Introduction
Replikation av DNA är en bevarad funktion i alla cell liv. Medan identiteten och antalet replikeringskomponenter varierar kraftigt, de allmänna mekanismer delas mellan evolution 1. Här beskriver vi gelbaserade, diskontinuerliga kinetiska experiment, med hjälp av radioaktiva substrat, som syftar till att förstå kinetiken av släpar-strängen DNA-syntes in vitro av komponenter i T7 replisome. Replikeringsmaskineri med bakteriofag T7 är mycket enkel, bestående av endast fyra proteiner (DNA-polymeraset, GP5, och dess processivitet faktor, E.coli thioredoxin, de bifunktionella primas-helikas GP4, och den enkelsträngade DNA-bindande protein, gp2. 5) 2. Denna egenskap gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera de konserverade biokemiska mekanismer som är involverade i DNA-replikation.
Särskild tonvikt läggs på bildandet av ribonukleotid primers genom T7-DNA-primas, en critical steg i initiering av DNA-syntes. Dessutom kan man också undersöka användningen av dessa primers av T7 DNA-polymeras eller andra replikerings proteiner genom att inkludera dem i reaktionsblandningen. T7-primas-helikas, GP4, katalyserar bildningen av primrar för DNA-syntes vid specifika DNA-sekvenser kallade primasigenkänningsställen, eller PRS, (5'-GTC-3 '). Cytosin i PRS är kryptisk, är det viktigt för erkännande av platsen, men det är inte kopieras till produkten 3. Det första steget i primer-syntes genom GP4 innefattar bildningen av dinukleotiden pppAC, som sedan förlängs till en trimer, och så småningom till funktionella tetranukleotid primers pppACCC, pppACCA eller pppACAC beroende på sekvensen i mallen 4. Dessa primrar kan sedan användas av T7-DNA-polymeras för att initiera DNA-syntes, som också är en GP4-assisted process 5, 6. I detta avseende, den primasdomän stabiliserar extremt korta tetraribonucleotides med mallen, förhindrar deras dissociation, engagerar DNA-polymeras på ett sätt som bidrar till att säkra primer / mall i polymera aktiva stället 7. Dessa steg (RNA primer syntes, primer handoff till polymeras och förlängnings) upprepas i flera cykler för att replikera den eftersläpande strängen och måste samordnas med replikeringen av den ledande strängen.
De analyser som beskrivs här är mycket känsliga och kan utföras i en måttlig tidsram. Men de är relativt låg genomströmning och stor försiktighet måste iakttas vid användning och bortskaffande av radioaktivt material. Beroende på den hastighet med vilken reaktionen fortskrider, kan man använda en snabbkylnings instrument för att uppnå prover på tidsskalor lämpade för meningsfull analys av reaktionstidsförlopp i antingen konstant eller pre-steady state. Nyligen använde vi analyser som beskrivs här för att ge evidence om vikten av primer frisättning från primas domän GP4 i inledningen av Okazaki fragment. Dessutom fann vi bevis för en reglerande roll för T7 enkelsträngat DNA-bindande protein, gp2.5 i att främja en effektiv primer bildning och användning 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följ alla institutionella föreskrifter om säker användning och slutförvaring av radioaktivt material, inklusive men inte begränsat till, användning av personlig skyddsutrustning, såsom handskar, skyddsglasögon, labbrock, och lämpliga akryl sköldar.
OBS: standardbuffert består av 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kalium glutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (denna buffert är förtillverkad vid en 5x koncentration) och 0,3 mM av varje dNTP. T7 replikering proteiner renas såsom beskrivits 8, 9, 10. Enkelsträngat DNA som innehåller en enda primas igenkänningsställe T7 (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') kan köpas från en mängd olika DNA-syntesföretag (längden på ssDNA kan bero på enzymet av val, för T7-primas, är en pentamer den minsta mall längd för att syntetisera en fullängds-primer 11, som den kryptiska C är dock väsentligt, om primern är att förlängas med polymeras, ytterligare nukleotider måste vara närvarande vid 3'-änden av mallen. Reaktionerna initieras genom tillsats av en slutlig koncentration av 10 mM MgCl2 och inkuberades vid 25 ° C. Manuell provtagning fungerar bra för tidpunkter av 5 sekunder eller mer. Om tidpunkter är kortare än som krävs, är det rekommenderat att använda en snabbkylningsflöde instrument för att få fram exakta uppgifter.
1. Fler omsättning Primer syntesreaktionen genom manuell Provtagning
- Före start av experimentet, alikvot 2 mikroliter av formamid färgämne-buffert (93% (volym / volym) formamid, 50 mM EDTA, 0,01% xylencyanol och 0,01% bromfenolblått) i 8 1,5 ml polypropenrör. I allmänhet är antalet rör som är lika med det antal tidpunkter som analyserats.
- Förbered en 20 mikroliter blandning bestående 1x buffert, 0,1 mM ATP och CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32p] CTP, 0,1 ^ M SSDNA mall, och 0,1 | iM GP4 (uttryckt som hexamer koncentration - 0,6 iM monomer).
- Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 5 min.
- Ta bort 2 mikroliter av blandningen med hjälp av en pipett och blanda med 2 pl formamid färgämne buffert i en 1,5 ml rör som framställts i steg 1,1 för ingen reaktion kontroll (tid noll).
- Tillsätt 2 mikroliter av 0,1 M MgCl2 till reaktionsblandningen (till en slutlig koncentration av 10 mM).
- Manuellt dra tillbaka 2 pl-prover av reaktionsblandningar med användning av en pipett på 10 s intervall och blanda med formamid färgämne avdelad i 1,5 ml rör som framställts i steg 1,1.
- Värme prover vid 95 ° C under 5 min i ett värmeblock.
- Ladda alikvoter av proverna på en denaturerande gel. De små tetraribonucleotide primerprodukter syntetiserade av T7 primas löses väl på en 0,4 mm tjock 25% akrylamid: bisakrylamid (19: 1), 3 M urea, 1 x TBE (100 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
- Placera hela gelén på chromatography papper och täck med plastfolie. Torra gelén med användning av en gel-tork.
- Bered en spädningsserie av återstoden av reaktionsblandningen och dekor samma volym laddades på gelén på kromatografipapper, dvs, spot 4 mikroliter av utspädning om 4 mikroliter av provet laddades.
OBS: Detta kommer att fungera som standardkurvan för att bestämma koncentrationen av produkter som bildas under reaktionen. Till exempel, fem-faldiga spädningar med användning av TE-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) fungerar bra, som spänner över ett område av 1:25 till 1: 15625 (5 2 -5 6), men de spädningar bör justeras beroende på aktivitetsnivå. - Exponera torr gel och standard med en fosforskärm. Kvantifiera radioaktiviteten i utspädningsserie och konstruera en standardkurva som beskrivits 8, 12
OBS: Införande av T7 DNA-polymeras till reaktionsblandningen gör att man kan EXAgruva användningen av tetraribonucleotide primers genom detta enzym. Optimalt bör polymeraskoncentrationen mättande att förenkla tolkningen av data. En polymeraskoncentration av 0,4 pM eller högre ger goda resultat. Dessutom kan effekten av andra proteiner, såsom enkelsträngade DNA-bindande proteiner, på vardera primer syntes eller släpar-strängen initiering undersökas på detta sätt.
2. Fler omsättning Primer syntesreaktionen med en snabb-släcknings Instrument
- Framställning av reaktionsblandningar
- Förbered 400 mikroliter av lösning A, innehållande 1 x buffert, 0,2 iM GP4 hexamer, 0,2 iM ssDNA mall, 0,6 mM dNTP, 0,2 mM ATP och CTP (inklusive 0,5 mCi / ml [α- 32p] CTP.
- Förbered 400 mikroliter av lösning B, som innehåller 1x buffert och 20 mM MgCl2.
- Drift av snabbkylningsflödesinstrument
- Slå på rapid-släckningsflöde instrument; efter huvudmenyn visas, typ 7 på instrument tangentbordet för att flytta sprutan föraren till utgångsläget.
- Öppet buffert spruta möjlighet att "LOAD".
- Laddningsbuffert sprutor
- Fäst en 10 ml spruta innehållande buffert till drivsprut porten. Ändra spruta ratten möjlighet att "LOAD".
- Med användning av 10 ml sprutor, fyll instrumentbuffertbehållaren A och B med 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA och fylla sprutan C med släckningslösning (250 mM EDTA och 0,2% SDS). Avlägsna luftbubblor genom att skjuta kolvarna in och ut.
- Ändra ratten positioner till "eld". Typ 2 för att justera läget av sprutdrivstången. Tryck på "Adjust Down" för att sänka sprutan tills bufferten kommer ut exit loop: (7-går ned kontinuerligt, 8-stort steg ner, 9-litet steg ner). Skriv "ESC" för att återgå till huvudmenyn.
- tvätt slang
- ATTACH utloppsledningen till vakuum. Ändra prov rattar till "spola". Nära buffert spruta genom att ställa in vreden till horisontellt läge. Slå på vakuum och doppa de två kantslingor i H2O under 10 s, sedan doppa i MeOH under 10 s. Torra slingor genom att suga luft för ~ 15 s, eller tills den är torr.
- att proverna
- Ändra prov ratten möjlighet att "LOAD". Placera lösning A i 1 ml spruta. Anslut sprutan i en av de provlastportar. Upprepa för lösning B och placera i motsatt provbelastning port.
- Insamling av tidpunkter
- På huvudmenyn, typ 1 för avkylningsflödes sikt. Ange reaktionstiden (s) och tryck, "ENTER". Reaktionsslinga som ska användas kommer att visas. Växla till önskad reaktionsslinga. Upprepa tvätta proceduren i steg 2.2.4.
- Vrid prov rattarna till "Load". Last reaktion blandar i provslingor tills strax utanför den centrala blandningsutrymmet. Vrid alla vred till "FIRE ". Kontrollera att alla vred är i rätt läge.
- Placera 1,5 ml rör på slutet av avfarten slinga. Tryck på "GO" för att köra reaktionen. Upprepa tvätta proceduren i steg 2.2.4. Ladda buffert sprutor A och B tills de slår föraren.
- Upprepa stegen 2.2.6.2-2.2.6.3 för varje önskad tidpunkt. Undantag: Fyll inte lösning som innehåller startreagens (dvs MgCl2 i detta fall) när släckning nolltidspunktsstyrning.
- När du är klar insamling av prover, ange "ESC" för att återgå till huvudmenyn. Tryck på "7" för att återgå buffert spruta förare till sitt utgångsläge.
- Instrument sanering
- Avlägsna reaktionsblandningen sprutor. Vrid provladdningsknappen på "LOAD" läge. Under vakuum, tvätta varje prov slinga med 10 ml 0,2 N NaOH, följt av 10 ml 0,3 NH3 PO 4 och 10 ml MeOH.
- Vänd sprutan rattarna till "LOAD" läge. Tryck ned alla tre syrInge kolvar för att hämta reaktions- och härdnings buffertar. Tvätt sprutor med 5 ml H2O minst två gånger.
- Fylla sprutor igen med 5 ml H2O och vrid knopparna till "FIRE" position. Ändra ratten positioner och slå på vakuum för att avlägsna H2O Flush som i steg 2.2.4. Stänga av instrumentet.
OBS: Produkterna analyserades såsom beskrivits i steg 1.7-1.12. Dessutom kan T7-DNA-polymeras och andra replikationsproteiner tillsättas i reaktionsblandningen för att analysera deras effekt på primer-syntes eller anknytning.
3. Single-omsättning Primer syntesreaktionen
OBS: Single-omsättnings primer-syntes / förlängningsanalyser utförs på liknande sätt som fleromsättningsreaktioner, med några stora skillnader: dessa analyser följer omvandlingen av radiomärkt ATP in primer eller förlängningsprodukter, men koncentrationen av substrat och proteiner är considerably högre. Dessutom, för att uppnå millisekund upplösning för att möjliggöra analys av primern syntesreaktionen, måste man använda en snabb-kylningsflödesmaskin.
- Framställning av reaktionsblandningarna.
- Förbered 400 mikroliter av lösning A, innehållande 1 x buffert, 3 ^ M GP4 hexamer, 6 iM ssDNA mall, 0,6 mM dNTP, 1 mM CTP och 2 nM [γ- 32p] ATP. Förbered 400 mikroliter av lösning B, som innehåller 1x buffert och 20 mM MgCl2.
- Snabb-kylningsflödesdrift
- Utföra reaktioner såsom beskrivs i steg 2,2. Om så önskas, tillsätt T7 DNA-polymeras eller T7 enkelsträngat-DNA-bindande protein vid en koncentration av 15 ^ M och 20 | iM, respektive. I detta fall, förlängningsprodukterna ansamlas vid en tidpunkt system som möjliggör manuell provtagning av reaktionen.
4. Dataanalys
- Fit produkt förloppskurvor till icke-linjär minst-torg modeller med kommersiellt tillgänglig programvara kan minsta kvadrat passar och / eller numerisk integration. Detaljerna för driften kommer att variera med den programvara som används, men nedan är generaliserade former av ekvationer som används för anpassning av data.
- Bestämma graden av produktbildning av flera omsättning primer syntesreaktioner genom att montera framsteg kurvor till en linjär ekvation. Om det finns en betydande krökning, använder den ursprungliga satsen metoden 13, 14 genom anpassning av data till en enda-exponentialfunktion: y = A (e - k t), där y är den produktkoncentrationen, A är reaktions amplitud, är k den observerade hastighetskonstanten, t är tiden i sekunder. Lutningen hos tangentlinjen vid tiden = 0 är den ursprungliga satsen.
OBS: Fit pre-steady state primer syntesreaktioner till en linjär ekvation eller till pre-steady state brast ekvationen y = A (e - k buRST t) + takt ss t, där A är reaktions amplitud, är k sprack den observerade hastighetskonstanten för pre-steady state sprack, är hastighets ss steady-state hastighet ss = k katt [Enzyme]), t tid , i sekunder. Montera enda omsättning primer syntesreaktioner framsteg kurvor på en enda exponentiell funktion y = A (e - k t). I fallet med GP4, passar data genom numerisk integration 15, till en modell med tre NTP kondens steg, där varje mellan är i jämvikt med enzymet, genom att använda kommersiellt tillgänglig programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultat som visas i figur 1A erhölls såsom beskrivits i steg 1 i protokollet, det vill säga genom att manuellt sampla en primer syntesreaktion som katalyseras av GP4 enligt flera omsättningsförhållanden. Här kan observeras en rad produkter efter gelelektrofores med hjälp av CTP märkt med 32p vid α-ställning i primer syntesreaktioner (Figur 1A). Den märkta prekursorn, CTP, visar den högsta rörlighet och migrerar mot botten av gelén, följt av långsammare vandrande Species som motsvarade den di-, tri-, och tetraribonucleotides syntetiserade av GP4. Beroende på längden av inkubation och schablonsekvens sammanhang, kan observeras ytterligare märkta produkter som motsvarar högre oligomerer (pentaribonucleotides, etc.). En reaktions framsteg kurva plottas genom att först bestämma koncentrationen av fullängds primers (det vill säga, tetra-och pentaribonucleotides) vid varje tidpunkt och plottning av koncentrationen av primrar syntetiserade som en funktion av tiden.
Medan erhålla data från steady-state, är relativt lätt flera omsättning experiment innehållet i datainformation är något begränsad, eftersom data i hög grad definieras av substratbindning och produktlansering händelser, dvs., Dominerar dessa händelser normalt eller kraftigt bestämma K M och kcat-värden 16. Om reaktionen observeras vid korta nog tidpunkter, innan steady-state är etablerad (med andra ord, före steady state) kan mycket större informationsinnehåll härledas från kinetiska experiment. Undersökning av reaktioner i pre-steady state kan ge en guldgruva av information. Till exempel om en "pre-steady state burst" av produktbildning observeras, är det bra indikation på att produkten release är ett hastighetsbegränsande steg in reaktionen. Vidare kan en extrahera hastigheten för produktbildning (eller kemin steget) från pre-steady state fasen av reaktionen. Däremot om en explosion av produktbildning inte observeras, då det finns bevis för att det stationära tillståndet hastigheten är begränsad antingen av den kemiska steg, eller ett steg som föregår den och att frisättningen av produkten är snabb i jämförelse.
När en snabbkylnings instrument används för att undersöka reaktionen katalyseras av GP4 i tidsskalor i intervallet sekunder ner till några millisekunder (steg 2 i protokollet), är det uppenbart att primer ansamling är inte linjär, men visar en bifasisk profilen (Figur 1B, heldragen linje). Detta är ett diagnostiskt resultat som visar bevis för en pre-steady state explosion av produktackumulering, vilket tyder på att produktbildningen är snabb och att frisättning är hastighetsbegränsande i det stationära tillståndet. Andra enzymsystem kan inte visa dettabeteende. Till exempel är en hypotetisk framsteg kurva presenteras som skulle bli resultatet om primer bildning genom GP4 inte fortskred med en pre-steady state skur (Figur 1B, prickad linje). I fall som dessa, skulle tolkningen vara att produktbildning, eller ett steg som föregår den, är det hastighetsbegränsande steget.
Annan utföringsform av pre-steady state-kinetik är den enkel omsättningen experiment där en låg koncentration av märkt substrat är bundet av mättande mängder av enzym (såväl som DNA och CTP, i fallet med GP4). Denna typ av experiment är unikt anpassad för att ge information om bildning och sönderfallet av mellanliggande arter under omvandlingen av substrat till produkt. I GP4-katalyserade reaktionen (steg 3 i protokollet), är primer bildning resultatet av tre nucleotidyl överföringsreaktioner. Nyligen använde vi en enda omsättning primer syntesreaktioner att avslöja informationom primer intermediärer 8 (figur 1C) genom att passa den tidsberoende ackumulering och försvinnandet av de di-, tri- och tetraribonucleotide produkter till en sekventiell modell av tre nucleotidyl överföringssteg, där ribonukleotid mellanprodukter är i jämvikt med GP4.
Figur 1: Kinetic analys av primer-syntes genom T7 primas-helikas. (A) tidsförloppet för primer bildning genom GP4 på en ssDNA med en enda PRS. Prover avlägsnades före tillsats av MgCl2 (tid = 0) och samplas vid intervaller efter dess tillsats. Produkter är indikerade till vänster om gelén bilden. (B) Fast linje: Primer bildning genom GP4 uppvisar en pre-steady state sprack. Värden är medelvärdet av minst tre oberoende experiment. prickade line: Representation av en reaktions framsteg kurva om GP4-katalyserade reaktionen genomfördes utan en pre-steady state sprack. Modifierad från 8. (C) Single-omsättningen primer syntes genom GP4. Vänster: tidsförloppet för tetramer bildning. Höger: tomt på mellanbildning som funktion av tiden. Värden är medelvärdet av minst tre oberoende experiment. Data passa genom numerisk integration; heldragna linjerna visar passformen. Modifierad från 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigaste faktorn i att utföra dessa experiment är tillgången på högaktiv renat enzym. Under vårt arbete med GP4, till exempel, fann vi att lagring av det renade enzymet i buffert (20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) innehållande 50% glycerol vid -20 ° C leder till en minskning av den specifika aktiviteten av preparatet under några månader. Därför har vi nu flash-frysa små alikvoter av renat GP4 i 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, och 10% glycerol med användning av flytande kväve och förvara dem vid -80 ° C. När du använder flödesinstrumentet snabba släcka, särskilt under förvärv av de första proven, är det viktigt att låta reaktanterna för att nå reaktionstemperaturen (rumstemperatur) före start av reaktionen. Dessutom bör stor försiktighet iakttas för att rengöra slangen (steg 2.2.4 i protokollet) efter varje tidpunkt, eftersom återstående dämpningsreagens ilinjen kommer att kraftigt hämma enzymaktivitet, vilket leder till felaktiga resultat. Ett annat övervägande involverar sammansättningen av polyakrylamidgel och dess hantering. Produkterna i primer syntesreaktioner katalyserade av GP4 inte löser väl i geler med mindre än åtminstone 20% akrylamid. I själva verket, i 15% geler, nukleotiden substratet och alla reaktionsprodukter migrerar som ett otydligt zon av radioaktivitet. Därför är det mycket lämpligt att justera procentandelen av akrylamid i enlighet med om små ribonukleotid produkter skall analyseras. En stor nackdel med användning av geler innehållande en hög procentandel av akrylamid är att de inte fäster ordentligt på papper; därför stor försiktighet måste användas för att överföra dem till kromatografi papper för torkning. Slutligen geler innehållande en hög procenthalt av akrylamid tenderar att spricka i vakuumdrivna gel torkar. Vi finner att sänkning av torkningstemperaturen till 65 ° C leder till mindre krackning av geler. Alternativt kan gelerna utsättas för PhosphorImager skärmar utan torkning.
Det finns ett stort antal variationer i reaktionsbetingelser och reagens som kan testas med hjälp av detta protokoll, och som vi bedriver i våra studier av GP4, från att testa den enzymatiska beteende mutantenzymer, undersöka effekten av tillsats av förmodade små molekyl hämmare eller aktivatorer, eller alternativa substrat, såsom nukleotidanaloger, samt alternativa DNA-mallar, eller metalljoner kofaktorer. Protokollet som beskrivs ovan använder rumstemperatur som reaktionstemperatur. Om en annan reaktionstemperaturen önskas, de flesta snabb dämpningen instrument innehåller en ventil som gör att man kan ansluta instrumentet till en värmereglerat vattenbad. I de fall där elektroforeproduktseparation inte är tillfredsställande, i synnerhet om reaktionsbufferten innehåller en hög koncentration (> 200 mM) av salt, är det lämpligt att behandla proverna efter släckning med 1-10 enheter av alkaliskt fosfatas och inkubera vid 37 ° C under minst 30 minuter. Detta kommer att ta bort terminal trifosfater från NTP och ribonukleotid produkter och öka deras elektroforetisk separation. Detta är emellertid endast praktiskt om nukleotiden är märkt vid α position.
Användning av en snabbkylnings instrument är inte bekvämt för hög genomströmning analys. En erfaren användare kan utföra snabbkylningsflödes protokoll som beskrivs här, från provberedning, samla cirka 18 tidpunkter, och rengöring av instrumentet i ungefär två timmar. En ytterligare tidspress är den tid som krävs för gelelektrofores, gel exponering, och dataanalys. En annan begränsning är att en typisk experiment kräver 500 till 1000 mikroliter av reaktionsvolymen, och erhållande av tillräcklig enzym skulle kunna vara utmanande i fallet med proteiner som inte uttrycks effektivt.
Det finns ett stort intresse för att utveckla analyser som möjliggör high-throughput screening av primase aktivitet, i synnerhet för att utveckla nya antibakteriella läkemedel 17, 18. Trots framsteg i utvecklingen av icke-radioaktiva, kontinuerliga tester för primas aktivitet, dessa analyser lider av två stora begränsningar och därmed hindra deras användning i snabba kinetiska undersökningar, det vill säga, saknar tillräcklig tidsupplösning och produkt känslighet. Därför är den radioaktiva, diskontinuerlig analys som beskrivits här för närvarande den högsta standarden inom den kinetiska undersökningen av primasaktivitet genom GP4, och DNA primases i allmänhet. Mer sofistikerade utföringsformer av det protokoll som beskrivs här kan användas vid bestämningen av den kinetiska reaktionsvägen av ett enzym-katalyserade reaktionen med användning av en snabb-kylningsflödesinstrument, t ex i puls-chase experiment avsedda för att bestämma den kinetiska avskärmning av substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C.
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
