש ( למשל שלב עוברי E10.5).
  3. צבוט את העור רק מעל איברי המין ולעשות חתך קטן על קו האמצע עם מספריים. משוך את העור לעבר הראש כדי לחשוף לחלוטין את קיר הגוף ללא פרווה. חותכים את שרירי הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים לדחוף את המעיים לחשוף את שתי הקרניים הרחם.
  4. עם מלקחיים בוטה בגודל בינוני, לתפוס את כרית שומן המצורפת השחלה בעדינות למשוך את הרחם. גזור ברמה הצווארית של קרניים הרחם ולהרים את הקרניים מהחלל הצפק. הסר את פנקס השומן כדי לשחרר לחלוטין את קרניים הרחם לחתוך את הקרניים מן השחלה בכל צד.
  5. שים את הקרניים לתוך קר כקרח PBS בצלחת 10 מ"מ פטרי. במהירות אחיזה בשכבות הרחם בשריר בקצה אחד (סוף צוואר הרחם) ולהחליק מספריים בסדר בין שכבת השריר לבין הרקמה הדקודית כדי לשחרר את העוברים עם הרקמה הדקודית המקיפה.
    הערה: שרירים נוטים להתכווץ במהירות afteR החילוץ, כך שלב זה חייב להיות מהיר ככל האפשר.
  6. השתמש זוג אחד של מלקחיים בסדר לחתוך את הקרום של רייכרט ואת השליה.
  7. בעדינות להסיר את שק החלמון ומניחים אותו 24-רקמה צלחת תרבות עם 0.5 מ"ל של עיכול לערבב.
    הערה: בשלב זה, דם עובריים ניתן לאסוף.
    1. מיד לאחר ניתוק כלי הטבור וויטלין, להעביר את העובר לתוך צלחת 12-רקמה תרבותית המכילה 10 מ"מ קר כקרח ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לערוף את העובר באמצעות מספריים יפים חדים, מנסה להגביל ככל האפשר ריסוס רקמות אפשרי. לדגור על הקרח 10-15 דקות ולאסוף את EDTA המכיל את הדם.
  8. הסר את amnion המקיף את העובר.
  9. עבור שלבים <E11.5, לספור את מספר זוגות somite לבמה טובה יותר של העוברים ואת רזולוציה זמן טוב יותר (כל זוג somite מפתחת ב ~ 1 שעה 30 דקות).
  10. חותכים את הראש של העובר אותנוIng מלקחיים או מספריים בסדר. מעבירים את הראש לצלחת 24 גם עם תערובת העיכול 0.5 מ"ל.
    הערה: neuroectoderm והמוח בשלבים מאוחרים יותר גזור נוספת עבור ניתוח cytometry זרימה; להסיר בזהירות את מקלעת כלי הדם שמסביב.
  11. חותכים את העובר מעל hindlimb ולהסיר את forelimbs.
  12. כדי לבודד את הכבד, לפתוח את בית החזה באמצעות זוג מלקחיים בסדר. צבוט הקדמי אל הלב בעדינות למשוך תוך שימוש במלקחיים השני לשחרר את האיברים מהגוף.
    1. בזהירות להפריד את הכבד עוברית מהלב ומעיים. מעבירים את הכבד עוברית לצלחת 24 גם עם תערובת 0.5 מ"ל עיכול. בזהירות לעקוב אחר ההעברה תחת מיקרוסקופ לנתח.
  13. איסוף אזור הזנב (או כל חלק אחר העובר) עבור genotyping על ידי assay תגובה שרשרת פולימראז (PCR).
    הערה: רקמות ואיברים אחרים ניתן לקצור מן העוברים E10.5 לניתוח דומה באמצעות cytometry הזרימה. דם, סקי ראשN, אבי העורקים- gonad-mesonephros אזור (AGM), הלב neuroectoderm ניתן לאסוף ב E10.5. בשלבים מאוחרים יותר, ריאות, כליות, טחול ולבלב ניתן גם לאסוף. תיאור מפורט של דיסקציה של AGM בשלבים התפתחותיים שונים תוארה בעבר 14 .

3. עיבוד של רקמות עובריים עבור זרימת cytometry

  1. דגירה האיברים (ממוקם בתערובת העיכול) במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את הרקמה פתרון אנזימטי על מסננת 100 מיקרומטר להציב צלחת 6-רקמת רקמה מלא 6 מ"ל של חיץ FACS (0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו 2 מ"מ EDTA ב 1x PBS). ניתוק מכני על ידי רסיסים בעדינות עם בוכנה גומי שחור של מזרק 2 מ"ל להשיג ההשעיה תא בודד.
    הערה: מעתה והלאה, כל השלבים צריכים להתבצע ב 4 ° C.
  3. איסוף ההשעיה התא עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור 15 מ"ל.
  4. ספיN עבור 7 דקות ב 320 xg ב 4 ° C. מחק את supernatant על ידי שאיפה.
  5. Resuspend גלולה ב 60 μL חיץ FC חסימת (CD16 / CD32 חסימת נוגדן בדילול 1/50 במאגר FACS).
    1. העברת 50 μL ההשעיה תא בודד לכל היטב בתחתית עגול 96 צלחת רב רב. דגירה של לפחות 15 דקות על הקרח.
      הערה: מכתים יכול להתבצע גם 5 צינורות פוליסטירן מ"ל פוליסטירן בעת ​​טיפול במספר קטן של דגימות.
    2. מעבירים את 10 μL הנותרים לתוך צינור FACS 5 מ"ל פוליסטירן כדי לקבל מאגר של דגימות מכל רקמה. בריכה זו תשמש את הפקדים ( כלומר דגימות לא מוכחות ופלורסנט מינוס אחד (FMO) שולטת עבור כל fluorochrome). העברת 50 μL של הבריכה עבור כל פלואורסצנט מינוס אחד (FMO) שליטה (אחד לכל fluorochrome) על צלחת 96 רב.
      הערה: כל בקרת FMO מכילה את כל הנוגדנים מצמידים לפלואורוכרום מחלונית הנוגדן, למעט אחדכי הוא נמדד. FMOs משמשים לזיהוי גבולות השער ולשליטה על החפיפה הספקטראלית בחלוניות צבעוניות. כדי לטפל כראוי את וריאציות רקע autofluorescence בין רקמות שונות, חשוב להכין את הפקדים האלה מן הבריכה של דגימות של כל רקמה. השליטה המתאימה ביטוי YFP יהיה דגימות של עוברי Cre- שלילי, אשר אושרו על ידי גנוטיפינג PCR.

4. משטח אנטיגן מכתים

  1. הכן את תערובת הנוגדנים במאגר FACS (טבלה 2). הכן 50 μL של תערובת נוגדנים למדגם.
    1. השתמש נוגדנים הבאים fluorochrome מצמידים: אנטי CD45.2 (שיבוט 104); Anti-CD11b (משכפל M1 / ​​70); אנטי F4 / 80 (לשכפל BM8); Anti-AA4.1 (משוחזר AA4.1); אנטי קיט (שיבוט 2B8); ו נגד Ter119 (שיבוט Ter119).
    2. הכן שש תערובות נוגדן עבור פקדי FMO במאגר FACS. הכן 50 μL של תערובת נוגדן למדגם שליטה.
      לאTE: דילול הנוגדנים בתערובת הנוגדנים מרוכז פי שניים מאשר הריכוז הסופי המצוין בטבלת החומרים. עבור פאנל עם שישה נוגדנים מצמידים fluorochrome, 6 פקדים FMO מוכנים. טבלה 2 מספקת את הרכב תערובת הנוגדנים ובקרות FMO עבור צינור אחד.
נפח (μL) של נוגדן (נפח סופי 50 μL)
נוֹגְדָן שיבוט תערובת נוגדן FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 ערכת FMO FM119
אנטי CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
אנטי CD11b M1 / 70 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5
אנטי F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
אנטי AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
אנטי קיט 2 ב 8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5
נגד Ter119 Ter119 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
חיץ FACS 45.5 46.5 52 46.5 46.5 52 52

.within-page = "1"> טבלה 2: נפח נוגדנים באמצעות מכתים ופלורסנט מינוס אחד (FMO) שולטת. נפח (μL) של נוגדן נדרש נפח סופי של 50 μL.

  1. הוסף 50 μL של תערובת נוגדן לדגימות בצלחת 96-multiwell (נפח סופי במהלך מכתים הוא 100 μL). בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים דגירה על קרח במשך 30 דקות.
  2. ספין את צלחת 96-multiwell במשך 7 דקות ב 320 xg ב 4 ° C וזורקים את supernatant. Resuspend μL 200 של חיץ FACS.
  3. חזור על הליך לשטוף (שלב 4.3) פעמיים עם 150 חיץ FACS μL.
  4. סנן את הדגימות ואת הפקדים (FMOs ודגימות הבריכה בלא כתם) לתוך 5 צינורות קלקר מ"ל דרך מסננת 70 מיקרומטר. חנות על הקרח עד הרכישה.

5. זיהוי EMPs ו YS הנגזרות מקרופאגים על ידי זרימת cytometry

הערה: פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות זרם לייזר 4 cytometer זרימהUipped עם 405 ננומטר לייזר ויולט, לייזר 488 ננומטר כחול, 562 ננומטר לייזר צהוב ו 638 ננומטר לייזר אדום.

  1. הכן חרוזים פיצוי עבור כל נוגדנים מצמידים בהתאם להוראות היצרן. השתמש דגימות בלא כתם חרוזים פיצוי כדי לייעל את עוצמות לייזר.
  2. כדי לזהות גבולות השער, להשתמש FMO (פלואורסצנציה מינוס אחד) שולטת עבור כל נוגדנים.
  3. על מנת להוציא תאים מתים, להוסיף 1 μL של DAPI (1 מ"ג / מ"ל) לצינור (המכיל 200 μL ההשעיה תא מוכתם) 1 דקות לפני הרכישה. השתמש אות חזק DAPI ופרמטר קדימה מפוזרים (FSC) לבצע הרחקה של תאים מתים ופסולת.
    הערה: השתמש בתוכנה מן cytometer זרימת לצייר שערים במהלך הרכישה. פיצוי מטריקס וניתוח ניתן לבצע לאחר רכישת מדגם באמצעות תוכנות אחרות זמינים מסחרית.
  4. השתמש קדימה ופיזור בצד (FSC לעומת SSC) לבצע תא חי ופליה אפלטון מכל האירועים.
  5. יצירת נקודות פלואורסצנציה נקודות בוגר בקנה מידה יומן לצייר שערי הבת, ראשית, להוציא אריתרוציטים (Ter119 + ) ולאחר מכן, לזהות תאים אב (Kit + ) ותאי hematopoietic (CD45 + Kit Neg ) (ראה איור 1 ).
  6. יצירת היסטוגרמות פלואורסצנטי לכמת את יעילות תיוג של YFP בקרב אוכלוסיות מזוהה שונים YS ( איור 2 ), הכבד עוברית ( איור 3 ) ואת המוח ( איור 4 ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מיפוי גורל גנטי הושג על ידי הממשל ב E8.5 של OH-TAM לתוך Csfrr-Mer-iCre-Mer נשים מזדווגות עם גברים נושאת כתב Rosa26-LSL-eYFP. בנוכחות OH-TAM, כריתה של קסטה להפסיק מוביל הביטוי הקבוע של YFP בתאים המבטאים Csf1r . אספנו שני רקמות hematopoietic: שק החלמון וכבד העובר ורקמה לא hematopoietic, neuroectoderm, מן העוברים ב E10.5. יחיד תא השעיות התקבלו על ידי ניתוק אנזימטי מכני דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה לאחר מכתים עם נוגדנים פלואורסצנטי מצמידים. לאחר אי הכללה של תאים מתים ו זוגות, בודד השעיות תא נותחו ( איור 1 ). כל השערים הוגדרו באמצעות פלואורסצנטי מינוס אחד (FMO) שולטת. מומלץ גם לבצע אי הכללה של כדורית דם (Ter119 + תאים) כדי לשפר את בהירות הניתוח ( איור 1B + CD45 Neg ; Kit + CD45 נמוך Kit CD CD45 + ( איור 1 ). האבנים נותחו עוד יותר על סמך הביטוי שלהם AA4.1 ( איורים 2-4 ). ואכן, AA4.1 הוא סמן פני השטח המאפשר העשרה של האוכלוסייה אב בתוך אבות erythromyeloid בשק החלמון, כפי שהודגם המושבות ויוצרים מבחני 15 . לאחר האוכלוסיות של עניין זוהו, אנו לכמת את יעילות תיוג YFP בכל האוכלוסייה באמצעות היסטוגרמות. בין שק החלמון Kit + אבות, הן CD45 Neg ( איור 2 א ) ו CD45 נמוך ( איור 2B ) אוכלוסיות תאים מכילים AA4.1 + YFP + תאים. עם זאת, AA4.1 + YFP <Sup> + תאים בכבד והמוח נמצאים רק Kit + CD45 נמוך אבות האוכלוסייה ( איור 3 ב ו 4 ב ). מאז, המוח אינו אתר פעיל של hematopoiesis, אבות נמצא ברקמה זו יכול להתאים אבות במחזור. זה גם מציע תהליך של הבשלות אב כפי שהם נודדים שק החלמון הכבד העובר ואת רקמות הפריפריה. קיט + אבות הראשון להביע AA4.1, ללא קשר של ביטוי CD45, אבל עד שהם מגיעים מחזור הדם הכבד עוברית, כל AA4.1 + YFP + אבות לבטא רמות לגילוי של פני השטח CD45 תאים. המקרופאגים, המוגדרים F4 / 80 בהיר CD11b +, נמצאו CD45 קיט נג + שער (איור 2-4). מקרופאגים בשק החלמון E10.5, הכבד והמוח היו מתויגים ביעילות (60 עד 80% של F4 / 80 בהיר CD11b + תאים YFP + ) יה יחיד OH-TAM הממשל ב E8.5 ( איור 2C , 3C ו 4 ג ).

כדי להשוות את יעילות תיוג בין litters, אנו ממליצים על בקרה פנימית עבור יעילות רקומבינציה משמש. השתנות ברמת הביטוי של הכתב ניתן להבחין בין ניסויים, בשל וריאציות תזמון התפתחותי בין litters זני עכבר כאשר OH-TAM מוזרק ברחם . לפיכך, אנו ממליצים כי העלאת הזמני מ E8.5 E11.5 עוברים מבוצע על ידי זוג somite לספור. בפרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש ביעילות תיוג של מקרופאגים תושב המוח (microglia) כנקודת התייחסות להשוות את היעילות של רקומבינציה Cre בין ניסויים שונים זנים ( איור 4 ג ). מקרופאגים תושב אחרים ניתן להשתמש, אבל microglia היו התאים הראשונים להיות מתואר כמו חלמון שק המקורות נגזרEf "> 16 והם מייצגים את האוכלוסייה השופעת ביותר של מקרופאגים תושב רקמות ב E10.5. לכן, תיוג YFP ב microglia ניתן להשתמש כדי להעריך את היעילות מיפוי הגורל בכל ניסוי ולהשוות נתונים שונים litters.

איור 1
איור 1: אסטרטגיה Gating לזהות תאים אב (Kit + CD45 Neg ו Kit + CD45 נמוך ) ותאי hematopoietic מובחנים (Kit Neg CD45 + ). ( א ) אפליה של תאים חיים singlets מבוצע באמצעות מכתים DAPI ו קדימה ו סייד פיזור (FSC / SSC) פרמטרים. ( B ) בעקבות אי הכללת תאי דם אדומים (Ter119 Neg ), שלוש אוכלוסיות של תאים של עניין מזוהים על בסיס הביטוי של פני התא של Kit ו CD45: Kit + CD45 Neg ; Kit + CD45 נמוך CD Kit CD45 + תאים. ( C ) Csf1r- להביע תאים בהווה כאשר OH-TAM מוזרק הצאצאים שלהם מזוהים Cre-recombinase עוברים חיוביים כמו להביע YFP לעומת עוברי Crecom recombinase שלילי (אישר מאוחר יותר על ידי assay התגובה שרשרת פולימראז, PCR). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: יעילות תיוג בשק החלמון מ E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulsed עם OH-TAM ב E8.5. ( A ) Kit + CD45 תאים Neg הם מגודרים מבוסס על ביטוי Kit ו CD45 על תאים של תאים חלמון לחיות (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit ביטוי על Kit + CD45 תאים Neg . Bluשער e מצרף AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (הלוח האמצעי). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). ( ב ) Kit + CD45 תאים נמוכים נשלטים על בסיס ביטוי ביטוי CD45 (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit הביטוי על Kit + CD45 תאים נמוכים . השער הכחול מגדיר EMP, כפי שהוגדרו AA4.1 + Kit + CD45 תאים נמוכים (לוח באמצע). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + קיט + CD45 תאים נמוכים (פאנל מימין) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). ( C ) תאים hematopoietic מוגדרים CD Kit CD45 CD CD45 + תאים. מקרופאגים מוגדרים F4 / 80 בהיר CD11b + תאים (באמצע הלוח). השוואה של תיוג YFP ב F4 / 80 בהיר CD11b + מקרופאגים (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: יעילות סימון בכבד מ E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospulsed עם OH-TAM ב E8.5. ( A ) Kit + CD45 תאים Neg הם מגודרים מבוסס על Kit ו CD45ביטוי על תאי כבד חיים (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit ביטוי על Kit + CD45 תאים Neg . שער כחול מצרף AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (באמצע הלוח). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). ( ב ) Kit + CD45 תאים נמוכים נשלטים על בסיס ביטוי ביטוי CD45 (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit הביטוי על Kit + CD45 תאים נמוכים . השער הכחול מגדיר EMP, כפי שהוגדרו AA4.1 + Kit + CD45 תאים נמוכים (לוח באמצע). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + קיט + CD45 תאים נמוכים (פאנל מימין) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוזתאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). ( C ) תאים hematopoietic מוגדרים CD Kit CD45 + ו מגודרת בכחול (פאנל שמאל). F4 / 80 ו CD11b ביטוי על Kit CD CD45 + תאים. מקרופאגים מוגדרים F4 / 80 בהיר CD11b + תאים (באמצע הלוח). השוואה של תיוג YFP ב F4 / 80 בהיר CD11b + מקרופאגים (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: יעילות תיוג במוח מ E10.5 Csf1r MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP embryospuLsed עם OH-TAM ב E8.5. ( A ) Kit + CD45 תאים Neg הם נשלטים על בסיס ביטוי ביטוי CD45 על תאים במוח חי (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit ביטוי על Kit + CD45 תאים Neg . שער כחול מצרף AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (באמצע הלוח). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + Kit + CD45 תאים Neg (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). ( ב ) Kit + CD45 תאים נמוכים נשלטים על בסיס ביטוי ביטוי CD45 (שער כחול, פאנל שמאל). AA4.1 ו Kit הביטוי על Kit + CD45 תאים נמוכים . השער הכחול מגדיר EMP, כפי שהוגדרו AA4.1 + Kit + CD45 תאים נמוכים (לוח באמצע). השוואה של תיוג YFP ב AA4.1 + Kit + CD45 נמוך C ) תאים hematopoietic מוגדרים CD Kit CD45 + ו מגודרת בכחול (פאנל שמאל). F4 / 80 ו CD11b ביטוי על Kit CD CD45 + תאים. מקרופאגים מוגדרים F4 / 80 בהיר CD11b + תאים (באמצע הלוח). השוואה של תיוג YFP ב F4 / 80 בהיר CD11b + מקרופאגים (הפאנל הימני) ב Cre שולטת שלילית (שחור) ו Cre דוגמאות חיוביות (ירוק). היסטוגרמות מייצגות את אחוז התאים (ציר y) חיובי עבור אות YFP (ציר x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גלים שונים של תאים מבשר hematopoietic חלקית חופפים בתוך מסגרת זמן קצר, מה שהופך את הניתוח של התרומה של כל גל של hematopoiesis התפתחותי לתאי החיסון מבחינה טכנית מאתגר מאוד.

טמוקסיפן- inucible Cre מערכות להציע את ההזדמנות כדי לתג תאים ספציפיים באופן זמני inducible לבצע ניתוח שושלתיות בעוברים או מבוגרים, ללא צורך vivo לשעבר או בתרבות חוץ גופית או השתלה. ב tamoxifen-inducible Cre זנים, גן היתוך נוצר בין recombinase Cre חיידקי צורה מוטציה של תחום מחייב ליגנד של קולטן אסטרוגן האדם (CRE-ER) או בין משופרת מוטציה נקודה אחת Cre ו שני קולטנים אסטרוגן העכבר (Mer-iCre-Mer). היתוך של Cre עם קולטני אסטרוגן מוביל התפיסה cytoplasmic של Cre ידי Hsp90, ובכך למנוע גרעין Cre- בתיווך רקומבינציה. טמוקסיפן (טאם) הוא מטבוליזם על ידי הכבד לתוך 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), מטבוליט פעיל שלה עם זיקה מחייב גבוהה קולטן אסטרוגן. OH-TAM מחייב את היתוך Cre מוביל הפרעה של אינטראקציה עם Hsp90, המאפשר טרנסלוקציה שלה לגרעין ייזום של רקומבינציה Cre- בתיווך. הזרקת טאם או OH-TAM ברחם לתוך נקבות בהריון הוכח להפעיל רקומבינציה בעובר המתפתח. ניהול טמוקסיפן במהלך ההריון יכול להוביל להפלה ובכך מקטין את גודל המלטה אבל זה גם מונע לידה אם נמסר לאחר ההריון באמצע, ובמקרה זה משלוח גור באמצעות ניתוח קיסרי נדרש. כדי לאזן תופעות בטמוקסיפן במהלך הריון, ואנחנו משלימים ממשל OH-TAM עם מינון חצי פרוגסטרון, על מנת לשפר את ההישרדות של עוברים ולהפחית את הסיכון של הפלות 17.

מספר מסלולים ניתן להשתמש כדי לספק TAM או OH-TAM לתוך הנקבות בהריון. כרגע אוראלי אוראליGe או intra פריטוניאלית (IP) הזרקה משמש טמוקסיפן. OH-TAM יש את היתרון להיות זמין באופן מיידי, כפי שהוא אינו דורש להיות metabolized על ידי הכבד של הסכר בהריון. עם זאת, בעוד טמוקסיפן קל מאוד להתמוסס בשמן תירס, OH-TAM קשה מאוד להכין באמצעות טכניקה זהה תוצאות תחליב. זה היה צעד מגביל להעסיק OH-TAM עבור תיוג דופק הרחם . יש לנו להתאים את הפרוטוקול להכנת OH-TAM שפותח על ידי קבוצה של JF ניקולס 13 , שם הם משתמשים PEG-35 שמן קיק, ממס עם תכונות amphiphilic כדי solubilize OH-TAM, כמו פירוק טמוקסיפן הוא אחד הצעדים הקריטיים ביותר בהליך. זה מאפשר הכנה לשחזור אופטימלי של OH-TAM ו מקצר במידה ניכרת את הזמן של הכנה טמוקסיפן. יתר על כן, יש צורך להתאים את הריכוז של OH-TAM להזריק בעת שימוש שונים זנים Cre inucible. השילוב של צבע הכדאיות (DAPI) וגודל (FSC) הוא קריטי כדי להסיר תאים מתים פסולת הסלולר, בהתאמה. תאים מתים ופסולת הם autofluorescent מאוד ברוב סגול, כחול ואדום גלאי לייזר, והוא יכול לעכב ניתוח cytometric זרימה. יתר על כן, אנחנו לא ממליצים לתקן את התאים לאחר מכתים לפני ניתוח עם cytometer זרימה. קיבוע יכול להוביל לשינויים מורפולוגיה התא ובכך הופך אפליה גודל קשה על בסיס קדימה ו פיזור צד (FSC לעומת SSC). יתר על כן, קיבוע של דגימות עם PFA מוביל לאובדן משמעותי של עוצמת פלואורסצנט YFP.

המגבלה העיקרית בפרוטוקול זה היא כי האוכלוסייה לא נבדקים על הפונקציונליות שלהם פוטנציאל בידול. על מנת להתגבר על זה, תאים ניתן למיין בעקבות פרוטוקול דומה באמצעות סדרן fluorescently מופעל תא (FACS) לבצע assay המושבה להרכיב. במקרה זה, ההליך חייב להתבצע בתנאים סטריליים ושימוש בסרום שור העובר (FBS) במאגר FACS, במקום BSA, מומלץ מאוד. יעילות תיוג נמוכה מושגת עם טכניקה זו וכתוצאה מכך מספר נמוך של YFP + תאים של עניין לכל רקמה עובריים הוא אתגר גדול במחקר של פנוטיפ EMP. פרוטוקול זה משתמש cytometer 4 זרימת לייזר. Cytometer זרימה עם 3 לייזרים יכול לשמש גם אבל חשוב להתאים את הלוח נוגדן לקחת בחשבון את החפיפה רפאים מוגברת בין צבעים. בנוסף, טיטרציה של נוגדנים נדרשת כדי למצוא את הריכוז המתאים בעת שינוי לוח הנוגדן ואנו ממליצים לבצע טיטרציה של נוגדנים ותיקוף של לוח הנוגדן החדש בניסוי טייס שבו כל העוברים לכל רקמה משולבים, על מנת להגדיל את מספר תאים ניתחו לכל רקמה.

תחום הביולוגיה ההתפתחותית חולל מהפכה בשיטת Cre / Lox, המאפשרת תיוג קבוע של תאים באתרו . גישה זו משיגהרקמות או סוג התא, באמצעות ביטוי של recombinase Cre תחת שליטה של ​​האמרגן מסוים. במקרה שלנו, בחרנו ללמוד את הביטוי של recombinase Cre תחת שליטה של ​​היזם של Csf1r (קולוני מגרה גורם פקטור 1), קולטן גורם מיטוגני וגדילה גורם מקרופאגים ואבותיהם, תוך שימוש בלחץ שפותח על ידי הקבוצה של י 'פולארד 18 . היתרון של אסטרטגיה מיפוי הגורל מבוסס על ביטוי Csf1r לעומת אסטרטגיות שפורסמו אחרים היא שהיא מאפשרת תיוג של תאים נגזר שק חלץ (EMP ו מקרופאגים) ללא תיוג כל HSCs עוברית 12 . Cx3cr1 CreERT2 זן יכול גם לתווית תאים חלמון שק ללא תיוג HSCs 19 , אולם הוא יכול רק תווית מקרופאגים מבשרי מקרופאג אבל זה לא תווית אבות EMP 1 . Cx3cr1 CreERT2 זן יש את אותה אזהרה כמו Csf1r MerCreMer 16 ו Kit MerCreMer 20 , תאי דם היקפיים מתויגים תמיד במבוגרים, אם כי על יעילות נמוכה מאוד, ובכך הוכחת תיוג של HSCs במהלך הפיתוח. בהמשך, קיט MerCreMer תוויות מיפוי גורל שק חלמון קיט + Sca1 + אבות בעוד EMP הם Kit + Sca1 שלילית 11. זן Csf1r MeriCreMer אינו דופק- in, אבל זה נוצר על ידי transgenesis תוסף קלאסי, ולכן הביטוי של Cre לא יכול לשחזר לחלוטין ביטוי אנדוגני של Csf1r. עם זאת, יש את היתרון הזה כדי למנוע כל פגמים התפתחותיים פוטנציאליים בשל הביטוי הטרוזיגוטי של Csf1r. זהו גורם חשוב לקחת בחשבון בעת ​​ניתוחאסטרטגיות אחרות של מיפוי גורל המשמשות למחקרים hematopoiesis התפתחותיים, כגון Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer ו- Cx3cr1 CreERT2 , שבו Cre inucible מוכנס - ב locus אנדוגני. הן עבור Merxremer והן עבור MerCreMer של Runx1 , פגמים המטופוליטיים התפתחותיים תוארו בעוברים הטרוזיגיים. באופן קולקטיבי, השיטה המוצגת כאן מאפשר לחקור את החלמון שק EMP ביולוגיה במהלך הפיתוח וגם מקרופאגים נגזר שק מקליפת חלבונים הנמצאים ברקמות מבוגר נבדלים מקרופאגים הנגזרות HSC. זה ישפר את ההבנה הנוכחית של השושלת הזאת של מקרופאגים תושב פונקציות ספציפיות שלהם בבגרות. אפיון immunophenotypic של EMPs שופרה לאחרונה באמצעות מיון התא ומושבה להרכיב מבחני, הוכחת כי שק החלמון EMP במיוחד להביע CD41 ו CD16 / 32 בשלבים המוקדמים של פיתוח 11 . עם זאת, את הספציפיות של הביטוי של CD41ו CD16 / 32 צרכים אפיון נוסף מ E10.5 ואילך, במיוחד בנישה כבד העובר, באמצעות מודלים מיפוי הגורל. ואכן, אם ביטוי CD41 ו CD16 / 32 הוא עדיין ספציפי EMP בהשוואה HSCs עוברית ו- HSC נגזר אבות ב E10.5 E14.5 הכבד עוברי צריך להיות מבהיר. השיטה המוצגת מאפשרת התווית EMP שנוצר בשק חלמון כדי לעקוב אחר אותם במהלך התפתחות עובריים וזה יתרום אפיון מפורט יותר של פנוטיפ EMP כאשר הם זרע הכבד העובר.

שיטה זו יכולה להיות חשובה בעתיד הקרוב ללמוד מסלולי בידול EMP. בעוד EMPs לצאת מן האנדותל שק החלמון מ E8.5 ל E10.5 4, שיטה זו מאפשרת רק התווית חלק של אבות המתעוררים בין E8.5-E9.5. לכן, מגבלה של שיטה זו היא כי רק חלק קטן EMP הוא שכותרתו, ובכך עיבוד קשה של ניתוח קלאסי של הפונקציה עם אללים floxed עבור cואת הגנים. לחלופין, תיוג דלילה יכול להיות יתרון במחקרים משובטים של בידול EMP in vivo , באמצעות כתב משובטים. עם זאת, יעילות תיוג צריך להיות מאופיין עבור כל כתב floxed או אלל floxed בשימוש, כמו היעילות רקומבינציה של מבנים floxed תלוי locus גנומי (אללים floxed) או את כתב Rosa26 לבנות. ואכן, שונים Rosa26 שורות כתב זמין עם מקדמי שונים, והוא דיווח כי Rosa26 tdTomato ו Rosa26 mTmG זן יש יעילות רקומבינציה גבוהה יותר מאשר Rosa26 LSL-eYFP קו. זן העכבר העכבר בשימוש בפרוטוקול זה הוא Rosa26 LSL-eYFP קו, אשר לא יכול לספק מידע לגבי התהליך הדינמי של התבגרות אב המוזכרים בסעיף התוצאות. שאלת תהליך ההבשלה ניתן לטפל באופן חלקי באמצעות זנים שונים של כתב כמו Rosa26 mTmG . בזן כזה, תאים יכולים להיות מרוחקיםנמדדו על פי הזמן שחלף מאז האירוע רקומבינציה. כל התאים רוזה 26 mTmG זן לבטא קרום מחויב tdTomato חלבון פלואורסצנטי ו רקומבינציה Cre מבטל את קלטת tdTomato ומאפשר ביטוי של GFP קשורה קרום. מאז tdTomato יש מחצית חיים חיים, תאים שעדיין מכילים tdTomato אבל התחילו לבטא את ה- GFP (זמן קצר לאחר רקומבינציה) הם tdTomato + GFP נמוך / int וניתן להבחין בין tdTomato Neg GFP + תאים שאינם מבטאים tdTomato יותר להביע רמות גבוהות יותר של ה- GFP (מאוחר יותר לאחר רקומבינציה).

כפי שפורט לעיל, ההכנה OH-TAM הוא צעד קריטי כדי לספק באופן עקבי מנות דומות של OH-TAM בין ניסויים כדי להפחית תופעות לוואי tamoxifen. פרוגסטרון שיתוף הממשל הוא גם שימושי כדי להגביל את ההשפעה המזיקה של טמוקסיפן על ההריון. מרכיב קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא הכדאיות של התא בודד תאN המתקבל רקמות עובריים שונים. אנחנו בדרך כלל להשיג> 90% תאים קיימא עבור ניתוח cytometric זרימה. כדי להשיג זאת, חשוב לעקוב אחר כל השלבים במהירות ולשמור על כל הדגימות על קרח לאחר איסוף רקמות. בקרות מתאימות כגון דגימות לא כתמים, כתמים בודדים פלואורסצנט מינוס אחד (FMO) שולטת נדרשים כדי לזהות גבולות השער כדי לשלוט על חפיפה רפאים לוחות רב צבעוניים. שינויים הנוגדן צריך להיות מאומת במונחים של טיטרציה נוגדנים חפיפה רפאים. לבסוף, הבחירה של זן כתב Rosa26 צריך להיות מותאם לשאלה מדעית כי הוא נחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

המחברים מודים לפרופ 'פרדריק גיסמן ופרופ' כריסטיאן שולץ על דיונים מעמיקים; ד"ר חנה גארנר לקריאה ביקורתית של כתב היד, ד"ר חאווייר מונטגוטלי וד"ר ז'אן ג'וברט ואנשי מכון החיות Institut Pasteur לתמיכה בבני אדם; ו Pascal Dardenne ו Vytaute Boreikaite, Amgen Scholar, על סיוע טכני שלהם. המחקר במעבדה EGP ממומן על ידי Institut Pasteur, CNRS, ה- Cercle FSER (FRM וחבילת פתיחה של Institut Pasteur וקונסורציום REVIVE. LI נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקונסורציום REVIVE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106, (9), 3004-3011 (2005).
  2. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126, (22), 5073-5084 (1999).
  3. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9, (6), 541-552 (2011).
  4. Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. (2015).
  5. Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139, (19), 3521-3530 (2012).
  6. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518, (7540), 547-551 (2015).
  7. Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42, (4), 665-678 (2015).
  8. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27, (6), 369-378 (2015).
  9. Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10, (5), 243-252 (1981).
  10. Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
  11. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11, (12), 1892-1904 (2015).
  12. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336, (6077), 86-90 (2012).
  13. Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
  14. Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
  15. Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (1), 134-139 (2005).
  16. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  17. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235, (9), 2603-2612 (2006).
  18. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  19. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38, (1), 79-91 (2013).
  20. Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43, (2), 382-393 (2015).
זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).More

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter