Introduction
تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي.
ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5'-GTC-3 '). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج 3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب 4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 5، 6. في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط 7 البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة.
المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة.
ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح 8 و 9 و 10. الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يحتوي على واحد T7 الموقع الاعتراف بريميز (5'-GGGTC-3 "، 5'-GTGTC-3"، 5'-TGGTC-3 ') يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الشركات توليف الحمض النووي (طول وssDNA قد تعتمد على انزيم الاختيار، لبريميز T7، وهو مخموس هو الحد الأدنى لطول قالب لتجميع التمهيدي كامل طول 11، كما خفي C ضروري، ولكن إذا التمهيدي هو للتمديد من قبل البلمرة، يجب أن يكون النيوكليوتيدات إضافية موجودة في نهاية 3 'من القالب. وبدأت ردود الفعل من خلال إضافة تركيز النهائي من 10 ملي MgCl 2 وحضنت عند 25 درجة مئوية. أخذ العينات اليدوية تعمل بشكل جيد لفترة نقاط من 5 ثوان أو أكثر. إذا كانت هناك حاجة للوقت نقطة أقصر من ذلك، فمن المستحسن استخدام أداة تدفق إخماد السريع للحصول على بيانات دقيقة.
1. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل من جانب أخذ العينات اليدوية
- قبل بدء التجربة، قسامة 2 ميكرولتر من العازلة صبغ الفورماميد (93٪ (ت / ت) الفورماميد، 50 ملي EDTA، 0.01٪ سيانول زايلين و 0.01٪ برموفينول الأزرق) إلى 8 1.5 أنابيب البولي بروبلين مل. بشكل عام، وعدد من الأنابيب هو مساو لعدد من الزمن نقاط تحليلها.
- تحضير خليط 20 ميكرولتر تتكون 1X العازلة، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP، 0.25 زارة التجارة والصناعة / مل [α- 32 ف] CTP، 0.1 ميكرومتر SSDقالب NA، و 0.1 ميكرومتر GP4 (معبرا عنها تركيز مسدوس - 0.6 ميكرومتر مونومر).
- احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إزالة 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام pipettor وتخلط مع 2 ميكرولتر عازلة صبغ الفورماميد في أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1 لأي السيطرة على رد فعل (الساعة صفر).
- إضافة 2 ميكرولتر من 0.1 M MgCl 2 إلى خليط التفاعل (لتركيز النهائي من 10 ملم).
- سحب يدويا 2 عينات ميكرولتر من خليط التفاعل باستخدام pipettor في الصورة فترات 10 وتخلط مع صبغ الفورماميد predispensed في أنابيب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1.
- عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة.
- تحميل aliquots من العينات على هلام تغيير طبيعة. يتم حل المنتجات التمهيدي tetraribonucleotide صغيرة توليفها من قبل بريميز T7 جيدا على 0.4 مم 25٪ الأكريلاميد: bisacrylamide (19: 1)، 3 M اليوريا، 1X TBE (100 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA).
- وضع الجل بالكامل على chromatograورقة فيز والغطاء مع غلاف بلاستيكي. هلام الجافة باستخدام أكثر جفافا هلام.
- إعداد سلسلة تخفيف ما تبقى من خليط التفاعل وبقعة نفس حجم تحميلها على هلام على ورقة اللوني، أي بقعة 4 ميكرولتر من التخفيف إذا تم تحميل 4 ميكرولتر من العينة.
ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة منحنى القياسية لتحديد تركيز شكلت المنتجات أثناء عملية التفاعل. على سبيل المثال، التخفيفات خمسة أضعاف باستخدام العازلة TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) تعمل بشكل جيد، تغطي مجموعة من 1:25 إلى 1: 15625 (5 2 -5 6)، ولكن يجب أن التخفيفات تعديلها تبعا لمستوى النشاط. - فضح هلام الجافة ومستوى باستخدام شاشة phosphorimager. قياس النشاط الإشعاعي في سلسلة تخفيف وبناء منحنى القياسية كما هو موضح 8 و 12
ملاحظة: إدراج T7 البلمرة DNA لخليط التفاعل يسمح احد لإكساءمنجم استخدام بادئات tetraribonucleotide هذا الانزيم. على النحو الأمثل، وتركيز البلمرة يجب أن تشبع لتبسيط تفسير البيانات. وهناك تركيز البلمرة من 0.4 ميكرومتر أو أعلى يعطي نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير بروتينات أخرى، مثل الحمض النووي ملزمة البروتينات واحدة الذين تقطعت بهم السبل، على أي توليف التمهيدي أو متخلفة حبلا بدء يمكن فحص بهذه الطريقة.
2. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل عن طريق صك السريع-إخماد
- المخاليط رد فعل
- إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X و 0.2 ميكرومتر GP4 مسدوس، 0.2 ميكرومتر قالب ssDNA، 0.6 ملي dNTPs، 0.2 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP (بما في ذلك 0.5 MCI / مل [α- 32 ف] CTP.
- إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2.
- تشغيل-إخماد السريع أداة تدفق
- تشغيل موسيقى الرابID-إخماد أداة التدفق. بعد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب 7 على لوحة المفاتيح أداة لنقل سائق المحقنة إلى موقف البيت.
- حقنة موقف فتح عازلة ل"تحميل".
- المحاقن العازلة تحميل
- نعلق 10 مل حقنة تحتوي عازلة لميناء محرك حقنة. تغيير حقنة موقف مقبض الباب ل"تحميل".
- عن طريق الحقن 10 مل، وملء عازلة أداة خزان A و B مع 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA وملء حقنة C مع حل إخماد (250 ملي EDTA، و 0.2٪ SDS). إزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع الغطاسون في الداخل والخارج.
- مواقف تغيير مقبض الباب ل"النار". النوع 2 لضبط الموقف من شريط سائق حقنة. الصحافة .. "تعديل أسفل" الزر لخفض حقنة حتى يأتي عازلة خارج الحلقة الخروج: (7 تنخفض باستمرار؛ الخطوة 8 الكبيرة إلى أسفل؛ الخطوة 9 صغيرة أسفل). اكتب "ESC" للعودة إلى القائمة الرئيسية.
- غسل الأنابيب
- توريمنظمة العمل ضد الجوع خط الخروج إلى فراغ. تغيير المقابض عينة إلى "إخراج". وثيقة حقنة عازلة عن طريق وضع المقابض إلى الوضع الأفقي. بدوره على فراغ وتراجع الحلقات 2 دافق في H 2 O لمدة 10 ثانية، ثم تراجع في MeOH لمدة 10 ثانية. حلقات الجافة ويمتص الهواء ل~ 15 ثانية، أو حتى تجف.
- عينات تحميل
- مقبض الباب تغير موقف عينة إلى "تحميل". وضع حل لفي 1 مل حقنة. المكونات حقنة في واحدة من الموانئ تحميل عينة. كرر حل B، ووضع في المقابل ميناء التحميل العينة.
- جمع من الزمن نقاط
- في القائمة الرئيسية، اكتب 1 لتشغيل إخماد التدفق. أدخل وقت رد الفعل (الصورة) ثم اضغط على "دخول". سيتم عرض عدد حلقة رد فعل للاستخدام. التبديل إلى حاجة حلقة رد فعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4.
- تحويل المقابض عينة إلى "تحميل". يمزج رد فعل الحمل في الحلقات عينة حتى خارج المقصورة خلط المركزية. تحويل جميع المقابض إلى "منطقة معلومات الطيرانE ". تأكد من أن كافة المقابض هي في الموضع الصحيح.
- وضع أنبوب 1.5 مل على نهاية الخروج الحلقة. اضغط على "جو GO" لتشغيل رد الفعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. تحديث الحقن عازلة A و B حتى ضربوا السائق.
- كرر الخطوات 2.2.6.2-2.2.6.3 لكل نقطة الوقت المطلوب. استثناء: لا تقم بتحميل محلول يحتوي على بداية كاشف (أي MgCl 2 في هذه الحالة) عندما تبريد سيطرة الصفر الوقت نقطة.
- عند الانتهاء من جمع العينات، أدخل "ESC" للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على "7" للعودة سائق عازلة حقنة لموقف وطنه.
- أداة تنظيف
- إزالة المحاقن خليط التفاعل. تحويل عينة مقبض تحميل ل"تحميل" موقف. تحت فراغ، ويغسل كل حلقة العينة مع 10 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N، تليها 10 مل 0.3 NH 3 ص 4 و 10 مل MeOH.
- تحويل المقابض حقنة ل"تحميل" موقف. اضغط لأسفل على كل SYR 3الغطاسون إنجي لاسترداد رد فعل وإخماد المخازن. غسل المحاقن مع 5 مل H 2 O مرتين على الأقل.
- ملء الحقن مرة أخرى مع 5 مل H 2 O وتحويل المقابض إلى موقف "النار". تغيير المواقف مقبض الباب وتشغيل فراغ لإزالة H 2 O. فلوش كما في الخطوة 2.2.4. إيقاف الصك.
ويتم تحليل المنتجات كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،12: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة T7 الحمض النووي بوليميريز والبروتينات النسخ الأخرى في خليط التفاعل لتحليل تأثيرها على التوليف التمهيدي أو التمديد.
3. وحيد دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل
ملاحظة: يتم إجراء أحادي دوران المقايسات التمهيدي تجميع / تمديد الخروج على نحو مماثل لردود فعل متعددة دوران، مع بعض الاختلافات الرئيسية: هذه المقايسات تتبع تحويل رديولبلد ATP إلى التمهيدي أو تمديد المنتجات، إلا أن تركيز ركائز والبروتينات هي consideraأعلى بلاي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تحقيق حل ميلي ثانية واحدة للسماح للتحليل رد فعل التوليف التمهيدي، لا بد من الاستفادة من آلة التدفق إخماد السريع.
- المخاليط رد فعل.
- إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X، 3 ميكرومتر مسدوس GP4، 6 ميكرومتر ssDNA القالب، 0.6 ملي dNTPs، 1 ملم CTP، و 2 نانومتر [γ- 32 ف] اعبي التنس المحترفين. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2.
- سريع لإخماد عملية تدفق
- تنفذ تفاعلات كما هو موضح في الخطوة 2.2. إذا رغبت في ذلك، إضافة البلمرة T7 الحمض النووي أو بروتين ملزمة T7 احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي عند تركيز من 15 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، على التوالي. في هذه الحالة، والمنتجات تمديد تتراكم في نظام الوقت الذي يسمح لأخذ العينات اليدوية للتفاعل.
تحليل 4. البيانات
- تناسب منحنيات تقدم المنتج لالأقل- غير الخطيةالساحات النماذج باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا قادرة على المربعات الصغرى نوبات و / أو التكامل العددي. فإن تفاصيل العملية تختلف مع البرنامج يعمل، ولكن أقل من أشكال معممة من المعادلات المستخدمة لتركيب البيانات.
- تحديد معدل تكوين المنتج من عدة تفاعلات التخليق دوران التمهيدي من المناسب للتقدم منحنيات لمعادلة خطية. إذا كان هناك انحناء كبير، استخدام طريقة معدل الأولي 13 و 14 عن طريق تركيب البيانات إلى وظيفة واحدة الأسي: ص = أ (ه - ك ر)، حيث ص هو تركيز المنتج، A هي السعة رد فعل، ك هو ثابت معدل لاحظ، ر حان الوقت، في ثوان. المنحدر من خط المماس في الوقت = 0 هو المعدل الأولي.
ملاحظة: صالح قبل ثابتة تفاعلات التخليق التمهيدي الدولة لمعادلة خطية أو معادلة حالة ما قبل مستقرة انفجار ذ = A (ه - بو كRST ر) + معدل SS ر، حيث A هي السعة رد فعل، ك انفجار هو ثابت المعدل الملاحظ للانفجار حالة ما قبل ثابت، ومعدل ss غير أن حالة استقرار معدل SS = ك القط [أنزيم])، تي آن الأوان ، في ثوان. تناسب-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي منحنيات إلى وظيفة ذ = A واحد الأسي التقدم (ه - ك ر). في حالة GP4، تناسب البيانات عن طريق التكامل العددي 15، إلى نموذج مع ثلاث خطوات التكثيف NTP، حيث كل وسيطة هو في حالة توازن مع الانزيم، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن ملاحظتها باستخدام CTP المسمى مع 32 P في α موقف في تفاعلات التخليق التمهيدي (الشكل 1A). مقدمة المسمى، CTP، يظهر أعلى التنقل ويهاجر باتجاه الجزء السفلي من هلام، تليها الأنواع المهاجرة أبطأ المقابلة لDI-، الثلاثية، وtetraribonucleotides توليفها من قبل GP4. تبعا لطول فترة الحضانة، وقالب تسلسل السياق، منتجات وصفت إضافية الموافق الأوليغومرات أعلى (pentaribonucleotides، الخ) ويمكن ملاحظة. يتم رسم منحنى التقدم رد فعل عن طريق تحديد أول تركيز الاشعال كامل طول (أي، رباعيوpentaribonucleotides) في كل timepoint والتآمر تركيز الاشعال توليفها بوصفها وظيفة من الزمن.
في حين الحصول على بيانات من حالة استقرار، والتجارب متعددة دوران سهلة نسبيا، ومحتوى المعلومات من بيانات محدودة نوعا ما، كما يتم تعريف البيانات بشكل كبير الركيزة الأحداث الافراج عن المنتج ملزم و، أي، هذه الأحداث عادة ما تهيمن أو إلى حد كبير تحديد K M وك القط قيم 16. إذا لاحظت رد فعل في وقت نقاط قصيرة بما فيه الكفاية، قبل أن يتم تأسيس حالة من الثبات (وبعبارة أخرى، فإن الدولة ما قبل مستقرة) أكبر بكثير محتوى المعلومات التي يمكن أن تستمد من التجارب الحركية. فحص ردود الفعل في حالة ما قبل مستقرة يمكن أن توفر مجموعة نفيسة من المعلومات. على سبيل المثال، إذا لوحظ "انفجار حالة ما قبل ثابت" من تشكيل المنتج، بل هو مؤشر جيد على أن إطلاق المنتج هو الحد من معدل خطوة طن رد فعل. وعلاوة على ذلك، يمكن للمرء أن استخراج معدل تكوين المنتج (أو خطوة الكيمياء) من مرحلة ما قبل الدولة ثابتة من رد الفعل. في المقابل، إن لم يكن لوحظ وابلا من تشكيل المنتج، فهو دليل على أن معدل حالة مستقرة يقتصر إما عن طريق الخطوة الكيميائية، أو خطوة سبقته وأن الإفراج عن المنتج السريع في المقارنة.
عند استخدام أداة لإخماد السريع للنظر في رد فعل يحفزه GP4 في جداول زمنية في حدود ثواني وصولا الى أجزاء قليلة من الثانية (الخطوة 2 من البروتوكول)، فمن الواضح أن تراكم التمهيدي ليست خطية، ولكن يعرض ثنائي الطور البيانات الشخصية (1B الشكل، خط الصلبة). هذا هو نتيجة التشخيص يدل دليل على وجود انفجار حالة ما قبل مستمر من تراكم المنتجات، مما يوحي بأن تشكيل المنتج هو سريع وأن الإصدار هو في حالة مستقرة معدل الحد. قد لا تظهر الأنظمة الأنزيمية أخرى هذاسلوك. على سبيل المثال، يتم تقديم منحنى التقدم الافتراضي الذي من شأنه أن يؤدي إذا تشكيل التمهيدي من GP4 لم ينفذ مع موجة حالة ما قبل ثابت (الشكل 1B، الخط المنقط). في مثل هذه الحالات، فإن التفسير يكون ذلك تشكيل المنتج، أو خطوة سبقته، هو الحد من معدل خطوة.
تجسيد آخر من حركية الدولة قبل المطرد التجربة-دوران واحد، حيث لا بد على تركيز منخفض من الركيزة وصفت من قبل تشبع كميات من الإنزيم (وكذلك الحمض النووي وCTP، في حالة GP4). هذا النوع من التجربة هو فريد لتقديم معلومات عن تشكيل وتسوس الأنواع المتوسطة خلال تحويل الركيزة إلى المنتج. في رد فعل المحفز GP4 (الخطوة 3 من البروتوكول)، وتشكيل التمهيدي هو نتيجة لثلاثة تفاعلات نقل نوكليوتيديل. في الآونة الأخيرة، كنا-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي للكشف عن معلوماتحول سيطة التمهيدي 8 (الشكل 1C) عن طريق تركيب تراكم تعتمد على الوقت واختفاء DI-، الثلاثية، ومنتجات tetraribonucleotide إلى نموذج متتابعة من ثلاث خطوات نقل نوكليوتيديل، حيث وسيطة ريبونوكليوتيد هي في حالة توازن مع GP4.
الشكل 1: تحليل الحركية من التوليف التمهيدي من T7 بريميز-هيليكاز. (أ) الوقت لمسار تشكيل التمهيدي من GP4 على ssDNA مع استراتيجية الحد من الفقر واحد. تم سحب جزء من العينات قبل إضافة MgCl 2 (الوقت = 0) وأخذ عينات على فترات بعد إضافته. يشار إلى المنتجات إلى يسار صورة هلام. (ب) خط الصلبة: تشكيل التمهيدي من GP4 يسلك انفجار حالة ما قبل مطرد. القيم هي متوسط لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. ل منقطالمعهد الوطني للإحصاء: تمثيل منحنى التقدم رد فعل إذا سارت رد الفعل المحفز GP4 دون انفجار حالة ما قبل مطرد. تعديل من 8. (C) وحيد دوران التوليف التمهيدي من GP4. اليسار: الوقت طبعا من تشكيل tetramer. الحق: مؤامرة من تشكيل المتوسط مقابل الوقت. القيم هي متوسط لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. وتناسب البيانات عن طريق التكامل العددي. خطوط الصلبة تظهر مناسبا. تعديل من 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض في النشاط المحدد لإعداد أكثر من بضعة أشهر. لذلك نحن الآن فلاش تجميد قسامات صغيرة من GP4 النقي في 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم TCEP، و 10٪ الجلسرين باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. أثناء استخدام أداة تدفق إخماد السريع، وخصوصا خلال الاستحواذ على عينات القليلة الأولى، فمن المهم السماح المتفاعلة للوصول إلى درجة حرارة التفاعل (درجة حرارة الغرفة) قبل بدء التفاعل. أيضا، عناية كبيرة ينبغي اتخاذها لتنظيف شامل للأنابيب (الخطوة 2.2.4 من البروتوكول) بعد كل نقطة الوقت، لأن أي كاشف إخماد ما تبقى فيفإن خط يكبح بشكل كبير لنشاط انزيم، مما يؤدي إلى نتائج خاطئة. يتضمن اعتبار آخر تكوين هلام بولي أكريلاميد وتعاملها. المنتجات في تفاعلات التخليق التمهيدي يحفزه GP4 لا حل جيد في المواد الهلامية مع أقل من ما لا يقل عن 20٪ مادة الأكريلاميد. في الواقع، في 15٪ المواد الهلامية، والركيزة النوكليوتيدات ومنتجات التفاعل تهاجر كمنطقة غير واضحة من النشاط الإشعاعي. وبالتالي، فمن المستحسن جدا لضبط نسبة الأكريلاميد وفقا لذلك إذا كانت منتجات ريبونوكليوتيد الصغيرة ليتم تحليلها. والعيب الرئيسي لاستخدام المواد الهلامية التي تحتوي على نسبة عالية من مادة الأكريلاميد هو أنها لا تلتصق بشكل جيد على الورق. لذلك يجب أن تستخدم بعناية كبيرة لنقلهم إلى اللوني ورقة للتجفيف. وأخيرا، والمواد الهلامية التي تحتوي على نسبة عالية من مادة الأكريلاميد تميل للقضاء في مجففات هلام التي تعمل بالطاقة الكهربائية. نجد أن خفض درجة حرارة التجفيف إلى 65 درجة مئوية يؤدي إلى أقل تكسير المواد الهلامية. بدلا من ذلك، المواد الهلامية يمكن أن تتعرض لالفوسفورشاشات تصوير بدون تجفيف.
وهناك عدد كبير من الاختلافات في ظروف التفاعل والكواشف التي يمكن اختبارها باستخدام هذا البروتوكول، والتي نسعى في دراستنا لGP4، بدءا من اختبار السلوك الأنزيمية من الانزيمات متحولة، ودراسة تأثير إضافة الصغيرة المفترضة مثبطات جزيء أو تفعيل، أو ركائز بديلة، مثل النظير النوكليوتيدات، وكذلك قوالب الحمض النووي بديلة، أو العوامل المساعدة أيون الفلز. بروتوكول المذكورة أعلاه يستخدم درجة حرارة الغرفة مع درجة حرارة التفاعل. إذا كان المطلوب درجة حرارة التفاعل آخر، معظم أدوات إخماد السريع تحتوي على صمام يسمح احد لتوصيل أداة لحمام الماء التي تسيطر عليها الحرارة. في الحالات التي يكون فيها فصل المنتجات الكهربي ليست مرضية، لا سيما إذا كان المخزن المؤقت رد فعل يحتوي على نسبة عالية (> 200 ملم) من الملح، فإنه من المستحسن لعلاج عينات بعد التبريد مع 1-10 وحدات من الفوسفاتيز القلوية واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. سيؤدي ذلك إلى إزالة triphosphates محطة من هذه البرامج الوطنية والمنتجات ريبونوكليوتيد وتعزيز انفصالهما الكهربي. ومع ذلك، هذا هو عملي إلا إذا وصفت النوكليوتيدات في موقف α.
استخدام أداة لإخماد السريع ليست مريحة للتحليل الإنتاجية العالية. يمكن للمستخدم من ذوي الخبرة أداء وصف بروتوكول تدفق إخماد السريع هنا، بدءا من إعداد العينات، وجمع ما يقرب من 18 مرة نقاط، وتنظيف أداة في حوالي ساعتين. لضيق الوقت الإضافي هو الوقت اللازم لالكهربائي للهلام، والتعرض هلام، وتحليل البيانات. الحد الآخر هو أن تجربة نموذجية تتطلب 500 إلى 1000 ميكرولتر من حجم رد الفعل، ويمكن الحصول على أنزيم يكفي أن تكون صعبة في حالة من البروتينات التي لا يتم التعبير بكفاءة.
هناك مصلحة كبيرة في تطوير المقايسات التي تمكن فحص عالية مرت من الوجاهةالنشاط ذاته، وخاصة لتطوير علاجات مضادة للجراثيم جديدة 17 و 18. على الرغم من التقدم في تطوير غير المشعة، فحوصات مستمرة لنشاط بريميز، هذه المقايسات تعاني من اثنين من القيود الرئيسية، وبالتالي يحول دون استخدامها في التحقيقات الحركية السريعة، أي تفتقر إلى قرار ما يكفي من الوقت وحساسية المنتج. ولذلك، فإن، فحص متقطع المشع هو موضح هنا هو حاليا معيار الذهب في الفحص الحركي النشاط بريميز التي كتبها GP4، وprimases الحمض النووي بشكل عام. تجسيد أكثر تطورا من بروتوكول صفها هنا يمكن استخدامها في تحديد المسار الحركي رد الفعل المحفز الإنزيم باستخدام أداة تدفق إخماد السريع، على سبيل المثال، في التجارب نبض مطاردة تهدف إلى تحديد التقسيم الحركي من ركائز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C.
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
