Summary
Nous démontrons une plate-forme microfluidique avec un réseau d'électrodes de surface intégrée qui combine la détection d'impulsions résistif (SRP) avec la division accès multiple par code (CDMA), pour multiplexer la détection et le dimensionnement des particules en plusieurs canaux microfluidiques.
Abstract
traitement microfluidique d'échantillons biologiques implique généralement des manipulations différentielles de particules en suspension dans le cadre de divers champs de force afin de fractionner spatialement l'échantillon basée sur une propriété biologique d'intérêt. Pour la distribution spatiale résultante à utiliser comme l'indicateur de dosage, des dispositifs microfluidiques sont souvent soumis à une analyse microscopique nécessite une instrumentation complexe, avec un coût plus élevé et une portabilité réduite. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une technologie intégrée de détection électronique pour la détection multiplex de particules à différents emplacements sur une puce microfluidique. Notre technologie, appelée CODES microfluidiques, combine Pulse Resistive Sensing avec Code Division Multiple Access pour compresser 2D information spatiale en un signal électrique 1D. Dans cet article, nous présentons une démonstration pratique de la technologie CODES microfluidique pour détecter et les cellules cancéreuses en culture de taille répartie sur plusieurs canaux microfluidiques. Commevalidé par la microscopie à haute vitesse, notre technologie peut analyser avec précision les populations de cellules denses tout électronique sans la nécessité d'un instrument externe. En tant que tel, les CODES microfluidiques peuvent potentiellement permettre à des appareils à faible coût intégrés lab-on-a-chip qui sont bien adaptés pour l'analyse d'échantillons biologiques au point de soins.
Introduction
Détection précise et l' analyse des particules biologiques tels que des cellules, des bactéries ou des virus en suspension dans un liquide est d' un grand intérêt pour une gamme d'applications 1, 2, 3. Eh bien appariés en taille, des dispositifs microfluidiques offrent des avantages uniques à cet effet tels que haute sensibilité, la manipulation de l' échantillon doux et microenvironnement bien contrôlée 4, 5, 6, 7. En outre, les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour utiliser une combinaison de dynamique des fluides et des champs de force passive pour fractionner une population hétérogène de particules biologiques en fonction de diverses propriétés 8, 9, 10, 11, 12. Dans les dispositifs, la distribution des particules résultant peut être utilisé en tant que lecture, mais l'information spatiale est généralement accessible uniquement par microscopie, ce qui limite l'utilité pratique du dispositif microfluidique en l'attachant à une infrastructure de laboratoire. Par conséquent, un capteur intégré qui peut facilement rapporter la cartographie spatio-temporelle de particules, car ils sont manipulés sur un dispositif microfluidique, peut potentiellement permettre à un faible coût, des dispositifs intégrés de laboratoire sur une puce qui sont particulièrement attrayants pour les essais d'échantillons dans le mobile , les paramètres de ressources limitées.
Des électrodes à couches minces ont été utilisés comme des capteurs intégrés dans des dispositifs microfluidiques pour diverses applications , 13, 14. Pulse Resistive Sensing (RPS) est particulièrement intéressante pour la détection intégrée de petites particules dans les canaux microfluidiques car il offre un mécanisme de détection à haut débit robuste, sensible, et directement à partir de mesures électriques 15. Dans le SRP, la modulation de l'impédance entre une paire d'électrodes immergées dans un électrolyte, est utilisé comme moyen pour détecter une particule. Lorsque la particule passe à travers une ouverture, dimensionnée de l'ordre de la particule, le nombre et l'amplitude des impulsions transitoires dans le courant électrique sont utilisés pour compter et de particules de taille, respectivement. En outre, la géométrie du capteur peut être conçu avec une résolution de photolithographie pour former des formes d' ondes d'impulsions résistives en vue d'améliorer la sensibilité 16, 17, 18, 19 ou d'estimer la position verticale de particules dans des canaux microfluidiques 20.
Nous avons récemment mis en place une technologie de détection d' impulsion résistive multiplexé évolutive et simple appelé microfluidique Coded Orthogonal Détection par détection électrique (CODES microfluidiques) 21. CODES microfluidiques repose sur uneréseau interconnecté de capteurs d'impulsions résistif, chacun consistant en une matrice d'électrodes micro-usinés pour moduler la conduction d'une manière distinguable unique, de manière à permettre le multiplexage. Nous avons spécialement conçu chaque capteur pour produire des signaux électriques orthogonales similaires aux codes numériques utilisés dans la division de code d' accès multiple 22 (CDMA) des réseaux de télécommunication, de sorte que le signal individuel de capteur d'impulsion résistive peut être récupéré uniquement à partir d' une seule forme d' onde de sortie, même si des signaux de différents capteurs interfèrent. De cette façon, notre technologie comprime l'information spatiale 2D de particules en un signal électrique 1D, ce qui permet la surveillance des particules à différents endroits sur une puce microfluidique, tout en gardant à la fois la complexité du périphérique et du niveau du système à un minimum.
Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour les méthodes expérimentales et informatiques nécessaires pour utiliser la technologie CODES microfluidique, ainsi que rrésultats epresentative de son utilisation dans l'analyse d'échantillons biologiques simulés. En utilisant les résultats d'un prototype d'appareil avec quatre capteurs multiplexés comme un exemple pour expliquer la technique, nous fournissons des protocoles sur (1) le processus de microfabrication pour créer des dispositifs microfluidiques avec la technologie microfluidique CODES, (2) la description du dispositif expérimental, y compris la matériels électroniques, optiques et fluidiques, (3) l'algorithme d'ordinateur pour décoder des signaux brouilleurs provenant de différents capteurs, et (4) les résultats de détection et d'analyse des cellules cancéreuses dans des canaux microfluidiques. Nous croyons que l'utilisation du protocole détaillé décrit ici, d'autres chercheurs peuvent appliquer notre technologie pour leur recherche.
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Protocol
1. Conception des électrodes de codage
Remarque: La figure 1a montre la structure 3-D des électrodes microélectrodes.
- Concevoir un ensemble de quatre 7 bits codes d' or pour coder les canaux microfluidiques 23.
- Construire deux registres à décalage de rétroaction linéaires (LFSR), chacun représentant un polynôme primitif.
- Utilisez les LFSR pour générer une paire préférée de 7 bits m séquences contenant.
- Décaler cycliquement la paire préférée de m séquences contenant et les ajouter dans le mod 2 pour générer quatre codes d'or distincts.
- Concevoir l'agencement des électrodes de codage (figure 1b).
- Placez trois bornes d'électrodes, ce qui représente les, négatifs, et des électrodes de référence positives à trois coins.
- Route électrode positive et négative des traces sur les côtés opposés de chaque canal microfluidique.
- Étendre les électrodes positives et négatives dans lades canaux microfluidiques comme les doigts d'électrodes, suivant le code de Gold affectée de façon unique (figure 1c).
- Placer l'électrode de référence entre les doigts d'électrodes positives et négatives.
- Placer des traces d'électrodes positives et négatives les plus extérieures éloignées des doigts d'électrode de référence afin de minimiser la conduction électrique à l'extérieur de la région codante.
2. microfabrication des électrodes de surface
Remarque: La figure 2b montre le procédé de fabrication d'électrodes de surface.
- Nettoyer une plaquette de verre borosilicate de 4 pouces dans une solution de piranha (acide sulfurique à 98%: 30% de peroxyde d'hydrogène = 5: 1) à 120 ° C pendant 20 min pour éliminer tous les contaminants organiques. Ensuite, placer la plaquette sur une plaque chaude à 200 ° C pendant 20 min pour éliminer l'eau résiduelle.
- Transférer la plaquette à un spinner. Distribuer 2 ml photorésist négatif sur la plaquette et tourner la plaquette à une vitesse de 3000 tours par minute pendant 40 s à revêtir uniformément la plaquette d'une couche de résine photosensible de 1,5 um.
- Placez la plaquette sur une plaque chaude à 150 ° C et cuire la résine photosensible filé pendant 1 min.
- Exposer la résine photosensible à 365 nm lumière UV (225 mJ / cm 2) à travers un masque de chrome en utilisant un aligneur de masque.
- Placez la plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C et cuire la résine photosensible exposée pendant 1 min.
- Développer la résine photosensible en plongeant la plaquette dans un révélateur de résine photosensible (RD6) pendant 15 s. pulvérisez doucement (DI) de l'eau déminéralisée et laver la plaquette. Sec par soufflage d'azote comprimé.
- Placer la plaquette en résine photosensible à motifs dans un évaporateur métallique par faisceau d' électrons, et déposer une couche de chrome de 20 nm d'épaisseur, suivi d'un film d'or de 80 nm d'épaisseur sur la plaquette à une pression de base de 3 × 10 -6 Torr avec un taux de dépôt de 1 Å / s.
- Immerger la tranche dans l'acétone revêtue de métal dans un ensemble de bain à ultrasons à une fréquence de 40 kHz avec 100% d'amplitude pendant 30 min à la chambre humeurature pour graver la résine photosensible sous-jacente et terminer le processus de décollage.
- Couper la tranche en petits morceaux à l'aide d'une scie à découpage classique.
3. La fabrication du moule SU-8 pour les canaux microfluidiques
Remarque: La figure 2a montre le procédé de fabrication du moule pour les canaux micro - fluidiques.
- Nettoyer et cuire au four une plaquette de silicium de 4 pouces en utilisant la même procédure décrite au point 2.1.
- Transférer la plaquette à un spinner. Verser 4 mL résine photosensible sur la tranche. Enduire la plaquette avec résine photosensible.
- Faites tourner la plaquette à 500 rpm pendant 15 s.
- Faites tourner la plaquette à 1000 rpm pendant 15 s.
- Faites tourner la plaquette à 3000 rpm pendant 60 s pour obtenir une couche uniforme revêtu de résine photosensible épaisse de 15 um.
- Placez la face du wafer sur un cleanroom essuyez imbibé d'acétone et enlever la résine photosensible résiduelle de l'arrière et des bords de la plaquette.
- Transférer la plaquette sur un pl chaudmangé pour la cuisson douce. Tout d'abord, faire cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min. Puis déplacer rapidement la plaquette à une plaque chauffante à 95 ° et cuire pendant 2 min.
- Exposer la résine photosensible à 365 nm de la lumière UV (180 mJ / cm2) à travers un masque de chrome en utilisant un aligneur de masque.
- Cuire la plaquette après exposition à 65 ° C pendant 1 min, puis à 95 ° C pendant 2 min.
- Immerger la plaquette dans le révélateur et agiter doucement le récipient pendant 3 min. Ensuite, rincer la tranche avec de l'alcool de l'isopropanol (IPA) et le sécher en soufflant de l'azote comprimé. Si un résidu de couleur blanche apparaît sur la tranche, le plonger dans le révélateur à nouveau et de développer pour plus de temps et sec.
- Cuire la galette sur une plaque chaude à 200 ° C pendant 30 minutes pour sécher complètement.
- Mesurer l'épaisseur de la résine photosensible à motif à l'aide d'un profilomètre à différents endroits à travers la plaquette pour assurer l'uniformité.
- Silaniser la plaque de moule en utilisant la technique de dépôt en phase vapeur. Ajouter 200 pi de trichlorosilane dans une boîte de Pétri et les placer dans un dessiccateur à vide ainsi que le moule plaquette SU-8 pour 8 h.
4. Assemblée de l'CODES microfluidique Dispositif
- Placez la tranche de silicium de 4 pouces avec le moule dans un diamètre boîte de Pétri de 150 mm, et le fixer en collant à partir de ses bords.
- Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) de pré-polymère et un agent de reticulation à un rapport de 10: 1, et 50 g de verser le mélange dans la boîte de Petri. Placer la boîte de Petri dans un dessicateur sous vide pour dégazer le mélange pendant 1 h, puis durcir dans un four à 65 ° C pendant au moins 4 h (figure 2A).
- Découpez la couche de PDMS durcie à l'aide d'un scalpel et le retirer de la tranche de moule à l'aide d'une pincette. La taille du dispositif de validation de principe est d'environ 20 mm x 7 mm. Puis percer des trous d'un diamètre de 1,5 mm à travers le PDMS pour l'entrée et la sortie du canal microfluidique en utilisant un poinçon de biopsie.
- Nettoyer le côté à motif de la partie PDMS en plaçant it sur un ruban adhésif-salle blanche.
- Nettoyer le substrat en verre avec des électrodes de surface en le rinçant avec de l'acétone, l'IPA, l'eau déminéralisée et séchage en utilisant de l'azote comprimé.
- Activer les surfaces des PDMS et le substrat de verre dans un plasma d'oxygène pendant 30 secondes avec le côté micro-usinage de chaque partie dirigée vers le haut dans un générateur de plasma radiofréquence fixée à 100 mW.
- Aligner le canal microfluidique PDMS avec des électrodes de surface sur le substrat en verre à l'aide d'un microscope optique et ensuite amener les deux surfaces de plasma activées en contact physique.
- Cuire le dispositif sur une plaque chaude à 70 ° C pendant 5 min, avec le côté de verre face à la plaque chauffante.
- Connecter les coussinets des électrodes avec des fils de contact par soudure.
5. Préparation de l'échantillon biologique Simulé
- La culture des cellules cancéreuses ovariennes humaines HeyA8 dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° Cjusqu'à ce qu'ils atteignent 80% de confluence.
- Aspirer le support du flacon de culture à l'aide d'une pipette en verre. Distribuer, puis une solution saline phosphate aspirée 1x tamponnée (PBS) pour laver les cellules.
- Incuber les cellules dans 2 ml de 0,05% (p / v) d'une solution de trypsine pendant 2 min à 37 ° C, la suspension des cellules adhérentes. Ensuite, ajouter 4 ml de milieux de culture pour neutraliser la trypsine.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 100 x g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules dans un tube à essai. Ensuite, aspirer le surnageant complètement.
- Re-suspendre les cellules dans 1-2 ml 1x PBS par pipetage doucement monter et descendre à amas de cellules mécaniquement se dissocient.
- Dessinez une petite quantité de suspension cellulaire dans une pipette et compter le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre.
- Diluer la suspension de cellules avec du PBS pour préparer un échantillon avec une concentration cellulaire finale de 10 5 -10 6 cellules / mL.
6. Exécution du CODES microfluidique périphérique
Note: Figurer 3 montre le montage expérimental.
- Placez l'appareil CODES microfluidique sur la scène d'un microscope optique.
- Appliquer une 400 kHz onde sinusoïdale à l'électrode de référence sur la puce en utilisant un générateur de fonction électronique.
- Connecter des électrodes de détection positive et négative à deux amplificateurs de trans-impédance indépendants pour convertir les signaux de courant de chacun des signaux de tension.
- Soustraire le signal de tension d'électrode de détection positive du signal de tension d'électrode de détection négative en utilisant un amplificateur de tension différentielle afin d'obtenir un signal bipolaire.
- Utilisez une caméra à grande vitesse pour le fonctionnement d'enregistrement optique de l'appareil à des fins de validation et de caractérisation.
- Conduisez la suspension cellulaire à travers le dispositif CODES microfluidiques à un débit constant (50-1000 ul / h) en utilisant une pompe à seringue.
- Mesurer le signal d'impédance de modulation en utilisant un amplificateur lock-in.
- Connectez le signal alternatif de référence à l'arbitreérence entrée de l'amplificateur de verrouillage. Connecter le signal bipolaire différentiel à l'amplificateur de verrouillage en tant que signal d'entrée.
- Obtenir l'amplitude quadratique moyenne du signal différentiel à partir de la sortie de l'amplificateur lock-in.
- Échantillonner le signal de sortie de l'amplificateur lock-in à 1 taux de MHz sur un ordinateur via une carte d'acquisition de données pour une analyse ultérieure.
7. Traitement des signaux du capteur
- Transfert des données électriques enregistrées dans MATLAB pour le post-traitement et de décodage.
- Filtrer le signal enregistré dans le domaine numérique en utilisant un filtre Butterworth (fonction intégrée dans MATLAB) pour éliminer le bruit haute fréquence (> 2,5 kHz).
- Générer une bibliothèque de code de modèle à partir des signaux de capteurs.
- Identifier les signaux de code ne se chevauchent pas représentatifs correspondant à chaque capteur dans le dispositif et extraire ces blocs de signal à partir du jeu de données en tant que vecteurs de forme d'onde distinctes.
- Normaliser chaque code onde template vecteurpar sa puissance. Utilisez le MATLAB fonction intégrée (bandpower) pour mesurer la puissance du signal.
- Utilisez la fonction MATLAB (resample) pour développer la bibliothèque de modèles en créant numériquement versions de signaux de code normalisées avec des durées variables pour tenir compte des variations de la vitesse d'écoulement de la cellule sur les électrodes.
- Identifier les blocs de signaux qui correspondent à capteur d'activité (seuil de SNR> 12 dB) dans la forme d'onde filtrée. Waveform avec SNR sous le seuil serait traité comme du bruit.
- Décode des blocs individuels de l' activité du capteur dans le signal enregistré en utilisant un algorithme itératif basé sur l'annulation d' interférences successives, une technique couramment utilisée dans les réseaux de communication CDMA multi-utilisateur 24, 25.
- Calculer la corrélation croisée de chaque bloc de signal avec tous les modèles de la bibliothèque en utilisant le produit scalaire de glissement.
- Identifier le modèle qui produit le largis pic d'auto-corrélation pour déterminer le signal de code individuel dominant du capteur. Enregistrer le temps et de l'amplitude du pic d'auto-corrélation.
- Construire un signal de code de capteur d'estimation par mise à l'échelle du modèle de code identifié sur la base mesurée autocorrélation amplitude crête et des informations de synchronisation (déterminée à l'étape 7.5.2).
- Soustraire le signal estimé de code de détection à partir des données d'origine.
- Itérer le procédé de 7.5.1, jusqu'à ce que le signal résiduel ne ressemble à aucun signal dans la bibliothèque de gabarits, mathématiquement défini comme le coefficient de corrélation est inférieur à 0,5.
- Affiner initiales estimations de signal du capteur de l'étape 7.5 en utilisant un processus d'optimisation.
- Reconstruire le signal en ajoutant des signaux de capteurs individuels estimés à partir de chaque itération.
- Balayer l'amplitude, la durée et le moment des signaux individuels de capteurs autour des estimations initiales pour produire le meilleur ajustement avec le signal électrique enregistrésur la base des moindres carrés Approximation 26.
- Convertir les amplitudes des signaux de capteurs estimés en taille de la cellule par l'étalonnage des signaux électriques contre des images optiques.
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Representative Results
Dispositif microfluidique CODES constitué de quatre capteurs répartis sur quatre canaux microfluidiques est représenté sur la figure 1b. Dans ce système, la section transversale de chaque canal microfluidique a été conçu pour être proche de la taille d'une cellule de telle sorte que (1) plusieurs cellules ne peuvent pas passer au-dessus des électrodes en parallèle et (2) les cellules restent proches des électrodes augmentant la sensibilité . Chaque capteur est conçu pour générer un 7 bits de code numérique unique. Le dispositif a ensuite été testé en utilisant une suspension cellulaire. Les signaux électriques enregistrés correspondant à quatre capteurs individuels sont représentés par des codes numériques idéale associée à la figure 4. signaux enregistrés correspondent étroitement avec les impulsions carrées idéales, tandis que les petits écarts existent. Ces écarts résultent d'une combinaison de plusieurs facteurs, y compris le champ électrique non uniforme entre les électrodes coplanaires, le couplage entre les différentes paires d'électrodes, la forme sphérique deles cellules, ainsi que la vitesse d'écoulement constante des cellules dans des canaux microfluidiques. Nous avons créé une bibliothèque de gabarits sur la base des signaux de capteur recodées. En mettant en corrélation les signaux enregistrés avec tous les modèles de la bibliothèque, nous avons établi un modèle qui a produit le pic maximal d' auto-corrélation (figure 4). Étant donné que les codes numériques pour les canaux microfluidiques sont conçus pour être orthogonaux entre eux, un pic d'auto-corrélation dominant pourrait être solidement identifié dans ce processus. En utilisant cette approche, on peut déterminer par calcul le canal microfluidique de la cellule passe à travers, la durée du signal du capteur, et donc la vitesse d'écoulement de la cellule.
La technologie CODES microfluidique peut résoudre des situations où plusieurs cellules interagissent simultanément avec des électrodes de codage. Lorsque ces chevauchements se produisent, les signaux provenant des capteurs individuels interfèrent et de la forme d'onde résultante ne peut pas être aisément associées à unmodèle unique correspondant à un capteur spécifique. décoder avec précision ces signaux se chevauchent est particulièrement important pour le traitement fiable des échantillons à haute densité, où les interférences sont plus susceptibles de se produire. Pour résoudre chevauchement des événements, nous avons développé un algorithme itératif basé sur une annulation d' interférence successive (SIC) schéma 24, 25, qui est généralement utilisé pour la détection multi-utilisateurs dans les réseaux de communication CDMA. La figure 5 montre comment l'algorithme SIC est mis en œuvre dans la résolution d' une forme d' onde qui a résulté de quatre cellules qui se chevauchent dans quatre canaux microfluidiques différents. Dans chaque itération, nous avons d' abord déterminé le pic d' auto-corrélation dominante (figure 5a, 2e colonne), correspondant au signal d' interférence la plus forte, en corrélant la forme d' onde d'entrée (figure 5a, 1 ère colonne) avec la bibliothèque de modèles. Basé sur le modèle sélectionné et til résultante d' auto-corrélation d' amplitude, nous avons estimé alors le plus fort signal d' interférence (figure 5a, 3 e colonne) et soustrait à partir de la forme d' onde d'entrée. La forme d'onde restant a été transmis à la prochaine itération comme entrée. Ce processus a continué jusqu'à ce que la corrélation du signal résiduel avec la bibliothèque de modèles n'a pas produit un pic clair d' auto-corrélation (figure 5a, 5 ème ligne, 2 ème parcelle). Suite à la fin du processus d'annulation d'interférence, on reconstruit une estimation de la forme d' onde en combinant tous les signaux estimés à partir de chaque itération (figure 6a). L' utilisation d' un processus d'optimisation basée sur une meilleure approximation moins à minimiser l'erreur quadratique moyenne entre la forme d' onde d' origine et le signal reconstruit, nous avons actualisé nos estimations pour l'amplitude, la durée et le calendrier relatif des signaux de code de détection individuels (Figure 6b). Nous avons également estimé la taille deles cellules détectée sur la base de l'amplitude des signaux de capteur individuels estimés. Pour ce faire , nous avons calibré les amplitudes des signaux électriques avec des tailles de cellule optiquement mesurées en utilisant la régression linéaire (Figure 6b). Une comparaison de nos résultats des CODES microfluidiques avec les informations obtenues à partir des images de microscope à haute vitesse enregistrées simultanément montre que la taille des cellules et la vitesse peuvent être mesurés avec précision, ce qui valide nos résultats (tableau 1). Figure 6c montre l'image de microscopie à haute vitesse enregistrée simultanément utilisée pour valider le résultat de décodage.
Pour démontrer la reproductibilité de nos résultats ainsi que la performance de la technologie CODES microfluidique pour un traitement des échantillons à haut débit, nous avons analysé les signaux électriques correspondant à> 1000 cellules. Les signaux ont été automatiquement décodés dans MATLAB en exécutant l'algorithme expliquéci-dessus et la précision de nos résultats a été évaluée en comparant directement nos résultats avec des données optiques provenant enregistrées simultanément la vidéo à haute vitesse. Notre analyse indique que des signaux électriques à partir de 96,15% des cellules (973/1012) ont été décodés avec précision. Le taux de réussite pour décoder des signaux cellulaires ne se chevauchent pas et qui se chevauchent est 98,71% (688/697) et 90,48% (285/315), respectivement.
Figure 1. Conception du dispositif CODES microfluidiques à quatre canaux. (A) Des électrodes dans chaque canal microfluidique sont microélectrodes pour générer un code numérique unique. L'impédance modulation due à des interactions séquentielles de cellules circulant avec des paires d'électrodes conduit à impulsions électriques. (B) Une image au microscope de l'appareil CODES microfluidique. Au cours du processus de fabrication, le substrat en verre avec codage des électrodes de surface est alignée avec des canaux microfluidiques PDMS sous un microscope. (C) Un gros plan sur l' image d'électrodes de surface codées produisant 7 bits des séquences d' or: "1010110", "0111111", "0100010", "0011000". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Processus de microfabrication. (A) Les canaux microfluidiques PDMS sont fabriqués en utilisant la lithographie douce 27. (B) les électrodes de surface sont fabriqués en utilisant un procédé de lift-off. (C) une vue schématique en coupe transversale du dispositif final. PDMS canaux microfluidiques sont alignées et collées sur le substrat en verre avec des électrodes de surface. jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Montage expérimental. En utilisant une pompe à seringue, la suspension cellulaire est exécutée à travers le dispositif CODES microfluidiques à un débit constant. Un signal de courant alternatif de 400 kHz est appliqué à l'électrode de référence en utilisant un générateur de fonction. les signaux de courant provenant des électrodes de détection positive et négative sont d'abord convertis en signaux de tension à l'aide de deux amplificateurs de transimpédance et soustraites les unes des autres au moyen d'un amplificateur différentiel. Le signal bipolaire différentiel est extrait par un amplificateur de verrouillage, et ensuite échantillonné dans un ordinateur pour le traitement du signal et de décodage. la microscopie optique à haute vitesse est utilisé pour le fonctionnement d'enregistrement optique de l'appareil à des fins de validation et de caractérisation.e.jove.com/files/ftp_upload/55311/55311fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. signaux électriques enregistrés par des capteurs individuels et leurs corrélations. les signaux enregistrés et leur corrélation avec l'autre sont données pour quatre capteurs d'impulsions résistive codes multiplexés. Le capteur 1 (a), le capteur 2 (b), le capteur 3 (c) et le capteur 4 (d) ont été conçus pour produire des signaux numériques sur 7 bits "1010110", "0111111", "0100010", et "0011000", respectivement , . Pour chaque capteur, la figure du haut montre que le signal normalisé enregistré de chaque capteur correspond étroitement avec la séquence d'impulsions carré idéal que le capteur a été conçu pour produire. Pour chaque capteur, le panneau inférieur représente le signal de capteur enregistré9; s autocorrélation et de corrélation croisée avec les signaux correspondant aux trois autres capteurs de code en multiplex dans le réseau. Dans tous les cas, un pic d'auto-corrélation peut être identifié de manière robuste parce que les codes numériques à partir des capteurs individuels sont conçus pour être orthogonaux entre eux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Décodage une forme d'onde de chevauchement avec des interférences successives cancelation. A chaque itération, la forme d' onde d'entrée (1 ère colonne) est en corrélation avec la bibliothèque de modèles pré - assemblée pour identifier le modèle spécifique qui résulte de l'amplitude de corrélation maximale (2 e colonne). L'utilisation de ce modèle spécifique, le signal brouilleur plus fort est estimée en fonction de l'amplitudeet des informations de synchronisation à partir du pic de corrélation (3 ème colonne). Le signal estimé est ensuite soustrait de la forme d'onde originale, annulant ainsi efficacement l'interférence la plus forte en raison de la plus grande cellule. Le processus est répété jusqu'à ce qu'aucun pic de corrélation peut être déterminée ( par exemple, le coefficient de corrélation <0,5) dans le signal résiduel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 6. Le décodage de l' analyse des résultats. (A) des signaux estimés sont raffinés basés sur un algorithme d'optimisation qui vise à obtenir le meilleur ajustement entre la reconstitution et la forme d' onde originale enregistrée en utilisant l'approximation des moindres carrés. (B) À la fin du processus d'optimisation,la synchronisation et l'amplitude des signaux calibrés reflètent avec précision les paramètres de cellules mesurés par microscopie à haute vitesse. (C) l' image enregistrée simultanément à haute vitesse microscopie valide nos résultats à partir de mesures électriques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Type de mesure | r ch1 (um) | r ch2 (pm) | r CH3 (pm) | r ch4 (um) | At 1 (ms) | At 2 (ms) | At 3 (ms) |
| Électrique | 8.010 | 6.490 | 5.300 | 6.550 | 0,465 | 1.705 | 0,744 |
| Optique | 8.320 | 6.770 | 5.680 | 7.040 | 0,375 | 1.625 | 0,750 |
Tableau 1. Comparaison des paramètres de cellule électriquement et optiquement mesurées de la figure 6b. Pour valider nos estimations, nous optiquement mesuré les tailles de cellules de l'image de microscopie à haute vitesse. synchronisation relative entre différentes cellules est optiquement mesurée à partir du nombre d'images entre les cellules de la vidéo haute vitesse enregistrée à 8000 images par seconde.
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Discussion
Plusieurs capteurs d'impulsions résistives ont déjà été incorporés dans les puces microfluidiques 28, 29, 30, 31, 32. Dans ces systèmes, des capteurs d'impulsions résistives ont été soit non multiplexées 28, 29, 30, 31 ou bien ils doivent capteurs individuels pour être entraînés à des fréquences différentes 32. Dans les deux cas, les connexions externes dédiées sont nécessaires pour chaque capteur résistif d'impulsion sur la puce et donc un grand nombre de capteurs ne peuvent être intégrés sans grande complexité matérielle. L'avantage important CODES microfluidiques est qu'il permet la lecture simultanée de plusieurs capteurs d'impulsions résistif à partir d'une sortie unique dans un dispositif simple. Nous y parvenons en utilisant mtechniques ultiplexing couramment utilisés dans les télécommunications à concevoir des capteurs micro-usinés d'impulsion résistive intégrés dans des dispositifs microfluidiques. Essentiellement, notre technologie repose sur le code-multiplexage d'un réseau de compteurs de Coulter sur puce en concevant chacun pour produire un signal distinguable lorsqu'une particule est détectée. Chaque capteur micro-usiné dans le réseau se compose de plusieurs électrodes de surface coplanaire ordonnées dans différentes configurations telles que l'interaction séquentielle de particules circulant à ces électrodes produit des modulations d'impédance orthogonales formes d'onde. Pour accueillir asynchrone interaction particule-capteur, nous avons spécifiquement conçu chaque capteur pour produire des codes d'or 33, codes numériques pseudo-orthogonal qui sont généralement utilisés dans la liaison montante des réseaux de télécommunication CDMA. Codes d'or maintenir un certain niveau de orthogonalité même quand ils ne sont pas alignés avec les différences de phase aléatoire 34.
MiCODES crofluidic est facilement extensible. Bien que nous avons présenté les résultats d'un microfluidique dispositif CODES prototype avec quatre capteurs dans le présent document, plusieurs capteurs peuvent être incorporés dans l'appareil lorsqu'il est conçu pour produire des signaux de sortie distinguables du reste. Une façon d'élargir le réseau de capteurs est de concevoir des capteurs basés sur de plus grands ensembles de codes orthogonaux avec des codes numériques plus. Longer codes orthogonaux avec plus de bits fournissent un gain de traitement plus élevé dans le décodage et peuvent être distingués les uns des autres quand il y a des interférences. D'autre part, les codes plus d'or dans le dispositif signifie également volume de détection plus grande, ce qui augmente le nombre attendu de capteurs interférents. De même, l'augmentation du nombre de capteurs pour une densité donnée d'échantillon va conduire à davantage de particules qui se chevauchent en raison d'une augmentation du volume global de détection. Par conséquent, la densité des particules dans l'échantillon est un paramètre critique qui doit être pris en considération dans l'utilisation de la technologie CODES microfluidique. La p maximalela densité de l'article qui peut être résolue (par analogie avec la capacité de canal d'un réseau de télécommunication CDMA) dépend de plusieurs facteurs tels que les signaux individuels des capteurs ainsi que leur relation avec le schéma de décodage, l'agencement du dispositif microfluidique, et le niveau de bruit électronique. Selon l'application, l'échantillon peut être dilué pour atteindre une densité de particules qui produit un taux d'erreur acceptable.
De signal de perspective de traitement, le décodage de signaux de temps à partir d'un dispositif de CODES microfluidique est pas de calculs en utilisant les systèmes actuels comme en témoigne le fait que les communications de téléphone cellulaire sur un réseau CDMA peuvent être démultiplexées en temps réel. En outre, les événements physiques à décoder dans des dispositifs microfluidiques se produisent beaucoup plus lent que la vitesse de transmission de bits dans les communications de téléphone cellulaire nous permettant d'utiliser plus avancé et de temps des algorithmes tels que SIC et un processus d'optimisation, que nous utilisons pour résoudre itérativement chevauchement signaux provenant des capteurs.
Pris ensemble, CODES microfluidiques est, une technologie électronique évolutive polyvalente de détection qui peut être facilement intégré dans divers dispositifs microfluidiques pour réaliser des analyses quantitatives par le suivi des particules lorsqu'elles sont traitées sur la puce. La technologie est très facile à mettre en œuvre, parce que (1) il est très simple à partir d'un point de vue matériel (2), il est directement compatible avec le lithographie douce (3) il fournit une électronique lecture directe sans aucun composant actif sur puce, et (4) elle repose sur des algorithmes de calcul simples pour le traitement du signal et de l'interprétation des données.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 98% Sulfuric Acid | BDH Chemicals | BDH3074-3.8LP | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BDH Chemicals | BDH7690-3 | |
| Trichlorosilane | Aldrich Chemistry | 235725-100G | |
| NR9-1500PY Negative Photoresist | Furuttex | ||
| Resist Developer RD6 | Furuttex | ||
| Acetone | BDH Chemicals | BDH1101-4LP | |
| SU-8 2015 Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y010200 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| Isopropyl Alcohol | BDH Chemicals | BDH1133-4LP | |
| RPMI 1640 | Corning Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Amresco | K952-100ML | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CM | |
| PHD 22/2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2001 | |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instrument | ||
| HF2TA Current Amplifier | Zurich Instrument | ||
| Eclipse Ti-U Microscope | Nikon Corporation | ||
| DS-Fi2 High-Definition Color Camera | Nikon Corporation | ||
| v7.3 High-speed Camera | Phantom | ||
| PCIe-6361 Data Acquisition Board | National Instruments | 781050-01 | |
| BNC-2120 Shielded Connector Block | National Instruments | 777960-01 | |
| PX-250 Plasma Treatment System | Nordson MARCH |
References
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