Summary

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Published: July 17, 2017
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Summary

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Abstract

Makrophagen sind professionelle Phagozyten aus dem angeborenen Arm des Immunsystems. Im stationären Zustand werden sessile Makrophagen in erwachsenen Geweben gefunden, wo sie als Frontline-Sentinels der Infektion und Gewebeschädigung wirken. Während andere Immunzellen kontinuierlich von hämatopoetischen Stammzellen und Progenitorzellen (HSPC), die sich im Knochenmark befinden, erneuert werden, wurde gezeigt, dass eine Reihe von Makrophagen, die als Resident-Makrophagen bekannt sind, in Geweben ohne Input von Knochenmark-HSPCs selbstgehalten werden. Diese Linie wird durch Mikroglia im Gehirn, Kupffer Zellen in der Leber und Langerhans Zellen in der Epidermis unter anderem veranschaulicht. Die Darm- und Colon-Lamina-Propria sind die einzigen erwachsenen Gewebe ohne HSPC-unabhängige Resident-Makrophagen. Neuere Untersuchungen haben festgestellt, dass residente Makrophagen aus der extra-embryonalen Dottersack-Hämatopoese von Progenitor (en) stammen, die sich von fetalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) unterscheiden. Unter Dottersack endgültige Hämatopoese, eRythromyeloid-Vorläufer (EMP) ergeben sowohl erythroide als auch myeloide Zellen, insbesondere residente Makrophagen. EMP werden nur innerhalb des Dottersackes zwischen E8.5 und E10.5 Tagen der Entwicklung erzeugt und sie wandern in die fetale Leber, sobald die Zirkulation verbunden ist, wo sie sich erweitern und differenzieren bis mindestens E16.5. Ihre Nachkommenschaft umfasst Erythrozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen, aber nur EMP-abgeleitete Makrophagen bestehen bis zum Erwachsenenalter in Geweben. Die vorübergehende Natur von EMP-Emergenz und die zeitliche Überlappung mit HSC-Generation macht die Analyse dieser Vorläufer schwierig. Wir haben ein Tamoxifen-induzierbares Schicksal-Mapping-Protokoll auf der Grundlage der Expression des Makrophagen-Cytokin-Rezeptor-Csf1r-Promotors zur Charakterisierung von EMP- und EMP-abgeleiteten Zellen in vivo durch Durchflusszytometrie etabliert.

Introduction

Es gibt mehrere aufeinanderfolgende, aber überlappende Wellen von hämatopoetischen Vorläufern während der Entwicklung, deren myeloide Nachkommen im Erwachsenenalter bleiben. Zuerst treten in der Maus-Dottersack 1 , 2 zwischen E7.5-E8.25 unipotent "primitive" Vorläufer auf und geben embryonale Makrophagen ohne monozytische Zwischenstufe hervor. Ob Makrophagen aus primitiven Vorläufern im erwachsenen Gehirn bestehen, da die Mikroglia ein Gegenstand der aktiven Untersuchung bleibt. Zweitens entstehen Erythro-Myeloid-Vorläufer (EMPs) im Eigelb-Sack bei E8.5, treten in den Blutkreislauf ein und kolonisieren den Embryo. EMPs entstehen aus dem hämogenen Endothel des Dottersackes in einem Runx1-abhängigen endothelial-zu-hämatopoetischen Übergang 3 , 4 . Während EMP in Makrophagen im Dottersack differenzieren kann, kolonisieren sie auch die fetale Leber vom embryonalen Tag (E) 9 5 und unterscheiden sichIn Erythrozyten, Megakaryozyten, Makrophagen, Monozyten Granulozyten und Mastzellen eindringen 6 . Die Makrophagen, die sich aus EMPs ergeben, zeigen proliferative Kapazitäten in Entwicklungs- und Erwachsenengeweben. Ob EMP-abgeleitete Makrophagen die Monozytenstadien der Differenzierung umgehen, ist noch umstritten, da sehr wenig über ihren Differenzierungsweg 7 , 8 bekannt ist . Schließlich treten Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bei E10.5 innerhalb des Embryos aus der Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region auf und wandern in die fetale Leber. HSCs mit Langzeit-Wiederauffüllungsvermögen werden erst nach E11 (bei der 42 Somite-Pair-Stufe) erkannt 9 . Dort erweitern und unterscheiden sie sich von E12.5 bis die endgültige Hämatopoese beginnt, sich auf das Knochenmark zu verlagern, das die vorherrschende Stelle der Blutzellproduktion für die Dauer des postnatalen Lebens wird 10 .

Die spAtiale und zeitliche Überlappung beim Auftauchen sowie gemeinsame immuno-phänotypische Marker hat damit unsere Fähigkeit, die spezifischen Beiträge dieser Wellen von embryonalen hämatopoetischen Vorläufern zu unterscheiden, behindert. Während sowohl EMP als auch HSC in einer Runx1-abhängigen Weise erzeugt werden und der Transkriptionsfaktor Myb und der Wachstumsfaktor-Rezeptor Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, auch bekannt als Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor-Rezeptor) genannt werden, können sich EMPs unterscheiden HSCs durch ihren Mangel an lymphoiden Potenzialen, sowohl in vitro als auch in vivo , ihr Mangel an langfristigem Rezyklierungspotential und mangelnde Oberflächenexpression des Linienmarkers Sca-1 11 . Genetische Schicksal-Mapping-Modelle sind erforderlich, um Makrophagen-Ontogenese zu charakterisieren, da sie die Ausrichtung embryonaler Progenitoren in einer zellspezifischen und zeitspezifischen Weise ermöglichen. Hier stellen wir das Schicksal-Mapping-Protokoll vor, das in unserem Labor verwendet wird, um zwischen den beiden Linien zu unterscheidenS von Makrophagen, die in den meisten erwachsenen Geweben gefunden wurden: HSC-abgeleitete infiltrierende Makrophagen und HSC-unabhängige Resident-Makrophagen.

Gewebe-residente Makrophagen wurden auf Myb-unabhängige Vorläuferzellen zurückgeführt, die den Cytokinrezeptor Csf1r 12 exprimieren und im Embryo bei E8.5-E10.5 unter Verwendung von drei komplementären Fate-Mapping-Strategien vorhanden sind 6 . Um die Dottersack-Hämatopoese ohne Etikettierung von fetalen HSCs zu untersuchen, verwenden wir einen transgenen Stamm, Csf1r MeriCreMer , der ein Tamoxifen-induzierbares Fusionsprotein von 'verbesserter' Cre-Rekombinase und zwei Maus-Östrogen-Rezeptoren (Mer-iCre-Mer) unter der Kontrolle von Der Csf1r-Promotor. Daher wird die Cre-Rekombinase in Csf1r- exprimierenden Zellen während eines begrenzten Zeitfensters aktiv sein. Bei Verwendung eines Reporterstamms, der ein fluoreszierendes Protein stromabwärts einer lox-STOP-lox-Kassette (Rosa26 LSL-eYFP ) enthält, führt es zu einem bleibendenEnt genetische Markierung der zur Zeit der Induktion vorhandenen Zellen, aber auch ihrer Nachkommenschaft. Die Verabreichung von E8.5 der aktiven Form von Tamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM), Etiketten EMPs und Makrophagen, ohne Etikettierung von Dottersack-Unipotenten "primitiven" Vorläufern oder fetalen HSCs. Dabei haben wir den Immunphänotyp von EMPs und ihre Nachkommen bei der embryonalen Entwicklung charakterisiert und den Beitrag von Dottersack-abgeleiteten Makrophagen zu den erwachsenen Makrophagen-Pools beurteilt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu charakterisieren, ob primitive Progenitor-abgeleitete Makrophagen auch mit diesem Ansatz markiert werden und ob sie zu erwachsenen Makrophagenpools beitragen können.

Protocol

Tierische Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem anerkannten institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts Pasteur (CETEA) durchgeführt. 1. In der Utero Pulse Markierung in Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryos Bereiten Sie die Stammlösung von 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml) vor. Unter der Fumehood die 25 mg-Durchstechflasche OH-TAM öffnen und 250 μl…

Representative Results

Die genetische Schicksal-Kartierung wurde durch Verabreichung bei E8.5 von OH-TAM in Csf1r-Mer-iCre-Mer-Weibchen, die mit Männern zusammenhingen, die einen Rosa26-LSL-eYFP-Reporter tragen, erreicht. In Gegenwart von OH-TAM führt die Exzision der Stop-Kassette zur permanenten Expression von YFP in den Zellen, die Csf1r exprimieren . Wir sammelten zwei hämatopoetische Gewebe: den Dottersack und die fetale Leber und ein nicht-hämatopoetisches Gewebe, das Neuroectoderm, von den …

Discussion

Die verschiedenen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen überlappen sich teilweise innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, was die Analyse des Beitrags jeder Welle der Entwicklungshämatopoese zu den Immunzellen technisch sehr anspruchsvoll macht.

Tamoxifen-induzierbare Cre-Systeme bieten die Möglichkeit, spezifische Zellen zeitlich induzierbar zu markieren und eine Abstammungsanalyse bei Embryonen oder Erwachsenen durchzuführen, ohne die Ex-vivo- oder In-vitro- Kultu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Prof. Frederic Geissmann und Prof. Christian Schulz für aufschlussreiche Diskussionen; Dr. Hannah Garner für kritische Lektüre des Manuskripts, Dr. Xavier Montagutelli und Dr. Jean Jaubert und die Mitarbeiter des Institut Pasteur Tieres zur Unterstützung bei der Maushaltung; Und Pascal Dardenne und Vytaute Boreikaite, ein Amgen Scholar, für ihre technische Unterstützung. Die Forschung im EGP-Labor wird vom Institut Pasteur, dem CNRS, dem Cercle FSER (FRM und einem Startpaket vom Institut Pasteur und dem REVIVE-Konsortium) gefördert. LI wird von einem Promotionsstipendium des REVIVE-Konsortiums unterstützt.

Materials

#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

References

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Cite This Article
Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

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