Summary
Мы демонстрируем микрожидком платформу с интегрированной поверхности электрода сети, которая сочетает в себе резистивный импульса зондирования (RPS) с множественного доступа с кодовым разделением каналов (CDMA), мультиплексирование обнаружение и определение размеров частиц в нескольких микроканалов.
Abstract
Микрожидкостных обработки биологических образцов, как правило, включает в себя дифференциальные манипуляции взвешенных частиц в различных силовых полях, чтобы пространственно фракционирования образца, основанный на биологическом свойстве интерес. Для результирующее пространственное распределение для использования в качестве аналитического считывания, микрофлюидальные устройства часто подвергаются микроскопическому анализу требует сложного приборы с более высокой стоимостью и уменьшенной переносимости. Для устранения этого ограничения, мы разработали интегрированную электронную технологию зондирования для мультиплексированного обнаружения частиц в различных местах на микрожидком чипе. Наша технология, получившая название микрожидком КОДЫ, сочетает в себе резистивный импульсного зондирования с кодовым разделением множественного доступа для сжатия 2D пространственной информации в 1D электрический сигнал. В этой статье мы представляем практической демонстрацией Микрожидкостных технологии КОДОВ для обнаружения и размера культивируемые раковые клетки распределены по нескольким микроканалов. В видеподтверждено высокоскоростном микроскопии, наша технология может точно анализировать плотные клеточные популяции все в электронном виде без необходимости внешнего устройства. Таким образом, Микрожидкостных КОДЫ потенциально может позволить недорогие интегрированные устройства лаборатории-на-чипе, которые хорошо подходят для тестирования точки оказания медицинской помощи биологических образцов.
Introduction
Точное обнаружение и анализ биологических частиц , таких как клетки, бактерии или вирусы , взвешенных в жидкости представляет большой интерес для целого ряда приложений 1, 2, 3. Хорошо подобранная по размеру, микрофлюидальные устройства предлагают уникальные преимущества для этой цели , такие как высокая чувствительность, нежные манипуляции образца и хорошо контролируемой микросреде 4, 5, 6, 7. Кроме того, микрофлюидальные устройства могут быть разработаны , чтобы использовать комбинацию динамики жидкости и силовых полей пассивно фракционирования гетерогенную популяцию биологических частиц на основе различных свойств 8, 9, 10, 11, 12. В те устройствас, результирующее распределение частиц может быть использован в качестве считыванием но пространственной информации, как правило, доступны только через микроскопии, что ограничивает практическую полезность микрожидком устройства, связывая его к лабораторной инфраструктуре. Таким образом, встроенный датчик, который может легко сообщать о пространственно-временного отображения частиц ", так как они манипулируют на микрожидком устройстве, потенциально может дать недорогой, интегрированные устройства лаборатории-на-чипе, которые особенно привлекательны для тестирования образцов в мобильном телефоне , ограниченных ресурсов.
Тонкопленочных электродов использовались в качестве встроенных датчиков в микрофлюидальных устройств для различных применений , 13, 14. Резистивный Pulse Sensing (RPS) является особенно привлекательным для интегрированного зондирования малых частиц в микроканалов , как это предлагает надежный, чувствительный, и механизм обнаружения высокой пропускной способностью непосредственно из электрических измерений 15, В RPS, модуляция импеданса между парой электродов, погружают в электролит, используется в качестве средства для обнаружения частицы. Когда частица проходит через отверстие, размером от порядка частицы, число и амплитуда переходных импульсов в электрический ток используются для подсчета и частиц размера, соответственно. Кроме того, геометрия датчика может быть разработан с разрешением фотолитографии для формирования резистивных формы сигналов импульсов с целью повышения чувствительности 16, 17, 18, 19 или оценить вертикальное положение частиц в микроканалов 20.
Мы недавно ввели масштабируемой и простой мультиплексированный резистивной технологии импульсного зондирования под названием Микрожидкостных закодированных с ортогональным обнаружения электрическими зондированию (микрожидком кодов) 21. Микрожидком КОДЫ полагается навзаимосвязанную сеть резистивных датчиков пульса, каждый из которых состоит из множества электродов микромеханического для модуляции проводимости в уникальном, различимым способом, с тем чтобы позволить мультиплексирование. Мы специально разработаны каждый датчик для получения ортогональных электрических сигналов , аналогичных цифровых кодов , используемых в множественного доступа с кодовым разделением каналов 22 (CDMA) телекоммуникационные сети, так что индивидуальный сигнал резистивный датчик импульсов может быть однозначно восстанавливается из одного выходного сигнала, даже если сигналы от различные датчики мешают. Таким образом, наша технология сжимает 2D пространственной информации частиц в электрический сигнал 1D, что позволяет контролировать частиц в различных местах на микрожидком чипе, сохраняя при этом как Device- и на системном уровне сложности к минимуму.
В этой статье мы представляем подробный протокол для экспериментальных и расчетных методов, необходимых для использования Микрожидкостных технологии кодексах, а также гepresentative результаты его использования при анализе моделируемых биологических образцов. Используя результаты от прототипа устройства с четырьмя мультиплексированных датчиков в качестве примера, чтобы объяснить технику, мы предоставляем протоколы о (1) процесса микротехнологий для создания микрожидкостных устройств с Микрожидкостных технологии кодексах, (2) описание экспериментальной установки, включая электронной, оптической и жидкостный аппаратных средств, (3) компьютерный алгоритм для декодирования сигналов помех от различных датчиков, и (4) результаты обнаружения и анализа раковых клеток в микроканалов. Мы считаем, что использование подробный протокол, описанный здесь, другие исследователи могут применять нашу технологию для своих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция Coding электродов
Примечание: На рисунке 1а показан 3-D структуру micropatterned электродов.
- Дизайн набор из четырех 7-битных кодов Gold для кодирования микроканалов 23.
- Построить два линейных сдвига с обратной связью-регистров (LFSRs), каждый из которых представляет собой примитивный многочлен.
- Используйте LFSRs для создания предпочтительного пары 7-битных м -последовательностями.
- Циклическая сдвиг предпочтительный пару м -последовательностями и добавить их в мод 2 для создания четырех различных кодов Gold.
- Дизайн расположение электродов кодирования (рис 1b).
- Поместите три электродных выводов, представляющих положительный, отрицательный и опорные электроды на трех углах.
- Маршрут положительный и отрицательный электрод следы на противоположных сторонах каждого микрожидком канала.
- Продлить положительные и отрицательные электроды вмикроканалов в качестве электродных пальцев, следуя однозначно присвоен код Голда (рис. 1в)
- Поместите электрод сравнения между положительными и отрицательными электродными пальцами.
- Поместите положительные и отрицательные электродные следы далеко от внешнего опорного электрода пальцами, чтобы минимизировать электрическую проводимость вне кодирующей области.
2. микротехнологий поверхностных электродов
Примечание: На рисунке 2b показан процесс изготовления поверхностных электродов.
- Почистите 4-дюймовый боросиликатного стекла пластины в пираньи раствор (98% -ной серной кислоты: 30% перекиси водорода = 5: 1) при 120 ° С в течение 20 мин, чтобы удалить все органические загрязнения. Затем поместите пластину на горячей плите 200 ° С в течение 20 мин для удаления остаточной воды.
- Передача пластины на блесны. Разлить 2 мл негативного фоторезиста на пластину и закрутить пластины со скоростью 3, 000 оборотов в минуту в течение 40 секунд, чтобы равномерно покрыть вафель с фоторезиста толщиной слоя 1,5 мкм.
- Поместите пластину на горячей плите 150 ° C и выпекать прядильного фоторезиста в течение 1 мин.
- Выставляют фоторезиста 365 нм УФ - светом (225 мДж / см 2) через хромированной маску с помощью маски Aligner.
- Поместите пластину на горячей плите 100 ° С и выпекать подвергается фоторезиста в течение 1 мин.
- Разработка фоторезиста путем погружения пластины в проявителе фоторезиста (Rd6) в течение 15 с. Аккуратно распылить деионизированную (DI) воду и промойте пластину. Сухие путем продувки сжатым азотом.
- Поместите пластину с узорчатым фоторезиста в металлический испаритель электронного пучка, и депонировать 20-нм толщиной хромированную пленку, с последующим 80-нм толщиной пленки золота на пластину при базовом давлении от 3 · 10 -6 Торр с скорость осаждения 1 Å / с.
- Опустить пластину с металлическим покрытием в ацетоном в ультразвуковой ванне набор на частоте 40 кГц с амплитудой 100% в течение 30 мин при комнатной нравратура вытравить основной фоторезиста и завершить процесс подъема-офф.
- Нарезать пластины на более мелкие части, используя обычную пилу для нарезания кубиками.
3. Изготовление пресс-формы SU-8 для микроканалов
Примечание: На рисунке 2а показан процесс изготовления пресс - формы для микроканалов.
- Очистить и испечь 4-дюймовый кремниевой пластины с помощью той же процедуры, описанной в разделе 2.1.
- Передача пластины на блесны. Налейте 4 мл фоторезиста на пластину. Покройте пластину с фоторезистом.
- Спин пластины при 500 оборотах в минуту в течение 15 сек.
- Спин пластины при 1000 оборотах в минуту в течение 15 сек.
- Спин пластины при 3000 оборотах в минуту в течение 60 секунд, чтобы получить равномерное покрытие 15-мкм слой фоторезиста.
- Поместите пластины лицевой стороной вверх на чистую комнату протирать смоченной в ацетоне и удаления остатков фоторезиста с тыльной стороны и по краям пластины.
- Передача пластины на горячую плели для мягкой выпечки. Во-первых, выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин. Затем быстро переместить пластины к C горячей плите 95 ° и выпекать в течение 2 мин.
- Выставляют фоторезиста 365 нм УФ - светом (180 мДж / см 2) через хромированной маску с помощью маски Aligner.
- Выпекать вафельного после воздействия при температуре 65 ° С в течение 1 мин и затем при 95 ° С в течение 2 мин.
- Погрузитесь пластины в разработчика и осторожно встряхните контейнер в течение 3 мин. Затем промойте пластину с изопропанолом спиртом (IPA) и высушить его путем продувки сжатым азотом. Если на пластине появляется белого цвета остаток, погрузить его в проявитель снова и развиваться в течение длительного времени и сухой.
- Выпекать пластины на горячей плите 200 ° С в течение 30 мин, чтобы высушить его полностью.
- Измерьте толщину узорной фоторезиста с использованием профилометра в различных местах по всей пластине, чтобы обеспечить однородность.
- Silanize пластины пресс-формы с использованием техники осаждения из паровой фазы. Добавить 200 мкл трichlorosilane в чашку Петри и поместить в вакуум-сушилке, вместе с пластиной формы SU-8 в течение 8 ч.
4. Монтаж Микрожидкостных коды устройств
- Поместите 4-дюймовый кремниевой пластины с плесенью в чашку Петри диаметром 150 мм, и закрепить его пластырем из его краев.
- Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS), предварительно полимер и сшивающий агент, в соотношении 10: 1, и заливают 50 г смеси в чашку Петри. Поместите чашку Петри в вакуумном эксикаторе , чтобы дегазировать смеси в течение 1 ч, а затем вылечить его в печи при температуре 65 ° С в течение по меньшей мере 4 ч (рис 2а).
- Вырежьте отвержденного PDMS слой с помощью скальпеля и очистить его от пластины пресс-формы, используя пинцет. Размер устройства доказательством правильности принципа составляет около 20 мм × 7 мм. Затем пробивки отверстий с диаметром 1,5 мм, через PDMS для входа и выхода из канала с помощью микрожидком перфоратором биопсии.
- Очистите узорчатую сторону части PDMS путем размещения Iт на чистой комнаты клейкой лентой.
- Очистите стеклянную подложку с поверхностными электродами, промывая его ацетоном, IPA, дистиллированной водой и высушить с помощью сжатого азота.
- Активируйте поверхности PDMS и стеклянной подложки в кислородной плазме в течение 30 с с микромеханического стороны каждой части лицевой стороной вверх в генераторе ВЧ плазмы, установленной на 100 мВт.
- Совместите микрожидкостных канал PDMS с поверхностными электродами на стеклянной подложке с помощью оптического микроскопа, а затем довести два плазменных активированных поверхностей в физическом контакте.
- Выпекать устройство на горячей плите 70 ° С в течение 5 мин, с стороны стекла, обращенной к горячей пластины.
- Соедините контактные площадки электродов с проводами с помощью пайки.
5. Подготовка моделируемого биологического образца,
- Культура HeyA8 клеток рака яичников человека в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина в 5% атмосфере СО 2 при 37 ° Cпока они не достигают 80% слияния.
- Аспирируйте носитель из культуральной колбы с помощью стеклянной пипетки. Разлить, а затем аспирата 1x фосфатный буферный раствор (PBS), чтобы промыть клетки.
- Инкубируйте клетки в 2 мл 0,05% (вес / объем) раствора трипсина в течение 2 мин при 37 ° C, чтобы приостановить прилипшие клетки. Затем добавляют 4 мл культуральной среды, чтобы нейтрализовать трипсина.
- Центрифуга клеточной суспензии при 100 х г в течение 5 мин для осаждения клеток в пробирке. Затем аспирата супернатант полностью.
- Повторное приостановить клеток в 1-2 мл 1x PBS, осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы механически диссоциируют сгустки клеток.
- Нарисуйте небольшое количество суспензии клеток в пипетку и подсчитывают количество клеток с использованием гемоцитометра.
- Развести суспензии клеток с PBS для получения образца с конечной концентрации клеток 10 5 -10 6 клеток / мл.
6. Запуск Микрожидкостных коды устройств
Примечание: Fi3 цифра показывает экспериментальную установку.
- Поместите Микрожидкостных коды устройств на этапе оптического микроскопа.
- Применение 400 кГц синусоиду для электрода сравнения на чипе с использованием функции электронного генератора.
- Подключение положительный и отрицательный электроды чувствительных к двум независимым усилителей транс импедансом для преобразования сигналов тока от каждого в сигналы напряжения.
- Вычитание положительного чувствительного электрода сигнал напряжения от отрицательного напряжения сигнала чувствительного электрода с помощью усилителя дифференциального напряжения для того, чтобы получить биполярный сигнал.
- Используйте камеру высокоскоростной оптически операции записи устройства в целях проверки и определения характеристик.
- Привод клеточной суспензии через устройство микрожидком коды со постоянной скоростью потока (50-1,000 мкл / ч) с помощью шприцевого насоса.
- Измерить сигнал модуляции импеданса, используя Синхронный усилитель.
- Подключите опорный сигнал переменного тока к исхразностная вход усилителя блокировки в. Подключите дифференциальный сигнал биполярного к усилителю блокировки в качестве входного сигнала.
- Амплитуду RMS дифференциального сигнала от синхронизированный выходной сигнал усилителя.
- Пример блокировки в выходной сигнал усилителя при частоте 1 МГц в компьютер через платы сбора данных для дальнейшего анализа.
7. Обработка сигналов датчиков
- Передача записанных электрических данных в MATLAB для последующей обработки и декодирования.
- Фильтр записанного сигнала в цифровой области с использованием фильтра Баттерворта (MATLAB встроенную функцию), чтобы удалить высокочастотный шум (> 2,5 кГц).
- Создайте библиотеку шаблонов кода из сигналов датчиков.
- Определить репрезентативные сигналы не перекрываются код, соответствующий каждому датчику в устройстве и извлечения этих блоков сигнала из набора данных в виде отдельных векторов формы сигнала.
- Нормализация каждого шаблона вектора кода формы сигналаего силой. Использование MATLAB встроенной функции (bandpower) для измерения мощности сигнала.
- Используйте функцию MATLAB (передискретизации), чтобы расширить библиотеку шаблонов с помощью цифровой форме создания версии нормированных кодовых сигналов с различной длительности для компенсации изменения скорости потока клеток над электродами.
- Определить блоки сигнала, которые соответствуют датчику активности (порог: SNR> 12 дБ) в отфильтрованной формы сигнала. Форма сигнала с ОСШ ниже порога будет рассматриваться как шум.
- Расшифруйте отдельные блоки датчика активности в записываемый сигнал, используя итерационный алгоритм , основанный на отмене последовательного вмешательства, технику , обычно используемые в многопользовательских сетях связи CDMA 24, 25.
- Расчет кросс-корреляции каждого сигнального блока со всеми шаблонами в библиотеке с помощью скользящего скалярного произведения.
- Определить шаблон, который производит крупЭст автокорреляции пик для определения доминирующего индивидуального кода сигнала датчика. Запишите время и амплитуду пика АКФ.
- Построить кодового сигнала датчика оценку путем масштабирования идентифицированный шаблон кода, основанный на пиковой амплитуды автокорреляции измеренной и временной информации (определяется на этапе 7.5.2).
- Вычитание оценочную кодового сигнала датчика от исходных данных.
- Итерации процесс от 7.5.1, до тех пор, пока остаточный сигнал не похож на какой-либо сигнал в библиотеке шаблонов, математически определяется как коэффициентом корреляции менее 0,5.
- Уточнить первоначальные оценки сигнала датчика с шага 7.5 с использованием процесса оптимизации.
- Реконструировать сигнал путем добавления отдельных сметных сигналов датчиков от каждой итерации.
- Развертки амплитуду, длительность и сроки отдельных сигналов датчиков вокруг первоначальных оценок, чтобы произвести наилучшее соответствие с записанными электрический сигналосновываясь на наименьших квадратов аппроксимации 26.
- Преобразование амплитуды расчетных сигналов датчиков в размера ячейки путем калибровки электрических сигналов от оптических изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрожидком КОДЫ устройство , состоящее из четырех датчиков , распределенных по четырем микроканалов показано на рисунке 1b. В этой системе, поперечное сечение каждого микрожидком канала был разработан, чтобы быть близко к размеру ячейки таким образом, чтобы (1) множество ячеек, не могут проходить через электроды параллельно, и (2) клетки остаются близкими к электродам повышения чувствительности , Каждый датчик предназначен для создания уникального 7-битный цифровой код. Устройство затем тестировали с использованием клеточной суспензии. Записанное электрические сигналы , соответствующие четырем отдельных датчиков показаны с соответствующими идеальными цифровыми кодами на рисунке 4. Записанные сигналы близко совпадают с идеальными прямоугольными импульсами, в то время как небольшие отклонения существуют. Такие отклонения являются результатом комбинации нескольких факторов, в том числе неоднородном электрическом поле между электродами компланарных, обеспечивают соединение между различными парами электродов, сферической формыклетки, а также постоянная скорость потока клеток в микроканалов. Мы создали библиотеку шаблонов на основе перекодированных сигналов датчиков. Сопоставляя записанные сигналы со всеми шаблонами в библиотеке, мы определили шаблон , который произвел максимальное авто- корреляционный пик (рисунок 4). По мере того как цифровые коды для микроканалов предназначены, чтобы быть ортогональными друг другу, доминирующий автокорреляция пик робастно можно идентифицировать в этом процессе. Используя этот подход, мы могли бы определить, в вычислительном микрожидкостных канал ячейка проходит через, длительность сигнала датчика, и, следовательно, скорость потока клетки.
Технология Микрожидкостных КОДЫ может разрешить ситуации, когда несколько ячеек одновременно взаимодействуют с кодирующим электродами. При возникновении таких совпадений, то сигналы от отдельных датчиков, интерферируют и результирующий сигнал не может легко быть связан с любымодин шаблон, соответствующий конкретному датчику. Точно декодирования таких перекрывающихся сигналов особенно важно для надежной обработки образцов с высокой плотностью, где интерференцией более вероятны. Для устранения дублирования событий, мы разработали итеративный алгоритм , основанный на схеме последовательного подавления помех (SIC) 24, 25, которая , как правило , используется для обнаружения многопользовательского в сетях связи CDMA. На рисунке 5 показано , как алгоритм СИК реализован в разрешении сигнала , который был результатом четырех перекрывающихся клеток в четырех различных микроканалов. В каждой итерации, мы сначала определили доминирующую автокорреляции пик (рисунок 5a, 2 - й столбец), что соответствует самому сильному помехового сигнала, путем соотнесения входного сигнала (рисунок 5а, 1 - й столбец) с библиотекой шаблонов. На основе выбранного шаблона и тон результирующая амплитуду автокорреляции, мы тогда оценили сильный сигнал помехи (рис 5а, 3 - й столбец) и вычесть его из входного сигнала. Оставшийся сигнал был принят на следующей итерации в качестве входных данных. Этот процесс продолжается до корреляции остаточного сигнала с библиотекой шаблонов не дала четкий пик автокорреляции (рис 5а, 5 - й строке, 2 - й участок). После прекращения процесса аннулирования помех, мы реконструировали оценку сигнала путем объединения всех расчетных сигналов от каждой итерации (рис 6а). Использование процесса оптимизации , основанный на аппроксимации по методу наименьших квадратов для минимизации среднеквадратической ошибки между первоначальной формы волны и реконструированного сигнала, мы обновили наши оценки для амплитуды, длительности и относительной синхронизации отдельных сигналов кодовых датчиков (рис 6б). Мы также оценили размерклетки детектируется на основе амплитуды расчетных отдельных сигналов датчиков. Для достижения этой цели мы калиброванный электрические амплитуды сигналов с оптически измеренных размеров ячеек с использованием линейной регрессии (рисунок 6б). Сравнение полученных результатов с Микрожидкостных КОДАМ с информацией , полученной из одновременно записанных изображений микроскопа высокоскоростных показывает , что размер ячейки и скорость может быть точно измерено, что подтверждает наши результаты (таблица 1). Рисунок 6с показывает одновременно записанную высокоскоростной микроскопии изображение , используемое для проверки результата декодирования.
Для демонстрации воспроизводимости результатов, а также производительность Микрожидкостных технологии кодов для обработки проб с высокой пропускной способностью, мы проанализировали электрические сигналы, соответствующие> 1000 клеток. Сигналы были автоматически декодируется в среде MATLAB, запустив алгоритм объяснилвыше и точность полученных результатов оценивали путем непосредственного сравнения наших результатов с оптическими данными одновременно записанного высокоскоростного видео. Наш анализ показывает, что электрические сигналы от 96,15% клеток (973 / 1,012) были точно декодировать. Успех ставки для декодирования сигналов неперекрывающихся и перекрывающихся клеток составляет 98,71% (688/697) и 90,48% (285/315), соответственно.
Рисунок 1. Конструкция четырех-канального устройства микрожидком кодексами. (А) электроды в каждом микрожидком канале micropatterned для создания уникального цифрового кода. Модуляция импеданса за счет последовательных взаимодействий проточных ячеек с пар электродов приводит к электрических импульсов. (Б) микроскопическое изображение Микрожидкостных КОДЫ устройства. Во время процесса изготовления, стеклянная подложка с кодирующими поверхностными электродами совмещен с PDMS микроканалов под микроскопом. (С) крупным планом изображение закодированных поверхностных электродов , производящих 7-битовых последовательностей Голда: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Процесс микротехнологий. (А) микроканалов PDMS изготовлены с использованием мягкой литографии 27. (Б) поверхность электроды изготовлены с использованием обратной литографии процесс. (В) схема конечного устройства Поперечное сечение. PDMS микроканалов выровнены и соединены к стеклянной подложке с поверхностными электродами. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Настройка экспериментальной. С помощью шприцевого насоса, клеточную суспензию пропускают через устройство микрожидком коды со постоянной скоростью потока. Сигнал переменного тока 400 кГц подается на электрод сравнения с использованием функционального генератора. Текущие сигналы положительных и отрицательных электродов, чувствительных сначала преобразуются в сигналы напряжения с использованием двух импедансов усилителей и вычитать друг от друга с помощью дифференциального усилителя. Биполярная дифференциальный сигнал извлекается с помощью Синхронный усилитель, а затем отбираться в компьютер для обработки и декодирования сигнала. Высокоскоростной оптическая микроскопия используется для оптически операции записи устройства в целях проверки и определения характеристик.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Recorded электрические сигналы от отдельных датчиков и их корреляций. Записанные сигналы и их соотношение друг с другом приведены для четырех кодовых мультиплексированием резистивных датчиков пульса. Датчик 1 (а), датчик 2 (б), датчик 3 (с) и датчик 4 (d) , были разработаны для получения 7-битовые цифровые сигналы "1010110", "0111111", "0100010", и "0011000", соответственно , Для каждого датчика, верхний рисунок показывает, что нормализованный сигнал, регистрируемый с каждого датчика соответствует в тесном контакте с идеальной квадратной последовательности импульсов, что датчик был разработан, чтобы произвести. Для каждого датчика, нижняя панель показывает записываемый сигнал датчика9; s автокорреляции и взаимной корреляции с сигналами, соответствующими трем другим кодовым разделением датчиков в сети. Во всех случаях пик автокорреляции робастно могут быть идентифицированы потому, что цифровые коды от отдельных датчиков предназначены, чтобы быть ортогональными друг к другу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Декодирование перекрывающийся сигнала с последовательными интерференционной аннулированием. В каждой итерации, входной сигнал (1 - й столбец) соотносится с предварительно собранной библиотеки шаблонов для идентификации конкретного шаблона , который приводит к максимальной амплитуде корреляции (2 - й столбец). Используя этот конкретный шаблон, самый сильный сигнал помехи оценивается на основании амплитудыи информацию о синхронизации от пика корреляции (3 - й столбец). Предполагаемый сигнал затем вычитается из первоначальной формы волны, эффективно отменяя сильнейший помехи из-за самой большой клетке. Процесс повторяется до тех пор , не пик корреляции не может быть определена (т.е. коэффициент корреляции <0,5) в остаточном сигнале. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Декодирование результат анализа. (А) Прогнозируемое сигналы уточнены на основе алгоритма оптимизации , который направлен для получения наилучшего соответствия между реконструированный и оригинальной записи сигнала с использованием аппроксимации по методу наименьших квадратов. (Б) В конце процесса оптимизации,выбор времени и амплитуда калиброванных сигналов точно отражают параметры ячейки, измеренные высокоскоростном микроскопии. (С) Одновременно записывается высокоскоростной микроскопии изображение подтверждает наши результаты от электрических измерений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Тип измерения | г ч1 (мкм) | г ch2 (мкм) | г ch3 (мкм) | г СН4 (мкм) | & Dgr ; t 1 (мс) | T 2 (мс) | & Dgr ; t 3 (мс) |
| электрический | 8,010 | 6,490 | 5.300 | 6,550 | 0.465 | 1,705 | 0.744 |
| оптический | 8,320 | 6,770 | 5,680 | 7,040 | 0.375 | 1.625 | 0.750 |
Таблица 1. Сравнение электрически и оптически измеряемых параметров ячейки Рисунок 6b. Для подтверждения наших оценок, мы оптически измеряли размеры ячеек от микроскопии изображения с высокой скоростью. Относительная синхронизация между различными клетками оптически измеряется от количества кадров между клетками в высокоскоростном видео, записанного в 8000 кадров в секунду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько резистивными датчиками импульсов ранее были включены в микрофлюидальных чипы 28, 29, 30, 31, 32. В этих системах, резистивные датчики импульсов либо не были мультиплексированы 28, 29, 30, 31 или они требуются отдельные датчики для эксплуатации на различных частотах 32. В обоих случаях были необходимы внешние соединения выделенные для каждого резистивного датчика импульсов на микросхеме и, следовательно, большое количество датчиков не могут быть интегрированы без большей сложности аппаратных средств. Важным преимуществом микрожидком КОДАМ является то, что она позволяет одновременное чтение нескольких датчиков резистивный импульсов от одного выхода в простом устройстве. Мы добиваемся этого путем использования тметоды ultiplexing, обычно используемые в области телекоммуникаций для разработки микромеханического резистивных датчиков импульсов интегрированы в микрофлюидальных устройств. В сущности, наша технология основана на коде мультиплексирование сеть счетчиков на чипе Coulter путем разработки каждого, чтобы произвести различимый сигнал, когда частица обнаруживается. Каждый микромеханического датчика в сети состоит из нескольких копланарный поверхностных электродов, упорядоченных в различные конфигурации таким образом, что последовательное взаимодействие частиц с протекающий этими электродами производит ортогональные модуляций сопротивление формы волны. Для размещения асинхронного взаимодействия частиц датчика, мы специально разработан каждый датчик в процессе производства золота коды 33, псевдоортогонального цифровые коды, которые обычно используются в восходящей линии связи телекоммуникационных сетей CDMA. Золотые коды поддерживать определенный уровень ортогональности , даже если они смещены со случайными разности фаз 34.
миcrofluidic КОДЫ легко масштабируется. Несмотря на то, мы представили результаты от прототипа микрожидком коды устройств с четырьмя датчиками в данной работе, более датчиков могут быть включены в устройство, когда предназначен для получения выходных сигналов, отличаются от остальных. Один из способов расширения сети датчиков заключается в разработке сенсоров на основе больших ортогональных кодовых наборов с более длинными цифровыми кодами. Более длинные ортогональные коды с большим числом битов, обеспечивают более высокий коэффициент усиления обработки при декодировании, и можно отличить друг от друга при наличии помех. С другой стороны, больше золота коды в устройстве также означает больший объем зондирования, что увеличивает ожидаемое число интерферирующих датчиков. Аналогичным образом, увеличение количества датчиков для данной плотности образца будет приводить к большему количеству частиц перекрывающихся из-за увеличения общего объема зондирования. Таким образом, плотность частиц в образце является критическим параметром, который необходимо учитывать при использовании технологии микрожидком кодексами. Максимальный рПлотность статья, которая может быть решена (по аналогии с пропускной способностью канала телекоммуникационной сети CDMA) зависит от нескольких факторов, таких как индивидуальные сигналы датчиков и их связи, схема декодирования, компоновки микрожидкостных устройств и электронного уровня шума. В зависимости от применения, образец может быть разбавлена до достижения плотности частиц, что дает приемлемый коэффициент ошибок.
С точки зрения обработки сигналов, декодирование временных волновых форм микрожидком коды устройств не интенсивных вычислений с использованием существующих систем, о чем свидетельствует тот факт, что мобильный телефон связи в сети CDMA может быть демультиплексированы в режиме реального времени. Кроме того, физические события, подлежащие декодированию в микрожидкостных устройств происходит гораздо медленнее, чем битовой скорости передачи данных в ячейки телефонной связи позволяет нам использовать более продвинутые и отнимает много времени алгоритмы, такие как SIC и А.Н. процессы оптимизации, которые мы используем для итерационного решения перекрытия сиgnals от датчиков.
Взятые вместе, микрожидком КОДЕКСЫ является универсальным, масштабируемое электронных технологий зондирования, которые могут быть легко интегрированы в различные микрофлюидальных устройств для реализации количественного анализа путем отслеживания частиц, как они обрабатываются на чипе. Технология очень проста в реализации, потому что (1) он очень прост с точки зрения оборудования (2) он совместим с мягкой литография (3) он обеспечивает прямую электронное считывание без какого-либо активного компонента на кристалле, и (4) она опирается на простых вычислительных алгоритмов для обработки сигналов и интерпретации данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Res. 46 (3), 907-919 (2012).
- Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 24 (4), 429-448 (2000).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Cantón, R., Nombela, C., Sánchez-Pérez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Toner, M., Irimia, D. Blood-on-a-chip. Annu Rev Biomed Eng. 7, 77-103 (2005).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Current Opin Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nat Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Cermak, N., et al. High-throughput measurement of single-cell growth rates using serial microfluidic mass sensor arrays. Nat Biotechnol. , (2016).
- Gossett, D., et al. Label-free cell separation and sorting in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3249-3267 (2010).
- Tsutsui, H., Ho, C. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems. Mech Res Commun. 36 (1), 92-103 (2009).
- Edwards, T. L., Gale, B. K., Frazier, A. B. A microfabricated thermal field-flow fractionation system. Anal Chem. 74 (6), 1211-1216 (2002).
- Wang, M. M., et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. Nat Biotechnol. 23 (1), 83-87 (2005).
- Shields, C. W. IV, Reyes, C. D., López, G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 15 (5), 1230-1249 (2015).
- Gawad, S., Schild, L., Renaud, P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing. Lab Chip. 1 (1), 76-82 (2001).
- Haandbæk, N., Bürgel, S. C., Heer, F., Hierlemann, A. Characterization of subcellular morphology of single yeast cells using high frequency microfluidic impedance cytometer. Lab Chip. 14 (2), 369-377 (2014).
- Bayley, H., Martin, C. Resistive-pulse sensing-from microbes to molecules. Chem Rev. 100 (7), 2575-2594 (2000).
- Polling, D., Deane, S. C., Burcher, M. R., Glasse, C., Reccius, C. H. Coded electrodes for low signal-noise ratio single cell detection in flow-through impedance spectrophy. Proceedings of uTAS. (The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences), Groningen, The Netherlands, , 3-7 (2010).
- Javanmard, M., Davis, R. W. Coded corrugated microfluidic sidewalls for code division multiplexing. IEEE Sensors J. 13 (5), 1399-1400 (2013).
- Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: a robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
- Emaminejad, S., Talebi, S., Davis, R. W., Javanmard, M. Multielectrode sensing for extraction of signal from noise in impedance cytometry. IEEE Sensors J. 15 (5), 2715-2716 (2015).
- Spencer, D., Caselli, F., Bisegna, P., Morgan, H. High accuracy particle analysis using sheathless microfluidic impedance cytometry. Lab Chip. 16 (2016), 2467-2473 (2016).
- Liu, R., Wang, N., Kamili, F., Sarioglu, A. Microfluidic CODES: a scalable multiplexed electronic sensor for orthogonal detection of particles in microfluidic channels. Lab Chip. 16 (8), 1350-1357 (2016).
- Buehrer, R. Code Division Multiple Access (CDMA). Synthesis Lectures on Communications. 1 (1), 1-192 (2006).
- Proakis, J. Digital Communications. , McGraw-Hill. New York, NY. (1989).
- Patel, P., Holtzman, J. Analysis of a simple successive interference cancellation scheme in a DS/CDMA system. IEEE J Sel Areas Commun. 12 (5), 796-807 (1994).
- Hui, A., Letaief, K. Successive interference cancellation for multiuser asynchronous DS/CDMA detectors in multipath fading links. IEEE Trans Commun. 46 (3), 384-391 (1998).
- Whittle, P. Prediction and regulation by linear least-square methods. J Macroecon. 7 (1), 126 (1985).
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 335-373 (2001).
- Zhe, J., Jagtiani, A., Dutta, P., Hu, J., Carletta, J. A micromachined high throughput Coulter counter for bioparticle detection and counting. J Micromech Microeng. 17 (2), 304-313 (2007).
- Song, Y., Yang, J., Pan, X., Li, D. High-throughput and sensitive particle counting by a novel microfluidic differential resistive pulse sensor with multidetecting channels and a common reference channel. Electrophoresis. 36 (4), 495-501 (2015).
- Watkins, N., et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. Sci Transl Med. 5 (214), 214ra170 (2013).
- Chen, Y., et al. Portable Coulter counter with vertical through-holes for high-throughput applications. Sensor Actuat B-Chem. 213, 375-381 (2015).
- Jagtiani, A., Carletta, J., Zhe, J. An impedimetric approach for accurate particle sizing using a microfluidic Coulter counter. J Micromech Microeng. 21 (4), 045036 (2011).
- Gold, R. Optimal binary sequences for spread spectrum multiplexing (Corresp). IEEE Trans. Inform. Theory. 13 (4), 619-621 (1967).
- Dinan, E., Jabbari, B. Spreading codes for direct sequence CDMA and wideband CDMA cellular networks. IEEE Commun Mag. 36 (9), 48-54 (1998).
