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Developmental Biology

ईरीथ्रोमाइलॉयड प्रजनकों की पहचान और उनकी गर्भ में फ्लो साइटोमैट्री द्वारा माउस भ्रूण

doi: 10.3791/55305 Published: July 17, 2017

Summary

जबकि मैक्रोफेज घुसपैठ कर रहे हैं वयस्कों के परिसंचारी से लगातार वयस्क ऊतकों को लगातार भर्ती किया जाता है, निवासी मैक्रोफेज उनके ऊतक को विकास के दौरान बीज देते हैं, जहां उन्हें पूर्वजनन से अधिक इनपुट के बिना बनाए रखा जाता है। निवासी मैक्रोफेज के लिए पूर्वजों को हाल ही में पहचान लिया गया था। यहां, हम निवासी मैक्रोफेज पूर्वज के आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण के तरीकों को प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मैक्रोफेज प्रतिरक्षा प्रणाली के सहज हाथ से पेशेवर फागोसाइट्स हैं। स्थिर-राज्य में, वयस्कों के ऊतकों में वेदांत मैक्रोफेज पाए जाते हैं, जहां वे संक्रमण और ऊतक क्षति के सामने वाले लाइन के रूप में कार्य करते हैं। अस्थि मज्जा में स्थित हेमेटोपोएटिक स्टेम और प्रजनन कोशिकाओं (एचएसपीसी) से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लगातार नवीनीकृत किया जाता है, जबकि मैक्रोफेज की एक वंश, जो कि निवासी मैक्रोफेज के रूप में जाना जाता है, को अस्थि मज्जा एचएसपीसी से इनपुट के बिना ऊतकों में स्वयं बनाए रखा गया है। यह वंश मस्तिष्क में माइक्रोग्लिया द्वारा उदाहरण दिया गया है, अन्य लोगों के बीच में एपिडर्मिस में लीवर और लैंगेरहाउस कोशिकाओं में कुफर कोशिकाएं हैं आंतों और बृहदान्त्र लैमीना प्रोप्रिया एचएसपीसी से रहित एकमात्र वयस्क ऊतक-स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज हैं। हाल ही की जांच ने पता लगाया है कि निवासी मैक्रोफेज भ्रूण हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) से अलग पूर्वपुस्र्ष (ओं) से अतिरिक्त-भ्रूण जर्दी कोशिका हेमटोपोईजिस से उत्पन्न होते हैं। जर्दी के थैले में निश्चित हीमेटोपोसीज, ईरेथ्रोमाइलॉयड प्रोजेजर (ईएमपी) विशेष रूप से निवासी मैक्रोफेज में, एरिथ्रोइड और मायलोइड कोशिकाओं दोनों को जन्म देती है। EMP विकास के E8.5 और E10.5 दिनों के बीच जर्दी के भीतर ही उत्पन्न होते हैं और वे भ्रूण के जिगर में पलायन करते हैं जैसे कि संचलन जुड़ा हुआ है, जहां वे विस्तार करते हैं और कम से कम ई 16.5 तक अंतर करते हैं। उनकी संतान में एरिथ्रोसाइट्स, मैक्रोफेज, न्युट्रोफिल और मास्ट सेल शामिल हैं, लेकिन केवल ईएमपी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ऊतकों में वयस्कता तक जारी रहती हैं। ईएमपी उभरने की क्षणिक प्रकृति और एचएससी पीढ़ी के साथ अस्थायी ओवरलैप इन प्राणायामों के विश्लेषण को कठिन बना देती है। हम एक टेमोक्सीफेन-inducible भाग्य मानचित्रण बृहतभक्षककोशिका साइटोकाइन रिसेप्टर Csf1r प्रमोटर की अभिव्यक्ति पर आधारित प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry द्वारा विवो में ईएमपी और ईएमपी व्युत्पन्न कोशिकाओं चिह्नित करने के लिए स्थापित किया है।

Introduction

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विकास के दौरान हेमेटोपोएटिक प्रजनकों के कई लगातार लेकिन अतिव्यापी तरंगें हैं, जिनके मैलॉयड संतान वयस्कता में रहते हैं। सबसे पहले, एकजुट "आदिम" प्रजनन E7.5-E8.25 के बीच माउस जर्दी कोशिका 1 , 2 में उत्पन्न होते हैं और किसी भी मोनोसाइटिक मध्यवर्ती बिना भ्रूण मैक्रोफेज को जन्म देते हैं। यद्यपि प्रौढ़ मस्तिष्क में पैदा होने वाले मैक्रोफेज वयस्क मस्तिष्क में बने रहते हैं, क्योंकि माइक्रोग्लिया सक्रिय जांच का विषय बना हुआ है। दूसरा, E8.5 में जर्दी के थैले में इरिथ्रो-मायलोइड प्रिकर्सर्स (ईएमपी) पैदा होते हैं, रक्त प्रवाह में प्रवेश करते हैं और भ्रूण को उपनिवेश करते हैं। ईएमपी एक रनक्स 1-आधारित एंडोथेलियल-टू-हेमेटोपोइएटिक संक्रमण 3 , 4 में जर्दी थैम हेमोजेनिक एन्डोथेलियम से निकलते हैं। जबकि ईएमपी जर्दी की थैली के भीतर मैक्रोफेज में अंतर कर सकता है, वे भ्रूण के दिन (ई) 9 5 और भ्रूण के यकृत से उपनिवेश करते हैंएरिथ्रोसाइट्स, मेगाकरेकोटाइटेस, मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स ग्रैन्यूलोसाइट्स और मस्ट सेल 6 में मौजूद ईएमपी से प्राप्त मैक्रोफेज विकास और वयस्क ऊतकों में प्रत्यावर्तन क्षमता दर्शाती हैं। क्या ईएमपी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज भेदभाव के मोनोसाइट चरण को बाईपास करते हैं, यह अभी भी विवादास्पद है क्योंकि उनके भेदभाव मार्ग 7 , 8 के बारे में बहुत कम जानकारी है। अंत में, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) ईओआरए-गोनैड-मेसोन्फ्रोस क्षेत्र से उचित भ्रूण के भीतर ई 10.5 पर उभरा है और भ्रूण यकृत को पलायन करता है। लंबी अवधि के पुनर्वास क्षमता वाले एचएससी केवल ई 11 (42 सोमईट जोड़ी चरण में) के बाद पता चला है 9 । वहां, वे विस्तार और अंतर E12.5 से लेकर निश्चित हीमटोपोइजिस को अस्थि मज्जा में बदलना शुरू कर देते हैं, जो जन्मजात जीवन की अवधि 10 के लिए रक्त कोशिका के उत्पादन की प्रमुख स्थान बन जाता है।

एसपीउभरने में शास्त्रीय और अस्थायी ओवरलैप, साथ ही साझा इम्युनो-फेनोटिप्टिक मार्करों ने अब तक भ्रूण के हेमेटोपोइएटिक प्रजनकों के इन तरंगों के विशिष्ट योगदानों को अलग करने की हमारी क्षमता को दूर किया है। जबकि दोनों ईएमपी और एचएससी एक रनक्स 1-आश्रित तरीके से उत्पन्न होते हैं और ट्रांसक्रिप्शन कारक माइब और विकास कारक रिसेप्टर सीएसएफ 1 आर (कॉलोनी-स्टाइमुलेटिंग फैक्टर 1 रिसेप्टर, जिसे मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर रीसेप्टर के रूप में भी जाना जाता है) को व्यक्त करते हैं, ईएमपी को अलग-अलग से अलग किया जा सकता है एचसीएस अपने इन विट्रो और विवो दोनों में लिम्फोइड क्षमता की कमी से, लंबे समय तक पुनर्स्थापना करने की क्षमता की कमी और वंशावली मार्कर Sca-1 11 की सतह अभिव्यक्ति की कमी है। आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण मॉडल को मैक्रोफेज ऑनटोजनी को चिह्नित करने की आवश्यकता होती है क्योंकि वे सेल-विशिष्ट और समय-विशिष्ट तरीके से भ्रूणीय प्रजनन को लक्षित करने की अनुमति देते हैं। यहाँ हम दो वंश के बीच भेदभाव करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त नियत-मैपिंग प्रोटोकॉल पेश करते हैंअधिकांश प्रौढ़ ऊतकों में पाया गया मैक्रोफेज: एचएससी-व्युत्पन्न घुसपैठ मैक्रोफेज और एचएससी-स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज।

ऊतक निवासी मैक्रोफेज Myb स्वतंत्र अग्रदूत कोशिकाओं साइटोकाइन रिसेप्टर व्यक्त Csf1r 12 के लिए वापस पता लगाया गया और E8.5-E10.5 पर भ्रूण तीन पूरक भाग्य-मानचित्रण रणनीतियों 6 का उपयोग में मौजूद हैं। भ्रूण एचएससी लेबल किए बिना जर्दी थैली हेमटोपोईजिस का अध्ययन करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक तनाव, सीएसएफ 1 आर मेरि क्रेमर का उपयोग करते हैं, जिसमें 'सुधारित' री रिमबनीज़ और दो माउस एस्ट्रोजेन रिसेप्टर (मेर-आईसीआरई-मेर) के नियंत्रण के तहत एक टेमॉक्सीफेन-अनुक्रमिक संलयन प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। सीएसएफ 1 आर प्रमोटर इसलिए, एक सीमित समय-खिड़की के दौरान सीआरएफ -1 आर-एस्प्रेसिंग कोशिकाओं में cre रीकंबीनस सक्रिय हो जाएगा। जब एक रिपोर्टर तनाव के साथ प्रयोग किया जाता है जिसमें एक लॉक्स-स्टॉप-लॉक्स कैसेट ( रोसा 26 एलएसएल-ईआईएफपी ) के फ्लोरोसेंट प्रोटीन डाउनस्ट्रीम होता है, तो यह स्थायीप्रवेश के समय पर मौजूद कोशिकाओं का एंट आनुवंशिक लेबलिंग लेकिन उनकी संतान की भी। तामॉक्सिफ़ेन, 4-हाइड्रॉक्सीटामॉक्सिफ़ेन (ओएच- टीएएम) के सक्रिय रूप के ई 8.5 पर प्रशासन, ईपीपी और मैक्रोफेज लेबल, बिना जर्दी के थैली के लिए "आदिम" पूर्वज या भ्रूण एचएससी लेबलिंग के बिना। इसके द्वारा, हमने ईएमपी के इम्युनोफेनोटाइप और भ्रूण के विकास के दौरान उनकी प्रजनन, साथ ही साथ वयस्क मैक्रोफेज पूलों में जर्दी के सैक-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का योगदान मूल्यांकन किया है। इस बात के लिए अधिक काम करना आवश्यक है कि क्या प्राचीन पूर्वज-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए लेबल किया गया है और क्या वे वयस्क मैक्रोफेज पूलों में योगदान कर सकते हैं।

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Protocol

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पशु प्रक्रियाएं अनुसूचित संस्थागत पशु देखभाल और इंस्टीट्यूट पाश्चर (सीईटीईए) के उपयोग समिति के अनुसार किए गए थे।

1. Csf1r MeriCreMer रोजा LSL-YFP भ्रूण में Utero पल्स लेबलिंग में

  1. 4-हाइड्रोक्सीटामॉक्सीफैन (ओएच-टीएएम, 50 मिलीग्राम / एमएल) के स्टॉक समाधान को तैयार करें
    1. फ्यूमेहूद के तहत, ओएच-टीएएम के 25 मिलीग्राम शीशी को खोलें और 250 μL इथेनॉल (100%) जोड़ें।
    2. 10 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक छोटा टिप और भंवर के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब को ओएच-टीएएम समाधान ट्रांसफर करें।
    3. एक sonicator स्नान में 30 मिनट Sonicate।
    4. 50 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए फ्यूमहूड के तहत 250 μL पीईजी -35 एरियल ऑयल जोड़ें।
      नोट: पीईजी -35 एरियल ऑयल एल्फीफिलिक गुणों के साथ विलायक है जो हाइड्रोफोबिक अणुओं को बांधता है और उन्हें जलीय सॉल्वैंट्स में सोल्यूबल करता है।
    5. लगभग 5 मिनट के लिए भंवरअधिकतम गति पर और sonicator स्नान में 30 मिनट sonicate।
    6. सूक्ष्म अंतर 90 μL (4.5 मिलीग्राम) प्रति microcentrifuge ट्यूब (इंजेक्शन प्रति 1 विभाज्य)।
    7. पहले से वर्णित 13 के रूप में लंबे समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रोजेस्टेरोन का स्टॉक समाधान तैयार करें (10 मिलीग्राम / एमएल)
    1. फ्यूमहाउड के तहत 10 मिलीग्राम / 100 μL निलंबन तैयार करने के लिए 250 μL का 100% इथनॉल 25 मिलीग्राम प्रोजेस्टेरोन में जोड़ें। भंवर धीरे
    2. हुड के तहत 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोजेस्टेरोन समाधान बनाने के लिए 2250 μL ऑटोकल्वड सूरजमुखी तेल जोड़ें।
    3. अधिकतम गति, विभाज्य और 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 मिनट के लिए भंवर ध्यान दें कि समाधान संग्रहीत करते समय स्पष्ट होता है।
  3. टैमॉक्सीफेन प्रशासन
    नोट: भ्रूणिक विकास का अनुमान लगाया गया था कि भ्रूण दिवस (ई) 0.5 के रूप में योनि प्लग बनाने के दिन पर विचार किया गया था। E8.5 पर एकल इंजेक्शन द्वारा पुनर्संयोजन प्रेरित हैगर्भवती सीएसएफ 1 आर मेरि क्रेमर मादा 12 में टेमॉक्सीफाइन प्रशासन के बाद गर्भपात दर को कम करने के लिए प्रोजेस्टेरोन की 37.5 ग्राम प्रति ग्राम के साथ ओएच-टीएएम को पूरक। सुबह 1 बजे (सुबह मनाया योनि प्लग के लिए) इंजेक्षन।
    1. इंजेक्शन की सुबह, ओह-टीएएम समाधान के 10 मिनट के लिए या (जब तक पूरी तरह से पुन: संयोजित नहीं किया गया हो) एक विभाज्य को दोहराएं।
    2. एक 10 मिलीग्राम / एमएल ओएच-टीएएम समाधान और भंवर को अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए फ्यूमहूड के तहत 360 μL NaCl 0.9% जोड़ें। जब तक समाधान समाधान स्पष्ट नहीं होता है और पूरी तरह से रिजसेंड होता है (कम से कम 30 मिनट)।
    3. कमरे के तापमान पर पूर्व गर्म प्रोजेस्टेरोन
    4. माइक्रोस्कोर्रिज ट्यूब में 450 μL ओएचटीएम और प्रोजेस्टेरोन के 225 μL मिलाएं। भंवर।
    5. 25 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज पर कम से कम 10 मिनट और लोड करें।
    6. पशु की सुविधा में, गर्भवती महिला का वजन ( सीएसएफ 1 आर मेरि क्रेमर मादाएं एक संक्रमित एफवीबी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में होती हैं और ठेठ वजन कम होती हैएन 25 और 33 ग्राम)
    7. धीरे-धीरे माउस में गणना की गई मात्रा को इंजेक्शन करके एक इंट्रा-पेरीटोनियल इंजेक्शन करें सुई को वापस लेने के बाद, धीरे-धीरे पंचर घाव पर दबाएं और पेट को ओएच-टीएएम वितरित करने के लिए मालिश करें।
      नोट: ओएच-टीएएम इंजेक्शन खुराक 75 मिलीग्राम / किग्रा है और प्रोजेस्टेरोन की मात्रा 37.5 मिलीग्राम / किग्रा है। तालिका 1 गर्भवती मादाओं में इंजेक्शन के लिए मात्रा प्रदान करता है।
</ Tr>
माउस वजन (जी) मिश्रण (μL) से इंजेक्षन करने के लिए कुल मात्रा
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

तालिका 1: इंजेक्शन मात्रा 4-ओएच-टैमॉक्सीफैन (ओएच-टीएएम) प्रोजेस्टेरोन के प्रति 37.5 ग्राम प्रति ग्राम के साथ पूरक ओएच-टीएएम के प्रति वजन (ग्राम वजन) के प्रति ई8.5 75 μg पर एक इंजेक्शन के लिए आवश्यक मात्रा।

2. योक सैक (वाईएस) और फेटल लिवर (एफएल) का विच्छेदन

नोट: भ्रूण को जोड़ते समय कठोर बाँझ तकनीकें आवश्यक नहीं होती हैं, जब तक कि वे दीर्घकालिक संस्कृति के लिए उपयोग नहीं किए जा रहे हों। फिर भी, शोषक कागज के तहत काम करने वाले क्षेत्र को पन्नी में साफ और कवर किया जाना चाहिए।

  1. बर्फ-ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और पाचन मिश्रण (पीबीएस युक्त 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनज़ डी, 100 यू / एमएल डीओक्सीरिबोन्यूकेस आई (डीएनसे आई) और 3% भ्रूण गोजातीय सीरम) तैयार करें।
  2. सीर द्वारा गर्भवती मादाओं का बलिदानआवश्यक गर्भावस्था दिवस पर विचित्र अव्यवस्था ( जैसे भ्रूण चरण E10.5)।
  3. जननांगों के ऊपर त्वचा को चुटकी और कैंची के साथ मिडलाइन पर एक छोटा चीरा बनाना। फर्श के बिना पूरी तरह से शरीर की दीवार को उजागर करने के लिए सिर की ओर त्वचा को खींचो। पेट की मांसपेशियों को काटकर आंतरिक अंग का पर्दाफाश करें और दो गर्भाशय सींगों को बेनकाब करने के लिए पेट को दबाएं।
  4. मध्यम आकार की कुंद संदंश के साथ, अंडाशय से जुड़ी वसा-पैड को पकड़ो और धीरे से गर्भाशय खींचें। गर्भाशय के सींगों के ग्रीवा स्तर पर काटें और पेरिटोनियल गुहा से सींग उठाएं। गर्भाशय सींग पूरी तरह से मुक्त करने के लिए वसा-पैड निकालें और हर तरफ अंडाशय से सींगों को काट लें।
  5. सींग को 10 मिमी पेट्री डिश में बर्फ-ठंडा पीबीएस में रखो। गर्भाशय की मांसपेशियों की परतों को एक छोर (गर्भाशय ग्रीवा के अंत) पर तेजी से पकड़ कर और मांसपेशियों की परत और निर्णायक टिश्यू के बीच के ठीक कैंची को स्लाइड करें ताकि आसपास के decidual tissues के साथ भ्रूण को छोड़ दें।
    नोट: मांसपेशियों में तेजी से अनुबंध होता हैनिष्कर्षण, तो यह कदम संभव के रूप में जल्दी होना चाहिए।
  6. रीचीर्ट की झिल्ली और नाल को काटने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें
  7. धीरे से जर्दी के थैली को हटा दें और इसे 24-अच्छी टिशू कल्चर प्लेट में 0.5 एमएल पाचन मिश्रण के साथ रखें।
    नोट: इस चरण पर, भ्रूण के रक्त को एकत्र किया जा सकता है।
    1. नाभि और विटाइललाइन जहाज़ों को तोड़ने के तुरंत बाद, भ्रूण को 12-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 10 मिमी बर्फ-ठंडे एथिलएंडियमिनेटेट्रैसिसेटिक एसिड (ईडीटीए) शामिल हैं। भ्रूण को तेज ठीक कैंची का उपयोग करके, जितना संभव हो उतना टिशू डेंसेरेशन को सीमित करने की कोशिश करना। 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं और रक्त युक्त ईडीटीए इकट्ठा करते हैं।
  8. भ्रूण के आसपास के एमिनेशन को निकालें
  9. चरणों के लिए <E11.5, भ्रूण के बेहतर स्टेजिंग और बेहतर समय संकल्प के लिए कुछ जोड़े की संख्या की गणना करें (प्रत्येक सोमते जोड़ी ~ 1 एच 30 मिनट में विकसित होती है)।
  10. हमें भ्रूण के सिर को काट लेंसंदंश या ठीक कैंची 0.5 एमएल पाचन मिश्रण के साथ एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में सिर को स्थानांतरित करें।
    नोट: बाद के चरणों में neuroectoderm और मस्तिष्क आगे प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए विच्छेदित कर रहे हैं; ध्यान से आसपास के नाड़ी जाल को हटा दें
  11. हिंदुओं के ऊपर भ्रूण को काटें और अग्रगमन हटा दें।
  12. जिगर को अलग करने के लिए, ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके छाती को खोलें। दिल से पूर्व में पिंच और शरीर से अंग को मुक्त करने के लिए दूसरी संदंश का उपयोग करते हुए धीरे से खींचें।
    1. दिल और पेट से भ्रूण जिगर को ध्यान से अलग करें भ्रूण यकृत को एक 24-अच्छी तरह से थाली में 0.5 एमएल पाचन मिश्रण के साथ स्थानांतरित करें। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत स्थानांतरण की निगरानी करें।
  13. पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया परख (पीसीआर) द्वारा जीनोटाइपिंग के लिए पूंछ क्षेत्र (या कोई अन्य भ्रूण भाग) लीजिए।
    नोट: फ्लो साइटमैट्री का उपयोग करके इसी तरह के विश्लेषण के लिए अन्य ऊतकों और अंगों को ई 10.5 भ्रूण से काटा जा सकता है। रक्त, सिर स्कीएन, महाधमनी-गोंनाद-मेसोनीफे्रस क्षेत्र (एजीएम), हृदय और न्यूरोकेडर्म ई10.5 में एकत्र किया जा सकता है। बाद के चरणों में, फेफड़े, गुर्दा, प्लीहा और अग्न्याशय भी एकत्र किया जा सकता है। विभिन्न विकास के चरणों में एजीएम के विच्छेदन का विस्तृत विवरण पहले से 14 में वर्णित किया गया है।

3. फ्लो साइटोमेट्री के लिए भ्रूण के ऊतकों की प्रक्रिया

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंगों (पाचन मिश्रण में रखा) सेते हैं
  2. एफएसीएस बफर के 6 मिलीलीटर (0.5% गोजाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) और 1 एमबी ईडीटीए में 1x पीबीएस) से भरी एक 6 सूक्ष्म ऊतक कल्चर प्लेट में रखा गया एक 100 सुक्ष्ममापी झरनी पर ऊतक और एंजाइमेटिक समाधान को ट्रांसफर करें। एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 2 एमएल सिरिंज के ब्लैक रबर पिस्टन के साथ धीरे से मैशिंग करके यंत्रवत रूप से अलग करना।
    नोट: अब से, सभी चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए
  3. एक पाश्चर विंदुक के साथ सेल निलंबन ले लीजिए और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण।
  4. एसपीआई7 मिनट के लिए 320 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  5. 60 μL एफसी-अवरोधक बफर (सीडी 16 / सीडी 32 अवरुद्ध एंटीबॉडी में 1/50 एफएसीएस बफर पतला) में गोली को फिर से खोलें।
    1. एक गोल नीचे 96 बहु-अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से एक सेल निलंबन के 50 μL स्थानांतरण। बर्फ पर कम से कम 15 मिनट सेते हैं
      नोट: नमूनों की एक छोटी संख्या को संभालने पर 5 एमएल पॉलिस्टीन एफएसीएस ट्यूबों में धुंधला हो सकता है।
    2. प्रत्येक ऊतक से नमूनों का एक पूल प्राप्त करने के लिए शेष 10 μL को 5 एमएल पॉलिस्टीन एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरण करें। यह पूल नियंत्रण के रूप में काम करेगा ( अर्थात् एक फ्लोरोक्रोम के लिए अस्थिर नमूने और फ्लोरोसेंट माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण)। प्रत्येक फ्लोरोसेंट माइनस एक (एफएमओ) नियंत्रण (एक प्रति फ्लोरोक्रोम) के लिए पूल की 50 μL को 96 बहु-अच्छी तरह से प्लेट में ट्रांसफर करें।
      नोट: प्रत्येक एफएमओ नियंत्रण में एंटीबॉडी पैनल से सभी फ्लोरोक्रोम-युग्मित एंटीबॉडी होते हैं, एक को छोड़करकि मापा जा रहा है एफएमओ फाटक की सीमाओं की पहचान करने के लिए और बहुरंगा पैनल में वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है। विभिन्न ऊतकों के बीच पृष्ठभूमि और आटोफ़्लोरेसेंस में भिन्नताओं को सही ढंग से संबोधित करने के लिए, इन नियंत्रणों को प्रत्येक ऊतक के नमूने के पूल से तैयार करना महत्वपूर्ण है। YFP अभिव्यक्ति के लिए उचित नियंत्रण, CRE-नकारात्मक भ्रूण के नमूने होंगे, जो पीसीआर जीनोटाइपिंग द्वारा पुष्टि की जाती हैं।

4. भूतल एंटीजन स्टैनिंग

  1. एफएसीएस बफर (तालिका 2) में एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। नमूना प्रति 50 μL एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
    1. निम्न फ्लोराकोरम-युग्मित एंटीबॉडी का प्रयोग करें: एंटी-सीडी 45.2 (क्लोन 104); एंटी-सीडी 11 बी (क्लोन एम 1/70); एंटी-एफ 4/80 (क्लोन बीएम 8); एंटी-एए 4.1 (क्लोन एए 4.1); विरोधी किट (क्लोन 2 बी 8); और विरोधी Ter119 (क्लोन Ter119)।
    2. एफएसीएस बफर में एफएमओ नियंत्रण के लिए छह एंटीबॉडी मिक्स तैयार करें प्रति नियंत्रण नमूना प्रति 50 μL एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
      नहींते: एंटीबॉडी मिश्रण में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने सामग्री तालिका में दर्शाए अंतिम एकाग्रता की तुलना में दो गुना अधिक केंद्रित है। छह फ्लोराकोम-युग्मित एंटीबॉडी वाले एक पैनल के लिए, 6 एफएमओ नियंत्रण तैयार हैं। तालिका 2 एक ट्यूब के लिए एंटीबॉडी मिश्रण और एफएमओ नियंत्रण की संरचना प्रदान करता है।
एंटीबॉडी का वॉल्यूम (μL) (अंतिम मात्रा 50 μL)
एंटीबॉडी क्लोन एंटीबॉडी मिक्स एफएमओ सीडी 45.2 एफएमओ सीडी 11 बी एफएमओ एफ 4/80 एफएमओ एए 4.1 एफएमओ किट एफएमओ टेर119
विरोधी CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
विरोधी CD11b एम 1/70 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5
विरोधी F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
विरोधी AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
विरोधी किट 2B8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5
विरोधी Ter119 Ter119 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
एफएसीएस बफर 45.5 46.5 46 46.5 46.5 46 46

तालिका 2: धुंधला हो जाना और फ्लोरोसेंट माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रणों के लिए एंटीबॉडी का वॉल्यूम 50 μL की अंतिम मात्रा के लिए आवश्यक एंटीबॉडी के वॉल्यूम (μL)

  1. 96-मल्टीवेल प्लेट में नमूनों के लिए एंटीबॉडी मिश्रण का 50 μL जोड़ें (धुंधला के दौरान अंतिम मात्रा 100 μL है) धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट दो बार और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  2. 7 मिनट के लिए 96-मल्टीवेल प्लेट को 320 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एफएसीएस बफर के 200 μL में Resuspend।
  3. दोहराएँ धोने की प्रक्रिया (चरण 4.3) 150 μL एफएसीएस बफर के साथ दो बार।
  4. नमूने और नियंत्रण (एफएमओ और अस्थिर पूल नमूने) को 5 एमएल पॉलीस्टीरीन ट्यूबों में 70 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। अधिग्रहण तक बर्फ पर स्टोर करें

5. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा ईएमपी और वाईएस-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की पहचान

नोट: इस प्रोटोकॉल को 4 लेजर फ्लो साइटोमीटर ईक का उपयोग करके अनुकूलित किया गया थाएक 405 एनएम वायलेट लेजर, एक 488 एनएम ब्लू लेजर, एक 562 एनएम पीला लेजर और एक 638 एनएम लाल लेजर के साथ।

  1. निर्माता के निर्देशों के बाद प्रत्येक युग्मित एंटीबॉडी के लिए मुआवजा मोतियों को तैयार करें। लेसर तीव्रताओं को अनुकूलित करने के लिए अस्थिर नमूनों और मुआवजा मोती का उपयोग करें।
  2. फाटक सीमाओं की पहचान करने के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एफएमओ (प्रतिदीप्ति शून्य से) नियंत्रणों का उपयोग करें
  3. मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, अधिग्रहण से 1 मिनट पहले 1 मिनट डीपीआई (1 मिलीग्राम / एमएल) ट्यूब में जोड़ें (जिसमें 200 μL दाग सेल निलंबन होता है) 1 मिनट से पहले। मृत कोशिकाओं और मलबे का बहिष्कार करने के लिए मजबूत डीएपीआई संकेत और आगे-बिखरे पैरामीटर (एफएससी) का प्रयोग करें।
    नोट: अधिग्रहण के दौरान फाटकों को आकर्षित करने के लिए प्रवाह साइटमीटर से सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स और विश्लेषण अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए नमूना अधिग्रहण के बाद किया जा सकता है।
  4. लाइव इवेंट के लिए आगे और साइड स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) का उपयोग करें और कुल कार्यक्रमों से भेदभाव को दोहराएं।
  5. लॉग स्केल अक्ष में प्रतिदीप्ति डॉट प्लॉट बनाएं और बेटी फाटकों को पहले, एरिथ्रोसाइट्स (टेर 11 9 + ) को बाहर करने के लिए और फिर, पूर्व कोशिका कोशिकाओं (किट + ) और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं (सीडी 45 + किट नीग ) ( चित्रा 1 देखें) की पहचान करने के लिए आकर्षित करें।
  6. वाईएस ( चित्रा 2 ), भ्रूण यकृत ( चित्रा 3 ) और मस्तिष्क ( चित्रा 4 ) में विभिन्न पहचानी गई आबादी के बीच YFP की लेबलिंग दक्षता का परिमाण के लिए प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम बनाएं।

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Representative Results

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आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण, प्रशासन द्वारा ए 8.5 के ओएच-टीएएम में सीएसएफ 1 आर-मेर-आईसीआरई-एमएआर में रोज़ा 26-एलएसएल-ईआईएफपी रिपोर्टर वाले पुरुषों के साथ मिलकर हासिल किया था। ओएच-टीएएम की उपस्थिति में, स्टॉप कैसेट का छांटना सीएसएफ 1 आर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में वाईएफपी की स्थायी अभिव्यक्ति की ओर जाता है। हमने दो हेमेटोपोएटिक ऊतकों को इकट्ठा किया: ई 10.5 पर भ्रूणों से जर्दी का थैला और भ्रूण यकृत और गैर-हेमटेटोपोएटिक ऊतक, न्यूरोकेडर्मम। एकल-सेल निलंबन एंजायमेटिकल और मैकेनिकल पृथक्करण द्वारा प्राप्त किए गए थे और फ्लोरोसेंट-युग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद फ्लो साइटमैट्री द्वारा नमूनों का विश्लेषण किया गया था। मृत कोशिकाओं और दुगने के बहिष्करण के बाद, एकल कक्ष निलंबन का विश्लेषण किया गया ( चित्रा 1 )। सभी गेट्स फ्लोरोसेंस मिनस वन (एफएमओ) नियंत्रणों के माध्यम से परिभाषित किए गए थे विश्लेषण की स्पष्टता में सुधार करने के लिए एरीथ्रोसाइट बहिष्कार (टेर 11 9 + कोशिकाओं) को भी करने की सलाह दी जाती है ( चित्रा 1 बी + सीडी 45 नीग ; किट + सीडी 45 कम और किट नैग सीडी 45 + ( चित्रा 1 )। एए 4 4 ( आंकड़े 2-4 ) की अभिव्यक्ति के आधार पर पूर्वजनों का विश्लेषण किया गया था। दरअसल, एए 4.1 एक सतह मार्कर है जो जर्दी के थैले में एरिथ्रोमेलॉयड प्रजनन के भीतर पूर्व जनसंख्या जनसंख्या के संवर्धन की अनुमति देता है, जैसा कि कॉलोनी 15 एसेल्स बनाने में प्रदर्शित होता है। एक बार ब्याज की आबादी की पहचान की गई, हमने हिस्टोग्राम का इस्तेमाल करते हुए प्रत्येक आबादी में वाईएफपी लेबलिंग दक्षता को मापने की कोशिश की। जर्दी थैली किट + प्रजनन के बीच, सीडी 45 एनजी ( चित्रा 2 ए ) और सीडी 45 कम ( चित्रा 2 बी ) सेल आबादी दोनों में एए 4.1 + वाईएफपी + कोशिकाएं होती हैं। हालांकि, AA4.1 + YFP <जिगर और मस्तिष्क में +> कोशिकाओं को केवल किट + सीडी 45 कम जनसंख्या आबादी ( चित्रा 3 बी और 4 बी ) में पाया जाता है। चूंकि, मस्तिष्क हीमटोपोइजिस का एक सक्रिय स्थल नहीं है, इस ऊतक में पाया जाने वाला पूर्वज पूर्वजों के परिसंचारी के अनुरूप हो सकता है। यह भी पूर्वजों परिपक्वता की एक प्रक्रिया का सुझाव देता है क्योंकि ये जर्दी की थैली से भ्रूण के यकृत और परिधीय ऊतकों तक पहुंच जाते हैं। किट + प्रजनन पहले सीएडी 445 अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति के एए 4.1 को अभिव्यक्त करते हैं, लेकिन जब तक वे परिसंचरण और भ्रूण यकृत पहुंचते हैं, सभी एए 4.1 + वाईएफपी + पूर्वज सेल की सतह सीडी 45 के पता लगाने योग्य स्तरों को व्यक्त करते हैं। मैक्रोफेज, जिसे F4 / 80 उज्ज्वल सीडी 11 बी + के रूप में परिभाषित किया गया, किट नेग CD45 + गेट ( चित्रा 2-4 ) में पाया गया। ई 10.5 जर्दी थैली, यकृत और मस्तिष्क में मैक्रोफेज कुशलतापूर्वक लेबल किए गए थे (60 से 80% F4 / 80 उज्ज्वल सीडी 11 बी + कोशिकाएं YFP + ) बी हैं या तो एकल ओएच-टीएएम प्रशासन E8.5 ( चित्रा 2 सी , 3 सी और 4 सी ) पर।

लिटर के बीच लेबलिंग दक्षता की तुलना करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि पुनर्संयोजन दक्षता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण का उपयोग किया जाता है। OH-TAM को utero में अंतःक्षिप्त किया जाता है जब लिटर और माउस उपभेदों के बीच के विकास के समय में भिन्नता के कारण, रिपोर्टर के अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तनशीलता को देखा जा सकता है। इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि E8.5 से E11.5 भ्रूण के भ्रूण स्टेजिंग को सोमईट जोड़ी गिनती द्वारा किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज (माइक्रोग्लिया) में लेबलिंग दक्षता का प्रयोग करने का प्रस्ताव करते हैं, जो कि विभिन्न प्रयोगों और उपभेदों ( चित्रा 4 सी ) के बीच में पुन: संयोजन की दक्षता की तुलना करने के संदर्भ में है। अन्य निवासी मैक्रोफेज का इस्तेमाल किया जा सकता है, यद्यपि माइक्रोग्लिया पहले कोशिका थे जो जैक सिक-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के रूप में वर्णित किए जाते थे16 "और वे ई 10.5 में ऊतक निवासी मैक्रोफेज की सबसे प्रचलित आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रकार, माइक्रोग्लिया में वाईएफपी लेबलिंग प्रत्येक प्रयोग में भाग्य-मैपिंग दक्षता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विभिन्न लिटरों से डेटा की तुलना कर सकता है।

आकृति 1
चित्र 1: पूर्वज कोशिकाओं (किट + CD45 neg और किट + CD45 कम) और विभेदित hematopoietic कोशिकाओं (किट neg CD45 +) की पहचान करने की रणनीति Gating। ( ) डीएपीआई धुंधला और आगे और साइड स्कैटर (एफएससी / एसएससी) मापदंडों का उपयोग करते हुए लाइव कोशिकाओं और सिंगलल्स का भेदभाव किया जाता है। ( बी ) लाल रक्त कोशिका बहिष्करण (टेरा 11 9 नकारात्मक ) के बाद, ब्याज की कोशिकाओं की तीन आबादी किट और सीडी 45 की सेल की सतह अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाने जाते हैं: किट + सीडी 45 एनजी ; किट + सीडी 45 कम नेग CD45 + कोशिकाएं ( सी ) सीएसएफ 1 आर-व्यक्त कोशिकाओं को ओह-टीएएम इंजेक्ट करते वक्त पेश होते हैं और क्रोन-रेकंबेनेस नकारात्मक भ्रूण के मुकाबले YFP को अभिव्यक्त करने के रूप में क्र-रीकंबैनेस सकारात्मक भ्रूण में उनकी संतान की पहचान की जाती है (बाद में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन परख, पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: E10.5 सीएसएफ 1 आर मेरीक्रैमर रोज़ा 26 एलएसएल -ईआईएफपी द्वारा जर्दी की थैली में लेबलिंग दक्षता -8.5 पर ओएच-टीएएम के साथ भ्रूण -स्पेशल ( ) किट + सीडीआईआर नेग कोशिकाओं को जीट जर्दी कोशिकाओं (नीले गेट, बाएं पैनल) पर किट और सीडी 445 अभिव्यक्ति पर आधारित गेट लगाया गया है। किट + CD45 neg कोशिकाओं पर AA4.1 और किट अभिव्यक्ति। ब्लूई गेट AA4.1 + किट + CD45 neg कोशिकाओं (मध्य पैनल) encloses। AA4.1 + Cre नकारात्मक नियंत्रण (काला) और रचनात्मक सकारात्मक नमूने (हरा) में किट + CD45 neg कोशिकाओं (सही पैनल) में YFP लेबलिंग की तुलना। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( बी ) किट + सीडी 45 कम कोशिकाएं किट और सीडी 45 अभिव्यक्ति (नीले गेट, बाएं पैनल) पर आधारित होती हैं। एए 4.1 और किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं पर किट अभिव्यक्ति ब्लू गेट ईएमपी संलग्न करता है, जैसा कि एए 4.1 + किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। एए 4.1 + किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं (क्रोनिक कंट्रोल (ब्लैक) और क्रे पॉजिटिव नमूनों (हरे) में YFP लेबलिंग की तुलना। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( सी ) हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को किट नेग CD45 के रूप में परिभाषित किया गया है नैग सीडी 45 + कोशिकाओं पर एफ 4/80 और सीडी 11 बी एक्सप्रेशन। मैक्रोफेज को F4 / 80 उज्ज्वल CD11b + कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। ईएएफपी लेबलिंग की तुलना F4 / 80 उज्ज्वल सीडी 11 बी + मैक्रोफेज (सही पैनल) में क्र नकारात्मक नियंत्रण (काला) और क्रे सकारात्मक नमूने (हरा)। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: ई -10.5 सीएसएफ 1 आर मेरि क्रेमर रोजा 26 एलएसएल -ईआईएफपी से यकृत में लेबलिंग दक्षता -8.5 पर ओएच-टीएएम के साथ भ्रूण -आंसरित हुई। ( ) किट + सीडीआईआर नेग कोशिकाओं को किट और सीडी 45 पर आधारित gated हैंलाइव यकृत कोशिकाओं (नीला गेट, बाएं पैनल) पर अभिव्यक्ति। किट + CD45 neg कोशिकाओं पर AA4.1 और किट अभिव्यक्ति। ब्लू गेट AA4.1 + किट + CD45 neg कोशिकाओं (मध्य पैनल) encloses। AA4.1 + Cre नकारात्मक नियंत्रण (काला) और रचनात्मक सकारात्मक नमूने (हरा) में किट + CD45 neg कोशिकाओं (सही पैनल) में YFP लेबलिंग की तुलना। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( बी ) किट + सीडी 45 कम कोशिकाएं किट और सीडी 45 अभिव्यक्ति (नीले गेट, बाएं पैनल) पर आधारित होती हैं। एए 4.1 और किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं पर किट अभिव्यक्ति ब्लू गेट ईएमपी संलग्न करता है, जैसा कि एए 4.1 + किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। एए 4.1 + किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं (क्रोनिक कंट्रोल (ब्लैक) और क्रे पॉजिटिव नमूनों (हरे) में YFP लेबलिंग की तुलना। हिस्टोग्राम का प्रतिशत दर्शाता हैYFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक ( सी ) हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को किट ओग सीडी 45 + के रूप में परिभाषित किया गया है और नीले रंग में बाएं (बाएं पैनल)। किट नैग सीडी 45 + कोशिकाओं पर एफ 4/80 और सीडी 11 बी एक्सप्रेशन। मैक्रोफेज को F4 / 80 उज्ज्वल CD11b + कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। ईएएफपी लेबलिंग की तुलना F4 / 80 उज्ज्वल सीडी 11 बी + मैक्रोफेज (सही पैनल) में क्र नकारात्मक नियंत्रण (काला) और क्रे सकारात्मक नमूने (हरा)। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: मस्तिष्क में E10.5 सीएसएफ 1 आर MeriCreMer Rosa26 LSL-eYFP भ्रूण से लेबल लेबलिंग दक्षताई -8.5 में ओएच-टीएएम के साथ एलएसडी ( ) किट + सीडीआईआर नेग कोशिकाओं को जीवित मस्तिष्क कोशिकाओं (नीले गेट, बाएं पैनल) पर किट और सीडी 45 अभिव्यक्ति पर आधारित gated हैं। किट + CD45 neg कोशिकाओं पर AA4.1 और किट अभिव्यक्ति। ब्लू गेट AA4.1 + किट + CD45 neg कोशिकाओं (मध्य पैनल) encloses। AA4.1 + Cre नकारात्मक नियंत्रण (काला) और रचनात्मक सकारात्मक नमूने (हरा) में किट + CD45 neg कोशिकाओं (सही पैनल) में YFP लेबलिंग की तुलना। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( बी ) किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं किट और सीडी 45 अभिव्यक्ति (नीले गेट, बाएं पैनल) पर आधारित होती हैं। एए 4.1 और किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं पर किट अभिव्यक्ति ब्लू गेट ईएमपी संलग्न करता है, जैसा कि एए 4.1 + किट + सीडी 45 कम कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। एए 4 4.1 + किट + सीडी 45 कम में वाईएफपी लेबलिंग की तुलना सी ) हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को किट ओग सीडी 45 + के रूप में परिभाषित किया गया है और नीले रंग में बाएं (बाएं पैनल)। किट नैग सीडी 45 + कोशिकाओं पर एफ 4/80 और सीडी 11 बी एक्सप्रेशन। मैक्रोफेज को F4 / 80 उज्ज्वल CD11b + कोशिकाओं (मध्य पैनल) के रूप में परिभाषित किया गया है। ईएएफपी लेबलिंग की तुलना F4 / 80 उज्ज्वल सीडी 11 बी + मैक्रोफेज (सही पैनल) में क्र नकारात्मक नियंत्रण (काला) और क्रे सकारात्मक नमूने (हरा)। हिस्टोग्राम YFP सिग्नल (एक्स-अक्ष) के लिए कोशिकाओं (y- अक्ष) सकारात्मक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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हेमटोपोएटिक पूर्ववर्ती कोशिकाओं की विभिन्न लहरें थोड़े समय के भीतर आंशिक रूप से ओवरलैप करती हैं, जो विकासात्मक हेमटोपोईजिस की प्रत्येक लहर के प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण बनाने के योगदान का विश्लेषण करती हैं।

टेमोक्सीफेन-inducible Cre सिस्टम एक अस्थायी inducible ढंग से विशिष्ट कोशिकाओं को टैग करने और, भ्रूण या वयस्कों में वंश विश्लेषण करने के लिए पूर्व vivo के लिए या इन विट्रो संस्कृति या प्रत्यारोपण में आवश्यकता के बिना अवसर प्रदान करते हैं। टैमोक्सिफेन-इंड्यिसिबल क्र नस्लों में, एक फ्यूजन जीन एक बैक्टीरियल क्रे रीकंबैनीज़ और मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर (सीआरई-ईआर) के लिगंड बाइंडिंग डोमेन के उत्परिवर्ती रूप या एक सुधारित एकल-बिंदु उत्परिवर्ती क्रे और दो माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के बीच बनाया गया है (मेर-iCre-मेर)। एस्ट्रोजेन रिसेप्टर्स के साथ क्र के फ्यूजन, क्रिप्ट HSP90 के सीओप्लास्मेनिक सिकुड़ने की ओर जाता है, जिससे परमाणु क्र-मध्यस्थता पुनर्संयोजन को रोका जा सकता है। Tamoxifen (टीएएम) वें द्वारा चयापचय किया जाता हैई जिगर में 4-हाइड्रोक्सीटामॉक्सिफ़ेन (ओएच-टीएएम), एस्ट्रोजेन रिसेप्टर के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता के साथ अपनी सक्रिय मेटाबोलाइट। संलयन के लिए बाध्यकारी ओएच-टीएएम एचएसपी 90 के साथ बातचीत के विघटन की ओर जाता है, नाभिक के लिए उसके स्थानान्तरण की अनुमति देता है और क्र-मध्यस्थता पुनर्संयोजन की शुरुआत। गर्भवती महिलाओं में टीओएम या ओएच-टीएएम के इंजेक्शन को गर्भवती महिलाओं में पुनर्संयोजन को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है। गर्भावस्था के दौरान टैमॉक्सीफेन प्रशासन गर्भपात का कारण बन सकता है और इस प्रकार कूड़े का आकार कम कर सकता है लेकिन मध्य गर्भ के बाद वितरित होने पर भी वह गर्भ को रोकता है, जिसके मामले में सीजेरियन ऑपरेशन के माध्यम से पिलेट डिलीवरी आवश्यक है। गर्भावस्था के दौरान टेमोक्सीफेन प्रभाव को संतुलित करने के लिए, हम प्रोजेस्टेरोन के एक आधा खुराक के साथ ओह-TAM प्रशासन के पूरक, भ्रूण के अस्तित्व में सुधार लाने और गर्भपात 17 के जोखिम को कम करने के लिए।

टीएएम या ओएच-टीएएम को गर्भवती महिलाओं में देने के लिए कई मार्गों पर काम किया जा सकता है। वर्तमान में मौखिक गवाजीए या इंट्रा पेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन का उपयोग टैमोक्सिफेन के लिए किया जाता है। ओएच-टीएएम को तत्काल उपलब्ध होने का फायदा है, क्योंकि गर्भवती बांध के यकृत के द्वारा इसे मेटाबोलाइज करने की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, जब टेमॉक्सीफैन मकई के तेल में भंग करने के लिए बहुत आसान है, ओएच-टीएएम एक ही तकनीक का उपयोग करने के लिए तैयार है और एक पायस में परिणाम है। Utero पल्स लेबलिंग में ओएच-टीएएम को नियोजित करने में यह एक सीमित कदम रहा है। हमने जेएफ निकोलस 13 के समूह द्वारा विकसित ओएच-टीएएम की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है, जहां वे पीएजी -35 एरंडर ऑयल का उपयोग करते हैं, ओएच-टीएएम को सुलझाने के लिए एक एम्फिफ़िलिक गुणों के साथ विलायक, क्योंकि टैमोक्सिफेन विघटन सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है प्रक्रिया में इससे ओएच-टीएएम की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और इष्टतम तैयारी की अनुमति मिलती है और टैमोक्सिफेन की तैयारी के समय को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, ओह-टीएएम की एकाग्रता को अलग-अलग inducible cre नस्लों का उपयोग करते समय इंजेक्षन करने के लिए आवश्यक है। एक व्यवहार्यता डाई का संयोजन (डीएपीआई) और आकार (एफएससी) क्रमशः मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। मृत कोशिकाओं और मलबे ज्यादातर वायलेट, नीले और लाल लेजर डिटेक्टरों में अत्यधिक autofluorescent हैं, और प्रवाह साइटेमेट्रिक विश्लेषण में बाधा डाल सकती हैं। इसके अलावा, हम प्रवाह कोशिकामीटर के साथ विश्लेषण से पहले धुंधला होने के बाद कोशिकाओं को ठीक करने की अनुशंसा नहीं करते हैं। फिक्सेशन से सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन हो सकता है और इस प्रकार फॉरवर्ड एंड साइड स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) के आधार पर मुश्किल आकार भेदभाव हो सकता है। इसके अलावा, पीएफए ​​के साथ नमूनों का निर्धारण YFP फ्लोरोसेंट तीव्रता के एक महत्वपूर्ण नुकसान की ओर जाता है।

इस प्रोटोकॉल के भीतर मुख्य सीमा यह है कि आबादी उनकी कार्यक्षमता और भेदभाव की क्षमता पर परीक्षण नहीं की जाती है। इस पर काबू पाने के लिए, कॉलोनी बनाने की परख करने के लिए फ्लोरोसेंट से सक्रिय सेल सॉर्टर (एफएसीएस) का उपयोग करके एक समान प्रोटोकॉल के बाद कोशिकाओं को सॉर्ट किया जा सकता है। इस मामले में, बाध्यकारी परिस्थितियों में और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीए) एफएसीएस बफर में, बीएसए के बजाय, अत्यधिक अनुशंसित है। इस तकनीक से प्राप्त निम्न लेबलिंग दक्षता और इसके परिणामस्वरूप कम भ्रूणिक ऊतकों प्रति हित के YFP + कोशिकाओं की संख्या ईएमपी फिनोटाइप के अध्ययन में एक बड़ी चुनौती है। यह प्रोटोकॉल 4-लेज़र प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करता है। 3 लेसरों के साथ एक प्रवाह cytometer का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन रंगों के बीच की वृद्धि हुई वर्णक्रमीय ओवरलैप को ध्यान में रखने के लिए एंटीबॉडी पैनल को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी पैनल को बदलते समय एंटीबॉडी पैनल को बदलते समय एंटीबॉडी पैनल को बदलने के लिए एंटीबॉडी का अनुमापन आवश्यक होता है और हम एक पायलट प्रयोग में एंटीबॉडी और एंटीबॉडी पैनल का सत्यापन करने की अनुशंसा करते हैं, जहां सभी पोलियो के सभी भ्रूण जमा किए जाते हैं कोशिकाओं ने प्रति ऊतक का विश्लेषण किया।

विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र में क्र / लोक्स पद्धति में क्रांतिकारी परिवर्तन किया गया है, जो स्वस्थानी में कोशिकाओं के स्थायी लेबलिंग की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण प्राप्त होता हैऊतक- या सेल प्रकार- विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में क्रे रिंकंबेस की अभिव्यक्ति के माध्यम से विशिष्टता हमारे मामले में, हमने समूह द्वारा विकसित तनाव का उपयोग करते हुए मैक्रोफेज और उनके पूर्वजों के लिए एक महत्वपूर्ण mitogenic और विकास कारक रिसेप्टर, Csf1r (कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर 1 रिसेप्टर) के प्रमोटर के नियंत्रण में Cre Recombinase की अभिव्यक्ति का अध्ययन करना चुना। जे पोलार्ड 18 का अन्य प्रकाशित रणनीतियों की तुलना में सीएसएफ 1 आर अभिव्यक्ति के आधार पर एक भाग्य मानचित्रण रणनीति का लाभ यह है कि यह किसी भी भ्रूण एचएससी 12 को लेबल किए बिना जर्दी के सैक-व्युत्पन्न कोशिकाओं (ईएमपी और मैक्रोफेज) के लेबलिंग की अनुमति देता है। सीएक्स 3 सीआर 1 सीएआरटीआर 2 तनाव एचएससी 1 9 लेबल किए बिना जर्दी कोशिकाओं को भी लेबल कर सकता है, हालांकि यह केवल मैक्रोफेज और मैक्रोफेज प्रीर्जर्स लेबल कर सकता है लेकिन यह ईएमपी प्रीजेनेटर 1 को लेबल नहीं करता है Cx3cr1 क्रेरटी 2 तनाव में सीएसएफ 1 आर के रूप में एक ही चेतावनी है रनक्स 1 मेर्रेमर 16 और किट मैर्रेमर 20 दोनों में E7.5 के रूप में प्रशासित किया जाता है, तो परिधीय रक्त कोशिकाओं को हमेशा वयस्कों में लेबलित किया जाता है, हालांकि बहुत कम दक्षता में, इस प्रकार विकास के दौरान एचएससी के लेबलिंग का प्रदर्शन होता है। इसके अलावा, किट मैर्रेमियर भाग्य मैपिंग लेबल जर्दन की थैली किट + स्कै 1 + प्रजनन जबकि ईएमपी किट + स्कै 1 नकारात्मक 11 है । सीएसएफ 1 आर मेरीक्रेमर तनाव एक दस्तक नहीं है लेकिन यह क्लासिकल एडिटिटिव ट्रांसजेनेसिस द्वारा उत्पन्न हुआ था, इस प्रकार क्र की अभिव्यक्ति सीएसएफ 1 आर के अंतर्जात अभिव्यक्ति को पूरी तरह से पुनरावृत्त नहीं कर सकती है। हालांकि, इसका लाभ सीएसएफ 1 आर के उत्परिवर्तनीय अभिव्यक्ति के कारण किसी भी संभावित विकास संबंधी दोषों से बचने के लिए किया गया है। यह विश्लेषण करने के लिए खाते में लेने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हैविकासात्मक हेमटोपोइजिस के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए गए अन्य भाग्य मानचित्रण रणनीतियों, जैसे कि रनक्स 1 मेर्रेमर , किट मेर्रेमर और सीएक्स 3 सीआर 1 क्रेएरटी 2 , जहां अप्रत्यक्ष सी शामिल किया जाता है- अंतर्जात स्थान में। दोनों रनक्स 1 मेर्रेमर और किट मेर्रेमर के लिए , विकासशील हेमटोपोएटिक दोषों को हेपरोजीजस भ्रूण में वर्णित किया गया है। सामूहिक रूप से, यहां प्रस्तुत विधि विकास के दौरान जर्दी कोशिका ईएमपी जीव विज्ञान की जांच करने और एचआईसी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से भिन्न जैक सब्स-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और वयस्क ऊतकों में पाया जाता है। इससे निवासी मैक्रोफेज की इस वंश की वर्तमान समझ और वयस्कता में उनके विशिष्ट कार्यों में सुधार होगा। EMPs की immunophenotypic लक्षण वर्णन हाल ही में सेल छँटाई और कॉलोनी के गठन assays का उपयोग कर, प्रदर्शन कि जर्दी थैली ईएमपी विशेष रूप से CD41 और CD16 / 32 व्यक्त विकास 11 की प्रारंभिक अवस्था में सुधार किया गया है। हालांकि, CD41 की अभिव्यक्ति की विशिष्टताऔर सीडी 16/32 को आगे E10.5 से अधिक लक्षण वर्णन की आवश्यकता है, विशेषकर भ्रूण जिगर की जगह में, भाग्य-मानचित्रण मॉडल का उपयोग करते हुए। दरअसल, क्या सीडी 41 और सीडी 16/32 एक्सप्रेशन अभी भी ईएमपी के लिए विशिष्ट है, जब ईआरएसी और एचएससी से प्राप्त पूर्वजों के मुकाबले ई 10.5 से ई 14.5 के भ्रूण यकृत को स्पष्ट किया जाना चाहिए। प्रस्तुत विधि जर्दी की थैली में उत्पन्न ईएमपी को लेबल करने और उन्हें भ्रूण के विकास के दौरान पालन करने की अनुमति देता है और जब वे भ्रूण यकृत का बीज बोते हैं तो ईएमपी फ़िनोटाइप के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन में योगदान देगा।

ईएमपी भेदभाव के तरीकों का अध्ययन करने के लिए यह विधि निकट भविष्य में महत्वपूर्ण हो सकती है जबकि ईएमपी ई 8.5 से ई 10.5 4 तक जर्दी के सैक एन्डोथेलियम से निकलते हैं, इस पद्धति में केवल ई 8.5-ई 9.5 के बीच उभरने वाले पूर्वजों का एक अंश लेबल करने की अनुमति दी जाती है। इसलिए, इस पद्धति की एक सीमा यह है कि ईएमपी का केवल एक छोटा सा अंश लेबलित है, इस प्रकार सी के लिए फ्लेक्स्ड एलील्स के साथ क्लासिकल लॉस ऑफ फंक्शन स्टडीज में विश्लेषण मुश्किल होता हैएंडिडाट जीन वैकल्पिक रूप से, क्लोनल रिपोर्टर का इस्तेमाल करते हुए, विवर में ईएमपी विभेद का क्लोनल अध्ययन में विरल लेबलिंग एक फायदा हो सकता है। इसके बावजूद, लेबलिंग दक्षता को प्रत्येक धमाकेदार रिपोर्टर या फ्लॉक्स्ड एलील के लिए उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि फॉक्सेड निर्माणों की पुनर्संयोजन क्षमता जीनोमिक बिन्दु (फॉक्सेड एलील्स) या रोज़ा 26 रिपोर्टर के निर्माण पर निर्भर करती है। दरअसल, विभिन्न Rosa26 संवाददाता लाइनों विभिन्न प्रमोटरों के साथ उपलब्ध हैं और यह बताया जाता है Rosa26 tdTomato और Rosa26 mTmG तनाव Rosa26 LSL-EYFP लाइन की तुलना में अधिक पुनर्संयोजन दक्षता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त रिपोर्टर माउस तनाव रोज़ा 26 एलएसएल-ईआईएफपी लाइन है, जो परिणामों के अनुभाग में वर्णित पूर्वज परिपक्वता की गतिशील प्रक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। परिपक्वता प्रक्रिया का सवाल आंशिक रूप से रोसा 26 एमटीएमजी जैसे विभिन्न संवाददाता उपभेदों का उपयोग करके किया जा सकता है। इस तरह के तनाव में, कोशिकाएं डैस्टिंग हो सकती हैंपुनर्संयोजन की घटना के बाद से समाप्त होने वाले समय पर आधारित रोज़ा 26 एमटीएमजी तनाव में सभी कोशिकाओं झिल्ली-बाध्य टीडी टेटमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और क्रे रीकबिनेशन को ट्रिड टेटेटो केसेट को बढ़ाता है और झिल्ली-बाउंड जीएफपी की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। चूंकि टीडीटाटो के लंबे आधे जीवन होते हैं, इसलिए कोशिकाओं में अभी भी टीडीटाटोटो होते हैं, लेकिन जीएफपी (शीघ्र ही पुनर्संयोजन के बाद) को टीडीटामाटो + जीएफ़पी कम / इंटिड कहा जाता है और इसे टीडीटामेटो नेग जीएफपी + कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है जो अब टीडीटाटोमो को व्यक्त नहीं करते हैं और जीएफपी के उच्च स्तर को व्यक्त करें (बाद में पुनर्संयोजन के बाद)

जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, ओएच-टीएएम तैयारी प्रयोगों के बीच ओएच-टीएएम के समान खुराक को लगातार जारी करने और टॉमॉक्सिफेन साइड इफेक्ट को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रोजेस्टेरोन सह-प्रशासन गर्भावस्था पर तमोक्सिफ़ेन के हानिकारक प्रभाव को सीमित करने के लिए भी उपयोगी है। प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण तत्व एकल-सेल निलंबन की व्यवहार्यता हैN विभिन्न भ्रूण के ऊतकों से प्राप्त। हम आमतौर पर प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 90% व्यवहार्य कोशिकाओं प्राप्त करते हैं। इसे हासिल करने के लिए, सभी चरणों का तेजी से पालन करना और ऊतक संग्रह के बाद बर्फ पर सभी नमूनों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। उपयुक्त नियंत्रण जैसे अस्थिर नमूनों, एकल दाग और फ्लोरोसेंट माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रणों को फाटक की सीमाओं की पहचान करने और बहुरंगा पैनल में वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं। एंटीबॉडी में परिवर्तन एंटीबॉडी अनुरेखण और वर्णक्रमीय ओवरलैप के संदर्भ में मान्य होना चाहिए। अंत में, Rosa26 रिपोर्टर तनाव की पसंद को वैज्ञानिक प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए जो जांच की जाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने व्यावहारिक चर्चाओं के लिए प्रोफेसर फ्रेडरिक गेशमान और प्रोफेसर क्रिस्चियन शुलज का धन्यवाद किया; पांडुलिपि की महत्वपूर्ण पढ़ाई के लिए डॉ। हन्ना गार्नर, डॉ। जेवियर मोंटगुटेलली और डॉ। जीन ज्यूबर्ट और माउस प्यूरी के समर्थन के लिए इंस्टिट्यूट पास्तेर पशु सुविधा के कर्मचारी; और पास्कल डार्डेन और व्यतूत बोरिकाइट, एक अम्जान स्कॉलर, उनकी तकनीकी सहायता के लिए ईजीपी प्रयोगशाला में रिसर्च इन्स्टिट्यूट पाश्चर, सीएनआरएस, सर्कल एफएसईआर (एफआरएम) और इन्स्टिट्यूट पाश्चर और रिवीव कॉन्सॉर्टियम के एक प्रारंभिक पैकेज द्वारा वित्त पोषित है। लाई को पीएचडी फेलोशिप द्वारा रिवीव कॉन्सोर्टियम द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 Straight Forceps Fine Science Tools 11251-20
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools 15371-92
8.5 cm straight scissors Fine Science Tools 14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) BD Pharmingen 553355 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) Sony 1149120 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) eBioscience 17-5892 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) Biolegend 560512 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) BD Pharmingen 123137 1/100 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) BD Pharmingen 552850 1/200 dilution in FACs Buffer
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) BD Biosciences 553142
PBS 1x Fischer Scientific 12559069
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 11570506
Collagenase D  Roche 11088882001
Deoxyribonuclease I Sigma D4527-20KU
6-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353046
12-well tissue culture plate Dutscher Dominique 353224
24-well tissue culture plate Fischer Scientific 11874235
96 wells U-shape bottom tissue culture plate Dutscher Dominique 353227
 Syringe Plastipak 2 mL  Dutscher Dominique 300185
Nylon grid 100 µm cell strainers Dutscher Dominique 352360
Nylon grid 70 µm cell strainers Dutscher Dominique 352350
15 ml Falcon tubes Dutscher Dominique 352096
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm Dutscher Dominique 51246
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg Sigma H7904-25MG Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment
Progesterone Sigma P3972 Always use appropriate personal protective equipment
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) Sigma C5135
Sunflower oil Sigma S5007-250ML
Ethanol  Sigma 24103-1L-R-D Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood
EDTA Sigma E9884-500G
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) Fischer Scientific 10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer Beckman Coulter B75408
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres Beckman Coulter  B53230
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) Beckman Coulter  B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J The Jackson laboratory 19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson laboratory 6148

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References

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ईरीथ्रोमाइलॉयड प्रजनकों की पहचान और उनकी गर्भ में फ्लो साइटोमैट्री द्वारा माउस भ्रूण
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Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).More

Iturri, L., Saenz Coronilla, J., Lallemand, Y., Gomez Perdiguero, E. Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55305, doi:10.3791/55305 (2017).

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