浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。
マクロファージは、免疫系の本来の腕に由来する専門的な食細胞である。定常状態では、成人組織において固着したマクロファージが感染および組織損傷の最前線のセンチネルとして働く。他の免疫細胞は、骨髄に位置する造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)から連続的に再生されるが、常在性マクロファージとして知られている系譜は、骨髄HSPCからの入力なしに組織内で自己維持されることが示されている。この系統は、脳におけるミクログリア、肝臓におけるクッパー細胞、および表皮におけるランゲルハンス細胞によって例示される。腸および結腸層固有層は、HSPC非依存性常在マクロファージを欠いている唯一の成人組織である。最近の研究では、常在マクロファージが、胎児造血幹細胞(HSC)とは異なる前駆細胞からの胚性卵黄造血に由来することが確認されている。卵黄嚢の確定的な造血、e赤血球系前駆細胞(EMP)は、赤血球系細胞および骨髄系細胞、特に常在性マクロファージを生じる。 EMPは、E8.5とE10.5の発達の間の卵黄嚢内でのみ産生され、循環が連結すると早期に胎児肝臓に移動し、少なくともE16.5まで拡大して分化する。彼らの子孫は赤血球、マクロファージ、好中球および肥満細胞を含むが、EMP由来マクロファージのみが成人期まで組織内に存続する。 EMP出現の一時的性質およびHSC世代との時間的重複は、これらの前駆体の分析を困難にする。我々は、フローサイトメトリーによってインビボで EMPおよびEMP由来細胞を特徴付けるために、マクロファージサイトカイン受容体Csf1rプロモーターの発現に基づくタモキシフェン誘導性運命マッピングプロトコールを確立した。
発達中の骨髄系子孫が成人期にとどまる造血前駆細胞のいくつかの連続するが重複する波が存在する。まず、単能性「プリミティブ」前駆体は、E7.5、E8.25間のマウス卵黄嚢1,2に出現し、任意の単球の中間ことなく、胚性マクロファージを生じます。原始前駆細胞に由来するマクロファージが、小膠細胞として成人の脳に存続するかどうかは、活発な研究の対象である。第二に、E8.5の卵黄嚢にErythro-Myeloid Precursors(EMPs)が生じ、血流に入り、胚を定着させる。 EMPはRUNX1依存性内皮への造血転移3、4における卵黄嚢造血内皮から出てきます。 EMPは卵黄嚢内のマクロファージに分化することができるが、それらはまた、胚の日(E)9 5から胎児肝をコロニー化し、赤血球、巨核球、マクロファージ、単球顆粒球および肥満細胞に分化する6 。 EMP由来のマクロファージは、発達および成人組織において増殖能力を示す。非常に少ないが、その分化経路7、8について知られているようEMP-由来のマクロファージが分化の単球の段階をバイパスするかどうかはまだ議論の余地があります。最後に、造血幹細胞(HSC)は、大動脈 – 生殖腺 – 中胚葉領域から適切な胚内のE10.5に出現し、胎児の肝臓に移動する。長期再増殖能を有するHSCは、E11(42体節ペア段階)の後にのみ検出される9 。そこでは、最終的な造血が出生後の生活の間、血液細胞産生の優勢な部位になる骨髄に移行し始めるまで、それらは拡大してE12.5と区別される10 。
spこれらの胚性造血前駆細胞の波の特定の寄与を区別する能力をこれまで妨げていた。 EMPおよびHSCの両方がRunx1依存的に産生され、転写因子Mybおよび増殖因子受容体Csf1r(コロニー刺激因子1受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体としても知られる)を発現するが、EMPは、 インビトロおよびインビボのリンパ電位の欠如、それらの長期再増殖能の欠如および系譜マーカーSca-1 11の表面発現の欠如により、HSCが減少した。遺伝的運命マッピングモデルは、細胞特異的かつ時間特異的な方法で胚性前駆細胞を標的とすることができるため、マクロファージの個体発生を特徴づけるために必要とされる。ここでは、2つの系統を区別するために実験所で使用されている運命マッピングプロトコールを提示するほとんどの成人組織に見出されるマクロファージ:HSC由来の浸潤マクロファージおよびHSC非依存性の常在マクロファージ。
組織常在性マクロファージはCSF1R 12サイトカイン受容体を発現するMybの非依存性前駆細胞に遡ると3つの相補性運命マッピング戦略6を用いて、E8.5-E10.5で胚中に存在しているされています。胎児HSCを標識せずに卵黄嚢造血を研究するために、改良されたCreリコンビナーゼおよび2つのマウスエストロゲン受容体(Mer-iCre-Mer)のタモキシフェン誘導性融合タンパク質を発現するトランスジェニック株Csf1r MeriCreMerを使用するCsf1rプロモーター。したがって、Creリコンビナーゼは、限られた時間枠の間にCsf1r発現細胞において活性である。 lox-STOP-loxカセット( Rosa26 LSL-eYFP )の下流に蛍光タンパク質を含むレポーター株と一緒に使用すると、誘導の時点で存在する細胞の遺伝的標識化だけでなく、それらの子孫の遺伝的標識化も含む。卵黄嚢単能性「原始」前駆細胞または胎児性HSCを標識せずに、活性形態のタモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン(OH-TAM)、EMPおよびマクロファージを標識したE8.5での投与。これにより、我々は、胚発達中のEMPおよびその子孫の免疫表現型を特徴付けるとともに、卵黄嚢由来マクロファージの成体マクロファージプールへの寄与を評価した。原始前駆細胞由来のマクロファージもまた、このアプローチを用いて標識されているかどうか、およびそれらが成体マクロファージプールに寄与できるかどうかを特徴付けるために、さらなる研究が必要である。
造血前駆細胞の異なる波は、時間的枠内で部分的に重複するため、免疫細胞に対する発達造血の各波の寄与を分析することは、技術的に非常に困難です。
タモキシフェン誘導性Creシステムは、時間的に誘導性の様式で特定の細胞にタグを付け、 エクスビボまたはインビトロの培養または移植を必要とせずに、胚または成体で系統分析を行う機会を提供する?…
The authors have nothing to disclose.
著者たちはFrederic Geissmann教授とChristian Schulz教授に洞察力のある議論に感謝します。博士ハナ・ガーナー博士は原稿を批評的に読むために、Xavier Montagutelli博士とJean Jaubert博士と、動物飼育支援のためのInstitut Pasteur動物施設の職員、 Amgen ScholarのPascal DardenneとVytaute Boreikaiteは、技術的な支援をしています。 EGP研究所での研究は、パスツール研究所、CNRS、Cercle FSER(FRM、Institut PasteurおよびREVIVEコンソーシアムからの出発パッケージです.LIはREVIVEコンソーシアムのPhDフェローシップの支援を受けています。
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |