Introduction
La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l'identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione 1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 primasi-elicasi, e la proteina legante il DNA a singolo filamento, GP2. 5) 2. Questa caratteristica lo rende un sistema interessante modello per studiare i meccanismi conservati biochimici coinvolti nella replicazione del DNA.
Particolare enfasi è posta sulla formazione di primer ribonucleotide da T7 DNA primasi, una critical passo per l'inizio della sintesi del DNA. Inoltre, si può anche esaminare l'utilizzo di questi primer di polimerasi T7 DNA o altre proteine di replica includendoli nella miscela di reazione. Il T7 primasi-elicasi, GP4, catalizza la formazione di primer per la sintesi del DNA a specifiche sequenze di DNA chiamati siti di riconoscimento primasi, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina nel PRS è criptico, è essenziale per il riconoscimento del sito, ma non viene copiato nel prodotto 3. Il primo passo nella sintesi di primer da gp4 comporta la formazione del dinucleotide pppAC, che viene poi estesi ad un trimero, ed eventualmente primers tetranucleotide funzionali pppACCC, pppACCA o pppACAC seconda della sequenza nel modello 4. Questi primer possono essere utilizzati da polimerasi T7 DNA per iniziare la sintesi di DNA, che è anche un processo gp4 assistito 5, 6. A questo proposito, il primasidominio stabilizza i brevissimi tetraribonucleotides con il modello, impedendo loro di dissociazione, si impegna DNA polimerasi in maniera atta a garantire il primer / modello nel polimerasi sito attivo 7. Questi passaggi (RNA sintesi di primer, primer per handoff polimerasi, ed estensione) si ripetono in cicli multipli di replicare il filamento in ritardo e devono essere coordinati con la replicazione del filamento principale.
I saggi descritti qui sono altamente sensibili e possono essere eseguite in tempi moderata. Tuttavia, essi sono relativamente bassi-throughput e grande cura deve essere esercitata in uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi. A seconda della velocità con cui la reazione procede, si potrebbe impiegare uno strumento rapido raffreddamento per ottenere campioni su scale temporali suscettibili per un'analisi significativa degli insegnamenti tempo di reazione sia stazionario o lo stato pre-stazionario. Recentemente, abbiamo usato saggi descritti qui per fornire evidence dell'importanza del rilascio primer dominio primasi del gp4 nell'avvio di frammenti di Okazaki. Inoltre, abbiamo trovato prove di un ruolo di regolamentazione per il T7 DNA a singolo filamento di proteine, gp2.5 vincolante, nel promuovere la formazione di primer efficiente e l'utilizzo 8.
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Protocol
NOTA: Seguire tutte le normative istituzionali per quanto riguarda l'uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo, incluso ma non limitato a, l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, e scudi acrilico appropriate.
NOTA: Il buffer standard consiste di 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM di potassio glutammato, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (questo buffer viene pre-fatta ad una concentrazione 5x) e 0,3 mM di ogni dNTP. Proteine replica T7 sono purificati come descritto 8, 9, 10. DNA a singolo filamento contenente un singolo sito di riconoscimento T7 primasi (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') possono essere acquistati da una varietà di aziende sintesi del DNA (la lunghezza il ssDNA può dipendere l'enzima di scelta, per T7 primasi, un pentamero è la lunghezza minima template per sintetizzare un primer integrale 11, come il criptico C è essenziale, tuttavia, se il primer deve essere prorogato di polimerasi, nucleotidi aggiuntivo deve essere presente alla fine del 3 'del modello. Le reazioni vengono avviate mediante aggiunta di una concentrazione finale di 10 mM MgCl 2 e incubate a 25 ° C. Campionamento manuale funziona bene per time-punti pari o superiore a 5 secondi. Se sono necessari punti temporali più brevi di questo, si consiglia di utilizzare uno strumento di flusso rapido tempra per ottenere dati precisi.
1. Multiple-fatturato Primer Sintesi Reaction di campionamento manuale
- Prima di iniziare l'esperimento, un'aliquota 2 ml di tampone dye formamide (93% (v / v) formammide, 50 mM EDTA, 0,01% xilene cianolo e 0,01% blu di bromofenolo) in 8 1.5 mL tubi di polipropilene. In generale, il numero di tubi è uguale al numero di punti temporali analizzati.
- Preparare una miscela costituita da 20 l 1x tampone, 0,1 mM ATP e CTP, 0,25 mCi / mL [α- 32 P] CTP, 0.1 micron SSDmodello di NA, e 0,1 micron GP4 (espressa come concentrazione esamero - 0,6 micron monomero).
- Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
- Rimuovere 2 ml della miscela utilizzando una pipetta e mescolare con 2 ml di buffer colorante formammide in una provetta da 1,5 ml preparata al punto 1.1 per il controllo nessuna reazione (tempo zero).
- Aggiungere 2 ml di 0,1 M MgCl 2 di miscela di reazione (ad una concentrazione finale di 10 mM).
- prelevare manualmente 2 campioni ml di miscele di reazione utilizzando una pipetta ad intervalli di 10 s e mescolare con la tintura formammide dosata in provette da 1,5 ml preparata al punto 1.1.
- campioni di calore a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore.
- Caricare aliquote di campioni su un gel denaturante. I piccoli prodotti di primer tetraribonucleotide sintetizzati dal primasi T7 sono risolti bene su un 0,4 mm di spessore 25% acrilammide: bisacrylamide (19: 1), 3 M urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
- Mettere tutto il gel sulla crcarta PHY e coprire con pellicola trasparente. gel secco utilizzando un essiccatore gel.
- Preparare una serie di diluizioni del resto della miscela di reazione e macchiare lo stesso volume caricati sul gel cromatografia su carta, cioè, individuare 4 ml della diluizione se 4 ml di campione sono stati caricati.
NOTA: Questo servirà come la curva standard per determinare la concentrazione dei prodotti formati durante la reazione. Ad esempio, cinque diluizioni utilizzando tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funzionano bene, coprono una gamma 1:25 a 1: 15.625 (5 2 -5 6), ma le diluizioni dovrebbero essere regolato a seconda del livello di attività. - Esporre gel secco e standard utilizzando uno schermo phosphorimager. Quantificare la radioattività nella serie di diluizioni e costruire una curva standard come descritto 8, 12
NOTA: L'inclusione di T7 DNA polimerasi alla miscela di reazione consente di Exala mia l'uso di primer tetraribonucleotide da questo enzima. In modo ottimale, la concentrazione polimerasi va saturando per semplificare l'interpretazione dei dati. Una concentrazione polimerasi di 0,4 micron o superiore dà buoni risultati. Inoltre, l'effetto di altri proteine, come legame al DNA a singolo filamento di proteine, su entrambi sintesi primer o ritardo-strand iniziazione può essere esaminato in questo modo.
2. Multiple-fatturato Primer Sintesi di reazione con uno strumento Rapid-tempra
- Preparazione di miscele di reazione
- Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 0,2 micron GP4 esamero, 0,2 um modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 0,2 mM ATP e CTP (compresi 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP.
- Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2.
- Il funzionamento dello strumento flusso rapido tempra
- Accendere rapstrumento flusso id-tempra; dopo la visualizzazione del menu principale, 7 sulla tastiera dello strumento per spostare la siringa temporizzata alla posizione iniziale.
- posizione siringa aperta buffer "LOAD".
- Siringhe Caricamento tampone
- Allegare una contenente tampone 10 ml siringa alla porta dell'unità siringa. Cambiare posizione della manopola siringa per "LOAD".
- Utilizzando 10 siringhe ml, riempire tampone strumento serbatoio A e B con 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA e riempire la siringa C con soluzione di raffreddamento (250 mM EDTA e 0,2% SDS). Rimuovere le bolle d'aria spingendo pistoni dentro e fuori.
- posizioni Modifica manopola su "FIRE". Tipo 2 per regolare la posizione della barra siringa temporizzata. Premere il tasto "REGOLAZIONE DOWN" per abbassare la siringa fino a tampone viene fuori il loop di uscita: (7-va giù continuamente; 8-grande passo verso il basso; 9-piccole passo verso il basso). Tipo "ESC" per tornare al menu principale.
- tubi Wash
- Attlinea di uscita ach al vuoto. Modificare le manopole di esempio a "filo". Vicino tampone siringa impostando le manopole in posizione orizzontale. Accendere vuoto e immergere le anse a filo 2 in H 2 O per 10 s, poi immergere in MeOH per 10 s. loop Dry aspirando aria per ~ 15 s, o fino a secco.
- Caricamento campioni
- Cambiare posizione della manopola di esempio per "LOAD". Mettere la soluzione A alla siringa da 1 ml. Inserire la siringa in una delle porte di carico campione. Ripetere l'operazione per la soluzione B, e posto in fronte al porto di carico del campione.
- Raccolta dei termini di punti
- Nel menu principale, digitare 1 per eseguire tempra-flow. Inserire tempo di reazione (s) e premere il tasto "ENTER". verranno visualizzati il numero ciclo reazione da usare. Passare a ciclo reazione desiderata. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4.
- Girare le manopole di esempio per "caricare". reazione del carico mescola in loop del campione fino alle porte del vano di miscelazione centrale. Girare tutte le manopole a "FIRE ". Verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta.
- Mettere 1,5 ml di tubo sulla fine del ciclo di uscita. Premere il tasto "Go" per avviare la reazione. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. Ricarica siringhe tampone A e B fino a colpire il conducente.
- Ripetere i passaggi 2.2.6.2-2.2.6.3 per ogni punto di tempo desiderato. Eccezione: Non caricare soluzione contenente il reagente di partenza (cioè, MgCl 2 in questo caso) quando tempra il controllo del tempo-zero.
- Al termine la raccolta di campioni, immettere "ESC" per tornare al menu principale. Premere il tasto "7" per tornare conducente tampone siringa alla sua posizione iniziale.
- Strumento clean-up
- Rimuovere reazione siringhe miscela. Ruotare la manopola di carico campione in posizione "LOAD". Sotto vuoto, lavare ogni ciclo campione con 10 mL di 0,2 N NaOH, seguito da 10 mL 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL di MeOH.
- Girare le manopole siringa in posizione "LOAD". Premere verso il basso tutti i 3 syrpistoni Inge per recuperare i buffer di reazione e di tempra. Lavare siringhe con 5 mL H 2 O almeno due volte.
- Riempire le siringhe di nuovo con 5 ml di H 2 O e girare le manopole in posizione "FIRE". Cambiare posizioni della manopola e accendere vuoto per rimuovere H 2 O. filo come al punto 2.2.4. Spegnere strumento.
Nota: i prodotti vengono analizzati come descritto nei passaggi 1.7-1.12. Inoltre, polimerasi T7 DNA e altre proteine replica possono essere aggiunti nella miscela di reazione per analizzare il loro effetto sulla sintesi primer o estensione.
3. Single-fatturato Primer Sintesi di reazione
NOTA: Single-fatturato test di primer sintesi / estensione vengono effettuate in modo simile a reazioni multiple di fatturato, con alcune importanti differenze: questi test seguono la conversione del radiomarcato ATP in primer o di estensione prodotti, tuttavia la concentrazione di substrati e proteine sono consideBly più alto. Inoltre, per raggiungere risoluzione millisecondo per consentire l'analisi della reazione di sintesi di primer, si deve utilizzare una macchina flusso rapido raffreddamento.
- Preparazione delle miscele di reazione.
- Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 3 micron esamero GP4, 6 micron modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 1 mM CTP, e 2 nm [γ- 32 P] ATP. Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2.
- Il funzionamento del flusso Rapid-tempra
- Effettuare le reazioni come descritto al punto 2.2. Eventualmente aggiungere polimerasi T7 DNA o proteina legante T7-stranded DNA singola ad una concentrazione di 15 mM e 20 mM, rispettivamente. In questo caso, i prodotti di estensione si accumulano in un regime di tempo che consente il campionamento manuale della reazione.
Analisi 4. I dati
- Fit curve di avanzamento dei prodotti a dei minimi non linearemodelli piazze utilizzando il software disponibile in commercio in grado di minimi quadrati adatta e / o integrazione numerica. I dettagli dell'operazione saranno variano a seconda del software utilizzato, ma al di sotto sono forme generalizzate di equazioni utilizzate per il montaggio dei dati.
- Determinare la velocità di formazione del prodotto di molteplici reazioni di sintesi fatturato iniettore inserendo progredire curve ad una equazione lineare. Se c'è una significativa curvatura, utilizzare il metodo tasso iniziale 13, 14 inserendo i dati ad una singola funzione esponenziale: y = A (e - k t), dove y è la concentrazione del prodotto, A è l'ampiezza reazione, k è la costante di velocità osservata, t è il tempo, espresso in secondi. La pendenza della retta tangente al tempo = 0 è il tasso iniziale.
NOTA: reazioni di sintesi di primer stato Fit pre-stabili ad una equazione lineare o per l'equazione di stato pre-stazionario scoppiare y = A (e - BU Kprimo t) + tasso ss t, dove A è l'ampiezza di reazione, k scoppio è la costante di velocità osservata per lo scoppio stato pre-stazionario, il tasso ss è lo stato stazionario tasso ss = k gatto [enzima]), t è il tempo , in secondi. Fit reazioni di sintesi di primer singolo fatturato progresso curve ad un singolo esponenziale funzione y = A (e - k t). Nel caso di GP4, inserire i dati per integrazione numerica 15, ad un modello con tre NTP gradini di condensazione, in cui ogni intermedio è in equilibrio con l'enzima, utilizzando un software disponibile in commercio.
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Representative Results
I risultati mostrati in figura 1A sono stati ottenuti come descritto al punto 1 del protocollo, cioè, campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP4 in condizioni multiple-turnover. Qui, una gamma di prodotti dopo elettroforesi su gel può essere osservato mediante CTP marcato con 32 P alla α-posizione in reazioni di sintesi di primer (Figura 1A). Il precursore marcato, CTP, mostra la mobilità alto e migra verso il fondo del gel, seguita da specie più lenti migrano corrispondenti al di-, tri-, e tetraribonucleotides sintetizzati da gp4. A seconda della lunghezza di incubazione, e contesto della sequenza template, si possono osservare ulteriori prodotti etichettati corrispondenti a oligomeri superiori (pentaribonucleotides, ecc). Una curva andamento della reazione è tracciata determinando prima la concentrazione dei primer integrali (cioè, tetra-e pentaribonucleotides) in ogni tempo di valutazione e tracciando la concentrazione di primer sintetizzati come funzione del tempo.
Mentre ottenere dati da stato stazionario, esperimenti multipli sulla cifra d'affari è relativamente facile, il contenuto informativo dei dati è un po 'limitata, in quanto i dati vengono fortemente definita da substrato vincolante e gli eventi di rilascio del prodotto, vale a dire., Questi eventi in genere dominano o fortemente determinare K M e K gatto valori a 16. Se la reazione è osservata abbastanza brevi intervalli di tempo, prima che venga stabilita stato stazionario (in altre parole, lo stato pre-stazionario) molto maggiore contenuto informativo può essere derivata da esperimenti cinetici. Esame delle reazioni nello stato pre-stazionario in grado di fornire un tesoro di informazioni. Ad esempio, se si osserva un "pre-stazionario scoppio stato" di formazione del prodotto, è buona indicazione che rilascio del prodotto è un fattore limitante in per la reazione. Inoltre, si può estrarre il tasso di formazione del prodotto (o la fase chimica) dalla fase stato pre-stazionario della reazione. Al contrario, se una raffica di formazione del prodotto non si osserva, allora è dimostrato che il tasso di stato stazionario è limitata sia dalla fase chimica, o una fase precedente e che il rilascio del prodotto è rapida in confronto.
Quando uno strumento rapido raffreddamento viene utilizzato per esaminare la reazione catalizzata da gp4 in scale temporali nell'intervallo secondi fino a pochi millisecondi (fase 2 del protocollo), è evidente che l'accumulo di primer non è lineare, ma visualizza bifasica profilo (Figura 1B, linea continua). Questo è un risultato diagnostico dimostrando prova per una raffica stato pre-stazionario di accumulo di prodotto, il che suggerisce che la formazione del prodotto è rapido e che il rilascio è limitante in stato stazionario. Altri sistemi enzimatici non possono mostrare questocomportamento. Ad esempio, una curva di avanzamento ipotetica è presentato che risulterebbe se la formazione di primer da gp4 non procedeva con un burst stato pre-stazionario (Figura 1B, linea tratteggiata). In casi come questi, l'interpretazione sarebbe che la formazione del prodotto, o un passo precede, è il fattore limitante.
Un'altra realizzazione della cinetica di stato pre-stazionario è l'esperimento singolo turnover, dove una bassa concentrazione di substrato marcato è vincolata saturando quantità di enzima (così come DNA e CTP, nel caso di GP4). Questo tipo di esperimento è particolarmente adatto per fornire informazioni sulla formazione e il decadimento della specie intermedie durante la conversione di substrato al prodotto. Nella reazione GP4-catalizzata (punto 3 del protocollo), formazione di primer è il risultato di tre reazioni di trasferimento nucleotidyl. Recentemente, abbiamo usato reazioni di sintesi fondo single-fatturato a rivelare informazionimerito intermedi di primer 8 (Figura 1C) montando l'accumulo tempo-dipendente e la scomparsa dei di-, tri-, e prodotti tetraribonucleotide ad un modello sequenziale di tre fasi di trasferimento nucleotidyl, dove gli intermedi ribonucleotide sono in equilibrio con GP4.
Figura 1: analisi cinetica della sintesi di primer da parte del T7 primasi-elicasi. (A) Time-corso di formazione di primer da gp4 su un ssDNA con un unico PRS. I campioni sono stati rimossi prima dell'aggiunta MgCl 2 (tempo = 0) e campionati ad intervalli dopo la sua aggiunta. I prodotti sono indicati a fianco dell'immagine gel. (B) Linea continua: formazione Primer da gp4 presenta una raffica stato pre-stazionario. I valori sono la media di almeno tre esperimenti indipendenti. punteggiato line: Rappresentazione di una curva di avanzamento reazione se la reazione GP4-catalizzata proceduto senza una raffica stato pre-stazionario. Modificato da 8. (C) Single-fatturato sintesi di primer da GP4. A sinistra: il tempo-corso di formazione tetramero. A destra: trama di formazione intermedia in funzione del tempo. I valori sono la media di almeno tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati adatti per integrazione numerica; linee continue indicano la calzata. Modificato da 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell'enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l'attività specifica del preparato nell'arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, e il 10% di glicerolo con azoto liquido e conservare a -80 ° C. Durante l'utilizzo dello strumento flusso rapido raffreddamento, in particolare durante l'acquisizione dei primi campioni, è importante permettere ai reagenti di raggiungere la temperatura di reazione (temperatura ambiente) prima di iniziare la reazione. Inoltre, grande attenzione dovrebbe essere presa per pulire a fondo il tubo (passo 2.2.4 del protocollo) dopo ogni time-point, come ogni residuo di reagente tempra inla linea sarà notevolmente inibire l'attività enzimatica, che porta a risultati errati. Un'altra considerazione riguarda la composizione del gel di poliacrilammide e la sua movimentazione. I prodotti in reazioni di sintesi di primer catalizzate da gp4 non risolvono bene in gel con meno di almeno il 20% di acrilammide. Infatti, nel 15% gel, il substrato nucleotide e tutti i prodotti di reazione migrano come zona indistinta di radioattività. Pertanto, è altamente consigliabile per regolare la percentuale acrilammide conseguenza se piccoli prodotti ribonucleotide devono essere analizzati. Uno svantaggio dell'utilizzo di gel contenenti un'alta percentuale di acrilammide è che essi non aderiscono bene alla carta; quindi grande cura deve essere utilizzato per trasferire loro di cromatografia su carta per l'essiccazione. Infine, gel contenenti un'alta percentuale di acrilamide tendono a rompere in essiccatoi sottovuoto gel alimentato. Troviamo che abbassando la temperatura di essiccamento a 65 ° C porta a meno cracking di gel. In alternativa, i gel possono essere esposti al fosforoschermi imager senza seccare.
Ci sono un gran numero di variazioni delle condizioni di reazione e dei reagenti che possono essere testati utilizzando questo protocollo, e che stiamo perseguendo nei nostri studi di GP4, che vanno da testare il comportamento enzimatica degli enzimi mutanti, esaminando l'effetto di aggiunta di piccole putativo inibitori della molecola o attivatori, o substrati alternativi, come gli analoghi nucleotidici, così come i modelli di DNA alternativi, o cofattori di ioni metallici. Il protocollo descritto sopra utilizza temperatura ambiente la temperatura di reazione. Se un'altra temperatura di reazione è desiderato, la maggior parte degli strumenti rapida tempra contengono una valvola che permette di collegare lo strumento ad un bagno di acqua di calore controllato. Nei casi in cui elettroforetica separazione prodotto non è soddisfacente, in particolare se il tampone di reazione contiene un'alta concentrazione (> 200 mM) di sale, è consigliabile trattare campioni dopo tempra con 1-10 unità di fosfatasi alcalina e incubare a 37 ° C per almeno 30 minuti. Questo eliminerà i trifosfati terminali da NTP e prodotti ribonucleotide e migliorare la loro separazione elettroforetica. Tuttavia, questo è pratico solo se il nucleotide è identificato nella posizione α.
L'utilizzo di uno strumento di rapida estinzione non è conveniente per l'analisi high-throughput. Un utente esperto può eseguire il protocollo flusso rapido raffreddamento qui descritto, partendo dalla preparazione del campione, raccogliendo circa 18 punti temporali e pulizia dello strumento in circa due ore. Un vincolo ulteriore tempo è il tempo richiesto per elettroforesi su gel, l'esposizione del gel, e l'analisi dei dati. Un'altra limitazione è che un tipico esperimento richiede 500 a 1000 ml di volume di reazione, e ottenendo enzima sufficiente potrebbe essere difficile nel caso di proteine che non sono espressi in modo efficiente.
C'è un grande interesse per lo sviluppo di test che consentono high-throughput screening di primaattività di SE, in particolare per lo sviluppo di nuove terapie antibatteriche 17, 18. Nonostante i progressi nello sviluppo non radioattivi, test continui per l'attività primasi, questi test soffrono di due limitazioni importanti e quindi precluderne l'uso nelle indagini cinetiche rapide, ad esempio, non hanno tempo sufficiente risoluzione e la sensibilità del prodotto. Pertanto, l'radioattivo, saggio discontinua qui descritto è attualmente il gold standard in sede di esame cinetica di attività primasi da GP4, e primases DNA in generale. realizzazioni più sofisticate del protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del percorso cinetica di una reazione enzimatica catalizzata con uno strumento flusso rapido raffreddamento, per esempio, in esperimenti di pulse-chase destinati a determinare il partizionamento cinetica di substrati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
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