Summary
Abbiamo dimostrato una piattaforma microfluidica con una rete elettrodo superficie integrato che combina rilevamento di impulsi resistivo (RPS) con code division multiple access (CDMA), per multiplare rilevazione e dimensionamento delle particelle a più canali microfluidici.
Abstract
l'elaborazione microfluidica di campioni biologici in genere comporta manipolazioni differenziali di particelle in sospensione sotto vari campi di forza in modo da frazionare spazialmente il campione sulla base di una proprietà biologica di interesse. Per la distribuzione spaziale risultante da utilizzare come la lettura dosaggio, dispositivi microfluidici sono spesso sottoposti ad analisi microscopica richiede strumentazione complesso con più alto costo e ridotta portabilità. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una tecnologia integrata di rilevamento elettronico per il rilevamento di particelle multiplex in diverse posizioni su un chip microfluidica. La nostra tecnologia, chiamata CODICI microfluidici, combina resistivo impulsi Sensing con Code Division Multiple Access per comprimere 2D informazioni spaziali in un segnale elettrico 1D. In questo articolo, vi presentiamo una dimostrazione pratica della tecnologia CODICI Microfluidic per rilevare e dimensioni cellule tumorali in coltura distribuito su più canali microfluidica. Comeconvalidato dal microscopia ad alta velocità, la nostra tecnologia può analizzare accuratamente popolazioni di cellule dense tutto elettronicamente senza bisogno di uno strumento esterno. Come tale, i codici microfluidici possono potenzialmente consentire dispositivi a basso costo integrati lab-on-a-chip che ben si adattano per il test point-of-care di campioni biologici.
Introduction
La rilevazione accurata e l'analisi di particelle biologiche, come cellule, batteri o virus in sospensione nel liquido è di grande interesse per una gamma di applicazioni 1, 2, 3. Ben abbinato dimensioni, dispositivi microfluidici offrono vantaggi unici per questo scopo come alta sensibilità, la manipolazione dei campioni dolce e microambiente ben controllata 4, 5, 6, 7. Inoltre, dispositivi microfluidici possono essere progettati per impiegare una combinazione di fluidodinamica e campi di forza di frazionare passivamente una popolazione eterogenea di particelle biologiche basate su varie proprietà 8, 9, 10, 11, 12. In quelle dispositivos, la distribuzione delle particelle risultante può essere usato come lettura, ma le informazioni spaziali è tipicamente accessibile esclusivamente tramite microscopia, limitando l'utilità pratica del dispositivo microfluidico legandola ad una infrastruttura di laboratorio. Pertanto, un sensore integrato che può facilmente segnalare mappatura spaziotemporale particelle ', come vengono manipolati in un dispositivo microfluidico, può potenzialmente consentire a basso costo, dispositivi integrati lab-on-a-chip che sono particolarmente interessanti per l'analisi di campioni in mobili , risorse limitate.
Elettrodi a film sottile sono stati utilizzati come sensori integrati in dispositivi microfluidici per varie applicazioni 13, 14. Pulse resistivo Sensing (RPS) è particolarmente attraente per il rilevamento integrato di piccole particelle nei canali microfluidica in quanto offre un meccanismo di rilevamento high-throughput robusto, sensibile, e direttamente da misure elettriche 15. In RPS, la modulazione impedenza tra una coppia di elettrodi, immersi in un elettrolita, viene usato come mezzo per rilevare una particella. Quando la particella passa attraverso un'apertura, di dimensioni dell'ordine di particella, il numero e l'ampiezza degli impulsi transitori della corrente elettrica sono usati per contare e particelle di dimensioni rispettivamente. Inoltre, la geometria del sensore può essere progettato con una risoluzione fotolitografica per modellare le forme d'onda di impulsi resistivi al fine di migliorare la sensibilità 16, 17, 18, 19 o per stimare la posizione verticale delle particelle in canali microfluidica 20.
Abbiamo recentemente introdotto un multiplex resistivo tecnologia di rilevamento degli impulsi semplice e scalabile, chiamato Microfluidic Coded Orthogonal rilevamento rilevando elettrico (CODICI microfluidici) 21. CODICI microfluidica si basa su unrete interconnessa di sensori resistivi, ciascuno costituito da una matrice di elettrodi microlavorati per modulare conduzione in modo unico, distinguibile, in modo da consentire multiplexing. Abbiamo specificatamente progettato ogni sensore per produrre segnali elettrici ortogonali simili ai codici digitali utilizzati in code division multiple access 22 (CDMA) reti di telecomunicazioni, in modo che il segnale individuale cardiofrequenzimetro resistivo può essere recuperato esclusivamente da una singola forma d'onda di uscita, anche se i segnali da diversi sensori interferiscono. In questo modo, la nostra tecnologia comprime informazioni spaziali 2D di particelle in un segnale elettrico 1D, permettendo il monitoraggio di particelle in diverse posizioni su un chip microfluidico, mantenendo sia complessità dispositivo- ed a livello di sistema al minimo.
In questo articolo, vi presentiamo un protocollo dettagliato per i metodi sperimentali e computazionali necessarie per utilizzare la tecnologia CODICI Microfluidic, così come rrisultati epresentative dal suo uso in analisi di campioni biologici simulati. Utilizzando i risultati di un dispositivo prototipo con quattro sensori multiplex come un esempio per spiegare la tecnica, forniamo protocolli sulla (1) il processo di microfabbricazione per creare dispositivi microfluidici con la tecnologia Microfluidic CODICI, (2) la descrizione del setup sperimentale compresa la elettronica, ottica e fluidico hardware, (3) l'algoritmo di decodifica segnali interferenti provenienti da sensori diversi, e (4) i risultati di rilevazione e l'analisi delle cellule tumorali nei canali microfluidici. Noi crediamo che utilizzando il protocollo dettagliato qui descritto, altri ricercatori possono applicare la nostra tecnologia per le loro ricerche.
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Protocol
1. Progettazione di elettrodi Coding
Nota: La figura 1a mostra la struttura 3-D degli elettrodi micropatterned.
- Progettare un set di quattro codici Gold 7-bit per codificare i canali microfluidica 23.
- Costruire due retroazione turno registri lineari (LFSRs), ognuno dei quali rappresenta un polinomio primitivo.
- Utilizzare i LFSR per generare una coppia di 7-bit m -sequences preferito.
- Ciclicamente spostare la coppia di m -sequences preferito e aggiungerli in mod 2 per generare quattro codici d'oro distinti.
- Progettare la disposizione degli elettrodi codifica (Figura 1b).
- Mettere tre terminali degli elettrodi, che rappresenta i, negativi e positivi elettrodi di riferimento a tre angoli.
- Percorso elettrodo positivo e negativo tracce su lati opposti di ciascun canale microfluidico.
- Estensione elettrodi positivi e negativi nelcanali microfluidica come dita elettrodi, che seguono il codice d'oro assegnato in modo univoco (Figura 1c).
- Posizionare l'elettrodo di riferimento tra le dita di elettrodi positivi e negativi.
- Posizionare tracce di elettrodi positivi e negativi lontano dalle più esterne dita elettrodo di riferimento al fine di minimizzare conduzione elettrica fuori della regione codificante.
2. Microfabbricazione di elettrodi di superficie
Nota: La figura 2b mostra il processo di fabbricazione di elettrodi di superficie.
- Pulire un wafer di vetro borosilicato 4 pollici in una soluzione Piranha (acido solforico al 98%: acqua ossigenata al 30% = 5: 1) a 120 ° C per 20 minuti per rimuovere tutti i contaminanti organici. Poi posizionare il wafer su una piastra calda a 200 ° C per 20 minuti per rimuovere l'acqua residua.
- Trasferire la cialda di un filatore. Pipettare 2 mL fotoresist negativo sul wafer e ruotare il wafer ad una velocità di 3, 000 rpm per 40 s per rivestire uniformemente il wafer con uno strato di resina fotosensibile 1,5 micron.
- Posizionare il wafer su una piastra calda a 150 ° C e cuocere il fotoresist filato per 1 min.
- Esporre fotoresist a 365 nm di luce UV (225 mJ / cm 2) attraverso una maschera di cromo mediante un allineatore maschera.
- Posizionare il wafer su una piastra calda a 100 ° C e cuocere il photoresist esposto per 1 min.
- Sviluppare il photoresist immergendo il wafer in uno sviluppatore photoresist (RD6) per 15 s. Delicatamente spruzzare acqua deionizzata (DI) e lavare il wafer. Insufflando azoto compresso.
- Posizionare il wafer con fotoresist modellato in un evaporatore metallico e-beam, e depositare un film di cromo di 20 nm di spessore, seguita da una pellicola di oro 80 nm di spessore sul wafer ad una pressione di base di 3 × 10 -6 Torr con con velocità di deposizione 1 a / s.
- Immergere il wafer metallizzata in acetone in un set bagno ad ultrasuoni ad una frequenza di 40 kHz con 100% di ampiezza per 30 minuti a calma roomtura per incidere il photoresist sottostante e completare il processo di lift-off.
- Tagliare il wafer in pezzi più piccoli utilizzando una sega a dadi convenzionale.
3. Realizzazione dello stampo SU-8 per canali microfluidica
Nota: la figura 2a mostra il processo di fabbricazione dello stampo per canali microfluidica.
- Pulire e cuocere un wafer di silicio da 4 pollici utilizzando la stessa procedura descritta in 2.1.
- Trasferire la cialda di un filatore. Versare 4 mL fotoresist sul wafer. Rivestire la cialda con fotosensibile.
- Spin wafer a 500 rpm per 15 s.
- Spin wafer a 1.000 rpm per 15 s.
- Spin wafer a 3.000 rpm per 60 s per ottenere 15 micron strato di resina fotosensibile spessore uniformemente rivestito.
- Posizionare il wafer su una camera bianca wipe imbevuto di acetone e rimuovere il fotoresist residuo dal retro e bordi del wafer.
- Trasferire il wafer su un pl caldomangiato per morbido cottura. In primo luogo, cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min. Quindi spostare rapidamente il wafer ad una piastra calda a 95 ° C e cuocere per 2 min.
- Esporre fotoresist a 365 nm di luce UV (180 mJ / cm 2) attraverso una maschera di cromo mediante un allineatore maschera.
- Cuocere il wafer dopo esposizione a 65 ° C per 1 min e poi a 95 ° C per 2 min.
- Immergere il wafer di sviluppatore e agitare leggermente il contenitore per 3 min. Poi, lavare il wafer con alcool isopropanolo (IPA) ed asciugarlo soffiando azoto compresso. Se appare un residuo di colore bianco sul wafer, immergerlo sviluppatore nuovo e sviluppare per più tempo e secco.
- Cuocere il wafer su una piastra calda a 200 ° C per 30 minuti per asciugare completamente.
- Misurare lo spessore del fotoresist modellata utilizzando un profilometro a diversi punti del wafer per assicurare uniformità.
- Silanizzare wafer stampo utilizzando la tecnica di deposizione a vapore. Aggiungere 200 ml di trichlorosilane in una capsula di Petri e posto in un essiccatore a vuoto insieme con lo stampo wafer SU-8 per 8 h.
4. Montaggio del codici dei dispositivi Microfluidic
- Posizionare il wafer di silicio da 4 pollici con lo stampo in un diametro Petri da 150 mm, e fissarlo con nastro adesivo ai suoi bordi.
- Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero e reticolante con un rapporto di 10: 1, e versare 50 g della miscela nella capsula di Petri. Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore a vuoto per degasare la miscela per 1 h, quindi curare in stufa a 65 ° C per almeno 4 ore (Figura 2a).
- Tagliare lo strato PDMS curato con un bisturi e sfilarlo wafer stampo con una pinzetta. Le dimensioni del dispositivo di prova di principio è di circa 20 mm × 7 mm. Poi perforare con un diametro di 1,5 mm attraverso i PDMS per l'ingresso e l'uscita del canale microfluidico usando un perforatore biopsia.
- Pulire il lato modellato della parte PDMS posizionando it su un nastro adesivo camere bianche.
- Pulire il substrato di vetro con elettrodi di superficie da risciacquo con acetone, IPA, acqua deionizzata e asciugare con azoto compresso.
- Attivare le superfici di PDMS e substrato di vetro in plasma di ossigeno per 30 s con il lato microlavorato di ciascuna parte rivolta verso l'alto in un generatore RF plasma fissato a 100 mW.
- Allineare il canale microfluidico PDMS con elettrodi superficiali sul substrato di vetro usando un microscopio ottico e quindi sulle due superfici plasma attivato in contatto fisico.
- Cuocere il dispositivo su una piastra calda a 70 ° C per 5 minuti, con il lato di vetro affacciata alla piastra calda.
- Collegare le piazzole di contatto degli elettrodi con fili per saldatura.
5. Preparazione del campione simulato biologica
- Culture gli umani cellule di cancro ovarico HeyA8 in RPMI 1640 integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina in 5% di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° Cfino a raggiungere 80% di confluenza.
- Aspirare il supporto dal pallone di coltura usando una pipetta di vetro. Distribuire e quindi salina aspirare 1x tampone fosfato (PBS) per lavare le cellule.
- Incubare le cellule in 2 ml 0,05% (w / v) soluzione di tripsina per 2 min a 37 ° C per sospendere le cellule aderenti. Quindi, aggiungere 4 ml di terreni di coltura per neutralizzare la tripsina.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 100 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule in una provetta. Poi, aspirare il surnatante completamente.
- Risospendere le cellule in 1-2 ml di PBS 1x pipettando gentilmente su e giù per grumi di cellule meccanicamente dissociano.
- Disegnare una piccola quantità di sospensione cellulare in una pipetta e contare il numero di cellule utilizzando emocitometro.
- Diluire la sospensione cellulare con PBS per preparare un campione con concentrazione cellulare finale di 10 5 -10 6 cellule / ml.
6. Esecuzione del CODICI Microfluidic dispositivo
Nota: Fifigura 3 mostra il setup sperimentale.
- Posizionare il dispositivo CODICI Microfluidic sul palcoscenico di un microscopio ottico.
- Applicare 400 kHz onda sinusoidale all'elettrodo di riferimento sul chip mediante un generatore di funzione elettronica.
- Collegare elettrodi di rilevamento positivi e negativi a due amplificatori trans-impedenza indipendenti per convertire segnali di corrente da ognuna per segnali di tensione.
- Sottrarre il segnale di tensione elettrodo di rilevamento positivo dal segnale di tensione elettrodo di rilevamento negativo utilizzando un amplificatore differenziale di tensione in modo da ottenere un segnale bipolare.
- Utilizzare una macchina fotografica ad alta velocità per un'operazione di registrazione ottica del dispositivo per scopi di convalida e caratterizzazione.
- Guidare la sospensione cellulare attraverso il dispositivo CODICI microfluidici ad una portata costante (50-1,000 mL / h) mediante una pompa a siringa.
- Misurare il segnale di modulazione impedenza, che utilizza un amplificatore lock-in.
- Collegare il segnale AC riferimento refingresso erence dell'amplificatore lock-in. Collegare il segnale differenziale bipolare all'amplificatore lock-in come segnale di ingresso.
- Ottenere l'ampiezza RMS del segnale differenziale dall'uscita dell'amplificatore lock-in.
- Campionare il segnale di uscita dell'amplificatore lock-in a 1 MHz tasso in un computer attraverso una scheda di acquisizione dati per ulteriori analisi.
7. Il trattamento dei segnali dei sensori
- Il trasferimento dei dati elettrici registrati in MATLAB per la post-elaborazione e la decodifica.
- Filtrare il segnale registrato nel dominio digitale utilizzando un filtro Butterworth (funzione incorporata MATLAB) per rimuovere il rumore ad alta frequenza (> 2,5 kHz).
- Genera una libreria di codice modello da segnali dei sensori.
- Identificare segnali rappresentativi di codice non sovrapposizione corrispondenti a ciascun sensore nel dispositivo ed estrarre questi blocchi segnale dal set di dati di forma d'onda come vettori separati.
- Normalizzare ogni modello di codice forma d'onda vettoredalla sua potenza. Utilizzare la MATLAB funzione built-in (bandpower) per misurare la potenza del segnale.
- Utilizzare la funzione MATLAB (resample) per espandere la libreria di template per la creazione digitale versioni di segnali in codice normalizzati con diverse durate per accogliere variazioni di velocità del flusso delle cellule sopra gli elettrodi.
- Identificare i blocchi di segnali corrispondenti al sensore di attività (soglia SNR> 12 dB) nella forma d'onda filtrata. Waveform con SNR sotto della soglia sarà trattato come rumore.
- Decodifica singoli blocchi di attività del sensore nel segnale registrato utilizzando un algoritmo iterativo basato sulla cancellazione di interferenza successiva, una tecnica comunemente impiegata in reti di comunicazione CDMA multi-utenza 24, 25.
- Calcolare correlazione incrociata di ciascun blocco di segnale con tutti i modelli nella libreria utilizzando scorrevole prodotto scalare.
- Identificare il modello che produce il largest autocorrelazione di picco per determinare il segnale dominante individuale codice sonda. Registrare il tempo e l'ampiezza del picco di autocorrelazione.
- Costruire un segnale di codice sensore stima scalando il modello di codice identificato in base alla misura di autocorrelazione picco di ampiezza e informazioni di temporizzazione (determinata al punto 7.5.2).
- Sottrarre il segnale stimato codice sensore dai dati originali.
- Iterare il processo dalla 7.5.1, finché il segnale residuo non assomiglia ad alcun segnale nella libreria modelli, matematicamente definito come il coefficiente di correlazione essendo inferiore a 0,5.
- Affina stime del segnale del sensore iniziali dal punto 7.5 utilizzando un processo di ottimizzazione.
- Ricostruire il segnale con l'aggiunta di segnali dei sensori singoli stima da ogni iterazione.
- Sweep l'ampiezza, durata e frequenza dei singoli segnali dei sensori intorno alle stime iniziali per produrre la migliore forma con il segnale elettrico registratosulla base di minimi quadrati approssimazione 26.
- Convertire ampiezze dei segnali dei sensori stimate nella dimensione delle celle calibrando segnali elettrici contro le immagini ottiche.
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Representative Results
Un dispositivo CODICI microfluidi costituito da quattro sensori distribuiti su quattro canali microfluidica è mostrato in Figura 1b. In questo sistema, la sezione trasversale di ciascun canale microfluidico stato progettato per essere vicino alla dimensione di una cella in modo che (1) più celle non possono passare sopra gli elettrodi in parallelo e (2) cellule rimangono vicino agli elettrodi aumentando la sensibilità . Ogni sensore è progettato per generare un codice digitale 7-bit univoco. Il dispositivo è stato poi testato utilizzando una sospensione cellulare. Segnali elettrici registrati corrispondenti a quattro singoli sensori sono mostrati con associati codici digitali ideali in Figura 4. segnali registrati a stretto contatto corrispondono agli impulsi quadrati ideali, mentre esistono piccole deviazioni. Tali deviazioni risultato di una combinazione di diversi fattori tra cui il campo elettrico non uniforme tra gli elettrodi complanari, accoppiando tra diverse coppie di elettrodi, di forma sfericacellule, così come la velocità di flusso costante di cellule nei canali microfluidici. Abbiamo creato una libreria di modelli in base ai segnali dei sensori ricodificati. Correlando i segnali registrati con tutti i modelli nella libreria, abbiamo determinato un modello che ha prodotto il massimo del picco di autocorrelazione (Figura 4). Poiché i codici digitali dei canali microfluidici sono progettati per essere ortogonali tra loro, una dominante autocorrelazione picco potrebbe robustamente essere identificato in questo processo. Usando questo approccio, potremmo computazionalmente determinare il canale microfluidico cella passa attraverso, la durata del segnale del sensore, e quindi la velocità di flusso della cella.
La tecnologia CODICI Microfluidic in grado di risolvere situazioni in cui diversi cellule interagiscono contemporaneamente con elettrodi di codifica. Quando si verificano tali sovrapposizioni, i segnali provenienti dai singoli sensori interferiscono e la forma d'onda risultante non possono essere facilmente associati con qualsiasisingolo modello corrispondente ad uno specifico sensore. Accuratamente decodificare tali segnali si sovrappongono è particolarmente importante per i campioni ad alta densità di elaborazione affidabile, dove le interferenze sono più probabilità di verificarsi. Per risolvere gli eventi si sovrappongono, abbiamo sviluppato un algoritmo iterativo basato su un regime cancellazione interferenza successiva (SIC) 24, 25, che viene in genere utilizzato per il rilevamento multi-utente in reti di comunicazione CDMA. La Figura 5 mostra come l'algoritmo SIC è implementato nella risoluzione di una forma d'onda che ha portato da quattro celle sovrapposte in quattro diversi canali microfluidica. In ogni iterazione, abbiamo prima determinato dominante picco di autocorrelazione (figura 5a, 2 colonna nd), corrispondente al segnale interferente forte, correlando il segnale video di ingresso (figura 5a, 1 ° colonna) con la libreria template. Sulla base del modello e t selezionatoegli risultante autocorrelazione di ampiezza, abbiamo poi stimato il più forte segnale di interferenza (figura 5a, 3 colonna RD) e sottratto dalla forma d'onda di ingresso. La forma d'onda residua è stata passata alla successiva iterazione come ingresso. Questo processo è continuato fino a quando la correlazione del segnale residuo con la libreria modello non ha dato nessun chiaro picco di autocorrelazione (figura 5a, 5 ° fila, 2 trama nd). Dopo la cessazione del processo di cancellazione di interferenza, abbiamo ricostruito una stima della forma d'onda combinando tutti i segnali stimati da ogni iterazione (Figura 6a). Utilizzando un processo di ottimizzazione basata su un minimi quadrati approssimazione per minimizzare l'errore quadratico medio tra la forma d'onda originale e il segnale ricostruito, abbiamo aggiornato nostre stime per l'ampiezza, la durata, e relativa temporizzazione dei segnali di codice singolo sensore (Figura 6b). Abbiamo anche stimato le dimensioni delle celle rilevate in base all'ampiezza dei singoli segnali dei sensori stimati. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo calibrato le ampiezze dei segnali elettrici con dimensioni delle celle otticamente misurati utilizzando regressione lineare (Figura 6b). Un confronto dei nostri risultati dai codici microfluidici con le informazioni ottenute dalle immagini al microscopio ad alta velocità registrate simultaneamente mostra che la dimensione della cella e la velocità possono essere accuratamente misurati, che convalida i nostri risultati (Tabella 1). La figura 6c mostra l'immagine di microscopia ad alta velocità registrata contemporaneamente utilizzata per la validazione del risultato di decodifica.
Per dimostrare la riproducibilità dei nostri risultati e anche le prestazioni della tecnologia CODICI Microfluidic per un campione di trasformazione ad alta produttività, abbiamo analizzato segnali elettrici corrispondenti a> 1000 cellule. I segnali sono stati decodificati in MATLAB eseguendo l'algoritmo illustratosopra e la precisione dei nostri risultati è stata valutata confrontando direttamente i nostri risultati con dati ottici da video ad alta velocità registrata contemporaneamente. La nostra analisi indica che i segnali elettrici da 96,15% di cellule (973 / 1.012) sono stati accuratamente decodificati. tasso di successo per la decodifica di segnali cellulari non si sovrappongono e si sovrappongono è 98.71% (688/697) e, 90.48% (285/315), rispettivamente.
Figura 1. Struttura del pannello CODICI microfluidici a quattro canali. (A) Elettrodi in ciascun canale microfluidica sono micropatterned per generare un codice digitale univoco. La modulazione impedenza a causa di interazioni sequenziali di fluire cellule con coppie di elettrodi porta ad impulsi elettrici. (B) Una immagine al microscopio del dispositivo CODICI Microfluidic. Durante il processo di fabbricazione, substrato di vetro con codifica elettrodi di superficie è allineato con canali microfluidica PDMS al microscopio. (C) Un primo piano l'immagine di elettrodi di superficie codificati producendo 7-bit sequenze d'oro: "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010", "0.011.000". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. processo Microfabbricazione. (A) I canali microfluidica PDMS sono fabbricati con litografia soft 27. (B) Gli elettrodi di superficie sono fabbricati con un processo lift-off. (C) Una sezione schematica del dispositivo finale. PDMS canali microfluidica sono allineati e legati al substrato di vetro con elettrodi di superficie. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. configurazione sperimentale. Utilizzando una pompa a siringa, la sospensione cellulare viene fatto passare attraverso il dispositivo CODICI microfluidici ad una portata costante. Un segnale AC 400 kHz viene applicata all'elettrodo di riferimento utilizzando un generatore di funzione. segnali attuali di elettrodi di rilevamento positivo e negativo vengono prima convertiti in segnali di tensione utilizzando due amplificatori a transimpedenza e sottratti tra loro mediante un amplificatore differenziale. Il segnale differenziale bipolare è estratto da un amplificatore lock-in e poi campionato in un computer per l'elaborazione del segnale e la decodifica. microscopia ottica ad alta velocità viene utilizzato per un'operazione di registrazione ottica del dispositivo per la convalida e caratterizzazione.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. segnali elettrici registrati dai singoli sensori e le loro correlazioni. segnali registrati e la loro correlazione con l'altro sono date per quattro sensori resistivi codice-multiplex. Sensore 1 (a), il sensore 2 (b), il sensore 3 (c) e sensore 4 (d) sono stati progettati per produrre forme d'onda digitali 7-bit "1.010.110", "0.111.111", "0.100.010", e "0.011.000", rispettivamente, . Per ogni sensore, la figura mostra che all'inizio segnale normalizzato registrato da ciascun sensore corrisponde strettamente con la sequenza di impulso quadrato ideale che il sensore è stato progettato per produrre. Per ogni sensore, il pannello inferiore mostra il segnale di sensore registrata9; s autocorrelazione e cross-correlazione con segnali corrispondenti agli altri tre sensori di codice multiplato nella rete. In tutti i casi, un picco di autocorrelazione può robustamente essere identificato perché i codici digitali dei singoli sensori sono progettati per essere ortogonali tra loro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Decodifica una forma d'onda di sovrapposizione con successiva cancellazione di interferenza. In ogni iterazione, la forma d'onda di ingresso (1 ° colonna) è correlata con la libreria modello preassemblato per identificare il modello specifico che determina l'ampiezza correlazione massima (2 colonna nd). Usando questo modello specifico, il segnale interferente più forte è stimato sulla base dell'ampiezzae informazioni di temporizzazione dal picco di correlazione (3 colonna rd). Il segnale stimato viene quindi sottratto dalla forma d'onda originale, annullando efficacemente l'interferenza forte dovuta alla cella più grande. Il processo viene iterato finché nessun picco di correlazione può essere determinata (cioè, coefficiente di correlazione <0,5) nel segnale residuo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. decodifica analisi dei risultati. (A) i segnali sono stimati raffinata basata su un algoritmo di ottimizzazione che mira ad ottenere il migliore adattamento tra il ricostruito e la forma d'onda originale registrato usando l'approssimazione dei minimi quadrati. (B) Alla fine del processo di ottimizzazione,i tempi e l'ampiezza dei segnali calibrate riflettono accuratamente i parametri di cella misurata mediante microscopia ad alta velocità. (C) l'immagine di microscopia ad alta velocità Contemporaneamente registrato convalida i nostri risultati di misurazioni elettriche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| tipo di misura | R ch1 (micron) | R CH2 (micron) | r ch3 (micron) | R CH4 (micron) | Dt 1 (ms) | Dt 2 (ms) | Dt 3 (ms) |
| Elettrico | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0,465 | 1.705 | 0,744 |
| Ottico | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
Tabella 1. Confronto dei parametri di cella misurata elettricamente e otticamente di figura 6b. Per convalidare le nostre stime, abbiamo otticamente misurato le dimensioni delle celle dalla immagine di microscopia ad alta velocità. temporizzazione relativa tra diverse celle è otticamente misurata dal numero di fotogrammi tra le cellule del video ad alta velocità registrata a 8.000 fotogrammi al secondo.
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Discussion
Molteplici sensori resistivi sono stati precedentemente incorporati in chip microfluidici 28, 29, 30, 31, 32. In questi sistemi, sensori resistivi erano o non multiplexati 28, 29, 30, 31 o hanno richiesto singoli sensori necessari per essere azionati a diverse frequenze 32. In entrambi i casi, sono state necessarie connessioni esterne dedicate per ciascun sensore resistivo impulso sul chip e quindi un elevato numero di sensori non potrebbero essere integrati senza maggiore complessità hardware. Il vantaggio importante di CODICI microfluidici è che permette la lettura simultanea di più sensori resistivi da un'unica uscita in un dispositivo semplice. Raggiungiamo questo obiettivo utilizzando mtecniche ultiplexing comunemente utilizzate nelle telecomunicazioni per progettare sensori resistivi microlavorati integrati in dispositivi microfluidici. In sostanza, la nostra tecnologia si basa sul codice-multiplexing una rete di Contaglobuli on-chip progettando ciascuna per produrre un segnale distinguibile quando viene rilevata una particella. Ogni sensore micromachined nella rete è costituita da più elettrodi di superficie complanare ordinati in diverse configurazioni in modo tale che l'interazione sequenziale di fluire particelle con questi elettrodi produce modulazioni impedenza ortogonali forme d'onda. Per accogliere l'interazione asincrona particelle-sensore, Abbiamo progettato ogni sensore per la produzione di codici d'oro 33, codici digitali pseudo-ortogonali che vengono tipicamente utilizzati in uplink delle reti di telecomunicazione CDMA. Codici d'oro di mantenere un certo livello di ortogonalità anche quando sono disallineati con differenze di fase casuale 34.
MiCODICI crofluidic è facilmente scalabile. Anche se abbiamo presentato i risultati di un prototipo Microfluidic dispositivo CODICI con quattro sensori in questo documento, più sensori possono essere incorporati nel dispositivo quando progettato per produrre segnali di uscita distinguibili dal resto. Un modo per ampliare la rete di sensori è quello di progettare sensori basati su set di codici ortogonali più grandi con codici digitali più lunghi. Più codici ortogonali con più bit offrono una maggiore guadagno di trasformazione nella decodifica e possono essere distinti l'uno dall'altro quando c'è interferenza. D'altra parte, i codici più oro nel dispositivo significa anche maggiore volume di rilevamento, che aumenta il numero atteso di sensori interferenti. Allo stesso modo, aumentando il numero di sensori per una data densità campione porterà a più particelle sovrapposte a causa di un aumento del volume complessivo di rilevamento. Come tale, la densità delle particelle nel campione è un parametro critico che deve essere considerato nella utilizzando la tecnologia CODICI Microfluidic. La massima pDensità articolo che può essere risolto (in analogia con la capacità del canale di una rete di telecomunicazione CDMA) dipende da diversi fattori quali i singoli segnali dei sensori e la loro relazione, lo schema di decodifica, il layout del dispositivo microfluidica, e il livello di rumore elettronico. A seconda dell'applicazione, il campione può essere diluito raggiunto una densità di particella che produce un tasso di errore accettabile.
Dal punto di vista elaborazione del segnale, decodifica di forme d'onda di tempo da un dispositivo CODICI Microfluidic non è computazionalmente intensive utilizzando sistemi attuali come evidenziato dal fatto che le comunicazioni di telefonia cellulare in una rete CDMA possono essere demultiplato in tempo reale. Inoltre, gli eventi fisici per essere decodificati in dispositivi microfluidici accadere molto più lento di velocità di trasmissione bit nelle comunicazioni di telefonia cellulare che consente di utilizzare più avanzato e che richiede tempo algoritmi come SIC e di una ottimizzazione dei processi, che usiamo per risolvere in modo iterativo sovrapposizione SIsegnal da sensori.
Nel loro insieme, CODICI microfluidici è un versatile, scalabile tecnologia di rilevamento elettronico che può essere facilmente integrato in vari dispositivi microfluidici per realizzare analisi quantitative tracciando particelle vengono elaborati sul chip. La tecnologia è molto facile da implementare, in quanto (1) è molto semplice dal punto di vista hardware (2) è direttamente compatibile con litografia morbida (3) fornisce un elettronico lettura diretta senza alcun componente attivo on-chip, e (4) si basa su semplici algoritmi di calcolo per l'elaborazione del segnale e l'interpretazione dei dati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
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