ईरीथ्रोमाइलॉयड प्रजनकों की पहचान और उनकी गर्भ में फ्लो साइटोमैट्री द्वारा माउस भ्रूण
Summary
जबकि मैक्रोफेज घुसपैठ कर रहे हैं वयस्कों के परिसंचारी से लगातार वयस्क ऊतकों को लगातार भर्ती किया जाता है, निवासी मैक्रोफेज उनके ऊतक को विकास के दौरान बीज देते हैं, जहां उन्हें पूर्वजनन से अधिक इनपुट के बिना बनाए रखा जाता है। निवासी मैक्रोफेज के लिए पूर्वजों को हाल ही में पहचान लिया गया था। यहां, हम निवासी मैक्रोफेज पूर्वज के आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण के तरीकों को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मैक्रोफेज प्रतिरक्षा प्रणाली के सहज हाथ से पेशेवर फागोसाइट्स हैं। स्थिर-राज्य में, वयस्कों के ऊतकों में वेदांत मैक्रोफेज पाए जाते हैं, जहां वे संक्रमण और ऊतक क्षति के सामने वाले लाइन के रूप में कार्य करते हैं। अस्थि मज्जा में स्थित हेमेटोपोएटिक स्टेम और प्रजनन कोशिकाओं (एचएसपीसी) से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लगातार नवीनीकृत किया जाता है, जबकि मैक्रोफेज की एक वंश, जो कि निवासी मैक्रोफेज के रूप में जाना जाता है, को अस्थि मज्जा एचएसपीसी से इनपुट के बिना ऊतकों में स्वयं बनाए रखा गया है। यह वंश मस्तिष्क में माइक्रोग्लिया द्वारा उदाहरण दिया गया है, अन्य लोगों के बीच में एपिडर्मिस में लीवर और लैंगेरहाउस कोशिकाओं में कुफर कोशिकाएं हैं आंतों और बृहदान्त्र लैमीना प्रोप्रिया एचएसपीसी से रहित एकमात्र वयस्क ऊतक-स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज हैं। हाल ही की जांच ने पता लगाया है कि निवासी मैक्रोफेज भ्रूण हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) से अलग पूर्वपुस्र्ष (ओं) से अतिरिक्त-भ्रूण जर्दी कोशिका हेमटोपोईजिस से उत्पन्न होते हैं। जर्दी के थैले में निश्चित हीमेटोपोसीज, ईरेथ्रोमाइलॉयड प्रोजेजर (ईएमपी) विशेष रूप से निवासी मैक्रोफेज में, एरिथ्रोइड और मायलोइड कोशिकाओं दोनों को जन्म देती है। EMP विकास के E8.5 और E10.5 दिनों के बीच जर्दी के भीतर ही उत्पन्न होते हैं और वे भ्रूण के जिगर में पलायन करते हैं जैसे कि संचलन जुड़ा हुआ है, जहां वे विस्तार करते हैं और कम से कम ई 16.5 तक अंतर करते हैं। उनकी संतान में एरिथ्रोसाइट्स, मैक्रोफेज, न्युट्रोफिल और मास्ट सेल शामिल हैं, लेकिन केवल ईएमपी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ऊतकों में वयस्कता तक जारी रहती हैं। ईएमपी उभरने की क्षणिक प्रकृति और एचएससी पीढ़ी के साथ अस्थायी ओवरलैप इन प्राणायामों के विश्लेषण को कठिन बना देती है। हम एक टेमोक्सीफेन-inducible भाग्य मानचित्रण बृहतभक्षककोशिका साइटोकाइन रिसेप्टर Csf1r प्रमोटर की अभिव्यक्ति पर आधारित प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry द्वारा विवो में ईएमपी और ईएमपी व्युत्पन्न कोशिकाओं चिह्नित करने के लिए स्थापित किया है।
Introduction
विकास के दौरान हेमेटोपोएटिक प्रजनकों के कई लगातार लेकिन अतिव्यापी तरंगें हैं, जिनके मैलॉयड संतान वयस्कता में रहते हैं। सबसे पहले, एकजुट "आदिम" प्रजनन E7.5-E8.25 के बीच माउस जर्दी कोशिका 1 , 2 में उत्पन्न होते हैं और किसी भी मोनोसाइटिक मध्यवर्ती बिना भ्रूण मैक्रोफेज को जन्म देते हैं। यद्यपि प्रौढ़ मस्तिष्क में पैदा होने वाले मैक्रोफेज वयस्क मस्तिष्क में बने रहते हैं, क्योंकि माइक्रोग्लिया सक्रिय जांच का विषय बना हुआ है। दूसरा, E8.5 में जर्दी के थैले में इरिथ्रो-मायलोइड प्रिकर्सर्स (ईएमपी) पैदा होते हैं, रक्त प्रवाह में प्रवेश करते हैं और भ्रूण को उपनिवेश करते हैं। ईएमपी एक रनक्स 1-आधारित एंडोथेलियल-टू-हेमेटोपोइएटिक संक्रमण 3 , 4 में जर्दी थैम हेमोजेनिक एन्डोथेलियम से निकलते हैं। जबकि ईएमपी जर्दी की थैली के भीतर मैक्रोफेज में अंतर कर सकता है, वे भ्रूण के दिन (ई) 9 5 और भ्रूण के यकृत से उपनिवेश करते हैंएरिथ्रोसाइट्स, मेगाकरेकोटाइटेस, मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स ग्रैन्यूलोसाइट्स और मस्ट सेल 6 में मौजूद ईएमपी से प्राप्त मैक्रोफेज विकास और वयस्क ऊतकों में प्रत्यावर्तन क्षमता दर्शाती हैं। क्या ईएमपी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज भेदभाव के मोनोसाइट चरण को बाईपास करते हैं, यह अभी भी विवादास्पद है क्योंकि उनके भेदभाव मार्ग 7 , 8 के बारे में बहुत कम जानकारी है। अंत में, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) ईओआरए-गोनैड-मेसोन्फ्रोस क्षेत्र से उचित भ्रूण के भीतर ई 10.5 पर उभरा है और भ्रूण यकृत को पलायन करता है। लंबी अवधि के पुनर्वास क्षमता वाले एचएससी केवल ई 11 (42 सोमईट जोड़ी चरण में) के बाद पता चला है 9 । वहां, वे विस्तार और अंतर E12.5 से लेकर निश्चित हीमटोपोइजिस को अस्थि मज्जा में बदलना शुरू कर देते हैं, जो जन्मजात जीवन की अवधि 10 के लिए रक्त कोशिका के उत्पादन की प्रमुख स्थान बन जाता है।
एसपीउभरने में शास्त्रीय और अस्थायी ओवरलैप, साथ ही साझा इम्युनो-फेनोटिप्टिक मार्करों ने अब तक भ्रूण के हेमेटोपोइएटिक प्रजनकों के इन तरंगों के विशिष्ट योगदानों को अलग करने की हमारी क्षमता को दूर किया है। जबकि दोनों ईएमपी और एचएससी एक रनक्स 1-आश्रित तरीके से उत्पन्न होते हैं और ट्रांसक्रिप्शन कारक माइब और विकास कारक रिसेप्टर सीएसएफ 1 आर (कॉलोनी-स्टाइमुलेटिंग फैक्टर 1 रिसेप्टर, जिसे मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर रीसेप्टर के रूप में भी जाना जाता है) को व्यक्त करते हैं, ईएमपी को अलग-अलग से अलग किया जा सकता है एचसीएस अपने इन विट्रो और विवो दोनों में लिम्फोइड क्षमता की कमी से, लंबे समय तक पुनर्स्थापना करने की क्षमता की कमी और वंशावली मार्कर Sca-1 11 की सतह अभिव्यक्ति की कमी है। आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण मॉडल को मैक्रोफेज ऑनटोजनी को चिह्नित करने की आवश्यकता होती है क्योंकि वे सेल-विशिष्ट और समय-विशिष्ट तरीके से भ्रूणीय प्रजनन को लक्षित करने की अनुमति देते हैं। यहाँ हम दो वंश के बीच भेदभाव करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त नियत-मैपिंग प्रोटोकॉल पेश करते हैंअधिकांश प्रौढ़ ऊतकों में पाया गया मैक्रोफेज: एचएससी-व्युत्पन्न घुसपैठ मैक्रोफेज और एचएससी-स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज।
ऊतक निवासी मैक्रोफेज Myb स्वतंत्र अग्रदूत कोशिकाओं साइटोकाइन रिसेप्टर व्यक्त Csf1r 12 के लिए वापस पता लगाया गया और E8.5-E10.5 पर भ्रूण तीन पूरक भाग्य-मानचित्रण रणनीतियों 6 का उपयोग में मौजूद हैं। भ्रूण एचएससी लेबल किए बिना जर्दी थैली हेमटोपोईजिस का अध्ययन करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक तनाव, सीएसएफ 1 आर मेरि क्रेमर का उपयोग करते हैं, जिसमें 'सुधारित' री रिमबनीज़ और दो माउस एस्ट्रोजेन रिसेप्टर (मेर-आईसीआरई-मेर) के नियंत्रण के तहत एक टेमॉक्सीफेन-अनुक्रमिक संलयन प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। सीएसएफ 1 आर प्रमोटर इसलिए, एक सीमित समय-खिड़की के दौरान सीआरएफ -1 आर-एस्प्रेसिंग कोशिकाओं में cre रीकंबीनस सक्रिय हो जाएगा। जब एक रिपोर्टर तनाव के साथ प्रयोग किया जाता है जिसमें एक लॉक्स-स्टॉप-लॉक्स कैसेट ( रोसा 26 एलएसएल-ईआईएफपी ) के फ्लोरोसेंट प्रोटीन डाउनस्ट्रीम होता है, तो यह स्थायीप्रवेश के समय पर मौजूद कोशिकाओं का एंट आनुवंशिक लेबलिंग लेकिन उनकी संतान की भी। तामॉक्सिफ़ेन, 4-हाइड्रॉक्सीटामॉक्सिफ़ेन (ओएच- टीएएम) के सक्रिय रूप के ई 8.5 पर प्रशासन, ईपीपी और मैक्रोफेज लेबल, बिना जर्दी के थैली के लिए "आदिम" पूर्वज या भ्रूण एचएससी लेबलिंग के बिना। इसके द्वारा, हमने ईएमपी के इम्युनोफेनोटाइप और भ्रूण के विकास के दौरान उनकी प्रजनन, साथ ही साथ वयस्क मैक्रोफेज पूलों में जर्दी के सैक-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का योगदान मूल्यांकन किया है। इस बात के लिए अधिक काम करना आवश्यक है कि क्या प्राचीन पूर्वज-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए लेबल किया गया है और क्या वे वयस्क मैक्रोफेज पूलों में योगदान कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हेमटोपोएटिक पूर्ववर्ती कोशिकाओं की विभिन्न लहरें थोड़े समय के भीतर आंशिक रूप से ओवरलैप करती हैं, जो विकासात्मक हेमटोपोईजिस की प्रत्येक लहर के प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने व्यावहारिक चर्चाओं के लिए प्रोफेसर फ्रेडरिक गेशमान और प्रोफेसर क्रिस्चियन शुलज का धन्यवाद किया; पांडुलिपि की महत्वपूर्ण पढ़ाई के लिए डॉ। हन्ना गार्नर, डॉ। जेवियर मोंटगुटेलली और डॉ। जीन ज्यूबर्ट और माउस प्यूरी के समर्थन के लिए इंस्टिट्यूट पास्तेर पशु सुविधा के कर्मचारी; और पास्कल डार्डेन और व्यतूत बोरिकाइट, एक अम्जान स्कॉलर, उनकी तकनीकी सहायता के लिए ईजीपी प्रयोगशाला में रिसर्च इन्स्टिट्यूट पाश्चर, सीएनआरएस, सर्कल एफएसईआर (एफआरएम) और इन्स्टिट्यूट पाश्चर और रिवीव कॉन्सॉर्टियम के एक प्रारंभिक पैकेज द्वारा वित्त पोषित है। लाई को पीएचडी फेलोशिप द्वारा रिवीव कॉन्सोर्टियम द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
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