Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri
Summary
Medan infiltrerande makrofager kontinuerligt rekryteras till vuxna vävnader från cirkulerande prekursorer, fröer inhemska makrofager sin vävnad under utveckling, där de bibehålls utan ytterligare ingrepp från stamkroppar. Framfödarna för bosatta makrofager identifierades nyligen. Här presenterar vi metoder för den genetiska ödet kartläggning av de bosatta makrofagprogenitorerna.
Abstract
Makrofager är professionella fagocyter från immunitetens medfödda arm. I steady-state finns sessila makrofager i vuxna vävnader där de fungerar som frontlinjen för infektioner och vävnadsskador. Medan andra immunceller kontinuerligt förnyas från hematopoietiska stamceller och stamceller (HSPC) i benmärgen har en rad makrofager, kända som inhemska makrofager, visat sig vara självhäftande i vävnader utan inmatning från benmärgs HSPC. Denna härkomst exemplifieras av microglia i hjärnan, Kupffer celler i levern och Langerhans celler i epidermis bland andra. Tarm- och kolonlamina propria är de enda vuxna vävnaderna som saknar HSPC-oberoende bosatta makrofager. Nyligen undersökningar har identifierat att invånande makrofager härstammar från extra-embryonala äggula-hematopoiesis från föregångare som skiljer sig från fosterhematopoetiska stamceller (HSC). Bland äggula säck definitiva hematopoiesis, eRythromyeloida progenitorer (EMP) ger upphov till både erytroid och myeloidceller, i synnerhet bosatta makrofager. EMP genereras endast i äggula sac mellan E8.5 och E10.5 utvecklingsdagar och de migrerar till fostrets lever så tidigt som cirkulationen är ansluten, där de expanderar och differentierar till åtminstone E16.5. Deras avkomma inkluderar erytrocyter, makrofager, neutrofiler och mastceller, men endast EMP-härledda makrofager kvarstår fram till vuxenlivet i vävnader. Den övergående karaktären av EMP-framväxten och den tidsmässiga överlappningen med HSC-generationen gör analysen av dessa förfäder svår. Vi har etablerat ett tamoxifen-inducerbart ödebildningsprotokoll baserat på uttryck av makrofag-cytokinreceptor Csflr-promotorn för att karakterisera EMP och EMP-härledda celler in vivo genom flödescytometri.
Introduction
Det finns flera på varandra följande men överlappande vågor av hematopoetiska progenitorer under utveckling vars myeloid avkomma förblir i vuxenlivet. Först framträder unipotenta "primitiva" föregångare i muskelsäcken 1 , 2 mellan E7.5-E8.25 och ger upphov till embryonala makrofager utan någon monocytisk mellanprodukt. Huruvida makrofager som härrör från primitiva progenitorer kvarstår i den vuxna hjärnan, eftersom mikroglia fortfarande är ett ämne för aktiv utredning. För det andra uppstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP) i äggula sac vid E8.5, gå in i blodomloppet och kolonisera embryot. EMP: er kommer från blommans sac-hemogena endotel i en Runxl-beroende endotel-till-hematopoietisk övergång 3 , 4 . Medan EMP kan differentiera till makrofager inom äggula sac, koloniserar de också fosterlever från embryonal dag (E) 9 5 och skiljer sig åtTia in i erytrocyter, megakaryocyter, makrofager, monocyter granulocyter och mastceller 6 . Makrofagerna som härrör från EMP uppvisar proliferativ kapacitet i utvecklings- och vuxna vävnader. Huruvida EMP-härledda makrofager förbi monocytsteget av differentiering är fortfarande kontroversiellt, eftersom väldigt lite är känt om deras differentieringsväg 7 , 8 . Slutligen framträder hematopoietiska stamceller (HSC) vid E10.5 inom det embryo som är korrekt från aorta-gonad-mesonephros-regionen och migrerar till fostrets lever. HSCs med långvarig repopulationskapacitet detekteras endast efter E11 (vid 42-somit-paret) 9 . Där utökar och skiljer de sig från E12.5 tills definitiv hematopoiesis börjar övergå till benmärgen, som blir den övervägande platsen för blodcellsproduktion under perioden efter det postnatala livet 10 .
SpAtiell och tidsmässig överlappning i framväxten, liksom gemensamma immunfenotypiska markörer har hittills hindrat vår förmåga att särskilja de specifika bidrag från dessa vågor av embryonala hematopoetiska progenitorer. Medan både EMP och HSC genereras på ett Runx1-beroende sätt och uttrycker transkriptionsfaktorn Myb och tillväxtfaktorreceptorn Csf1r (kolonistimulerande faktor 1-receptor, även känd som makrofagkolonistimulerande faktorreceptor) bland annat, kan EMPs särskiljas från HSCs genom deras brist på lymfoidpotential, både in vitro och in vivo , deras brist på långvarig repopulerande potential och brist på ytuttryck av linjemarkören Sca- 11 . Genetiska öde kartläggningsmodeller krävs för att karakterisera makrofag ontogeni eftersom de tillåter inriktning på embryonala progenitorer på ett cellspecifikt och tidsspecifik sätt. Här presenterar vi det öde-kartläggningsprotokoll som används i vårt laboratorium för att diskriminera mellan de två linjernaS av makrofager som finns i de flesta vuxna vävnader: HSC-härledda infiltrerande makrofager och HSC-oberoende bosatta makrofager.
Vävnads residenta makrofager har spårats tillbaka till Myb-oberoende prekursorceller som uttrycker cytokinreceptor Csf1r 12 och är närvarande i embryot vid E8.5-E10.5 med användning av tre komplementära öde-kartläggningsstrategier 6. För att studera äggula-hematopoiesis utan att märka fetala HSC, använder vi en transgen stam, Csf1r MeriCreMer , som uttrycker ett tamoxifen-inducerbart fusionsprotein av "förbättrat" Cre rekombinas och två musestrogenreceptorer (Mer-iCre-Mer) under kontroll av Csf1r-promotorn. Därför kommer Cre-rekombinaset att vara aktivt i Csfl- expressionsuttryck under ett begränsat tidsfönster. När det används med en reporterstam som innehåller ett fluorescerande protein nedströms en Lox-STOP-lox-kassett (Rosa26 LSL-eYFP ), leder det till permanentEnt genetiska märkning av cellerna närvarande vid tidpunkten för induktion men också av deras avkomma. Administrering vid E8.5 av aktiv form av tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), etiketter EMP och makrofager, utan märkning av äggula unipotenta "primitiva" progenitorer eller fetala HSCs. Därigenom har vi karakteriserat immunofenotypen av EMP och deras avkomma under embryonisk utveckling, samt bedömt bidraget från äggula-sack-härledda makrofager till de vuxna makrofagbassängerna. Ytterligare arbete krävs för att karakterisera huruvida primitiva stamceller som härrör från makroen också märks med hjälp av detta tillvägagångssätt och huruvida de kan bidra till vuxna makrofagbassänger.
Protocol
Representative Results
Discussion
De olika vågorna av hematopoietiska prekursorceller överlappar delvis inom en kort tidsram, vilket gör analysen av varje våg av utvecklingshematopoiesis bidrag till immunceller tekniskt mycket utmanande.
Tamoxifen-inducerbara Cre-system erbjuder möjlighet att märka specifika celler på ett temporärt inducerbart sätt och att utföra linjäranalys i embryon eller vuxna, utan behov av ex vivo eller in vitro- odling eller transplantation. I tamoxifen-inducerbara Cre-sta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Prof Frederic Geissmann och Prof Christian Schulz för insiktsfulla diskussioner. Dr Hannah Garner för kritisk läsning av manuskriptet, Dr Xavier Montagutelli och Dr Jean Jaubert och personalen på Institut Pasteur djur anläggning för stöd med muskultur; Och Pascal Dardenne och Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, för deras tekniska hjälp. Forskningen inom EGP-laboratoriet finansieras av Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM) och ett startpaket från Institut Pasteur och REVIVE-konsortiet. LI stöds av ett doktorskt stipendium från REVIVE-konsortiet.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
