Introduction
DNAの複製は、すべての細胞の生命の保存機能です。アイデンティティおよびレプリケーション・コンポーネントの数は広く変化するが、一般的なメカニズムが進化1間で共有されています。ここで、我々は、T7レプリソームのコンポーネントによってインビトロでラギング鎖DNA合成の動態を理解することを目的とした放射性基質を使用して、ゲルに基づく、不連続動態実験を記載します。バクテリオファージT7の複製機構は、4つのタンパク質（DNAポリメラーゼ、GP5、そのプロセッシング因子、 大腸菌チオレドキシン、二官能性プライマーゼ、ヘリカーゼGP4、及び一本鎖DNA結合タンパク質、GP2からなる非常に簡単です。 5）2。この機能は、DNA複製に関与する保存された生化学的機構を研究するための魅力的なモデルシステムになります。
特別重点は、プライマーゼT7 DNA、criticaによりリボヌクレオチドプライマーの形成に配置されていますDNA合成の開始におけるL段階。また、一つは、反応混合物に含めることにより、T7 DNAポリメラーゼ、または他の複製タンパク質によって、これらのプライマーの使用を調べることができます。 T7プライマーゼ、ヘリカーゼ、GP4は、プライマーゼ認識部位、またはPRS（5'-GTC-3 '）と呼ばれる特定のDNA配列においてDNA合成のためのプライマーの形成を触媒します。 PRS中のシトシンは、サイトの認識のために不可欠であり、不可解ですが、それが製品3にコピーされていません。 GP4によるプライマー合成の最初のステップは、その後トリマーに、そして最終的にpppACCC、pppACCA、またはpppACACは、テンプレート4の配列に依存し、機能テトラヌクレオチドプライマーに拡張されたジヌクレオチドpppAC、の形成を含みます。これらのプライマーは、その後もGP4支援プロセス5,6でDNA合成を開始するために、T7 DNAポリメラーゼによって使用することができます。この点において、プライマーゼドメインは、それらの解離を防止する、テンプレートを使用して非常に短いtetraribonucleotidesを安定させるポリメラーゼ活性部位7にプライマー/鋳型の確保に資する方法でDNAポリメラーゼに係合します。これらの手順（RNAプライマー合成、ポリメラーゼへのプライマーのハンドオフ、および拡張子）はラギング鎖を複製するために複数のサイクルで繰り返され、リーディング鎖の複製と調整する必要があります。
ここに記載のアッセイは、高感度であり、適度な時間内に行うことができます。しかし、それらは比較的低いスループットと細心の注意が放射性物質の使用・廃棄に注意が必要です。で反応が進行する速度に応じて、1は、定常または前定常状態のいずれかで反応時間のコースの意味の分析のために適した時間スケールでサンプルを達成するために迅速な急冷装置を採用することがあります。最近、我々はevidencを提供するために、ここに記載のアッセイを使用しました岡崎フラグメントの開始におけるGP4のプライマーゼドメインからのプライマーのリリースの重要性の電子。さらに、当社は、効率的なプライマーの形成と利用8を促進する上で、タンパク質、gp2.5を結合T7一本鎖DNAのための調節的役割の証拠を発見しました。
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Protocol
注：このような手袋、安全メガネ、白衣、および適切なアクリルの盾として、を含むがこれらに限定されない、個人用保護具の使用を放射性物質の安全な使用、廃棄に関するすべての機関の規制に従ってください。
注：標準緩衝液は、40mMのHEPES-KOH、pHは7.5、50 mMのグルタミン酸カリウム、5mMのDTT、0.1mMのEDTA（このバッファは5倍の濃度で予備製）との各dNTP 0.3 mMの構成されています。 8、9、10に記載されるようにT7複製タンパク質が精製されます。単一T7プライマーゼ認識部位（5'-GGGTC-3 '、5'-GTGTC-3'、5'-TGGTC-3 '）を含む一本鎖DNAは、DNA合成会社の様々な（長さから購入することができます一本鎖DNAは、T7プライマーゼのために、選択した酵素に依存し得る、ペンタマーは、全長プライマーを合成するための最小テンプレートの長さである1潜在Cが必須であるように、プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される場合に1が、しかし、追加のヌクレオチドが鋳型の3 '末端に存在しなければなりません。反応を10mMのMgCl 2の最終濃度の添加によって開始し、25℃でインキュベートします。マニュアルサンプルは、5秒以上の時間点に適しています。それよりも短い時間ポイントが必要な場合には、正確なデータを得るために、急速クエンチフロー機器を使用することが推奨されます。
マニュアルサンプリング1.マルチターンオーバープライマー合成反応
- 実験を開始する前に、ホルムアミド色素緩衝液のアリコート2μL（93％（v / v）のホルムアミド、50mMのEDTA、0.01％キシレンシアノール、および0.01％ブロモフェノールブルー）8 1.5 mLのポリプロピレンチューブに。一般に、管の数は、分析時点の数に等しいです。
- バッファー（1x）からなる20μLの混合物、0.1 mMのATPとCTP、0.25 mCiの/ mLの[α-32 P] CTP、0.1μMSSDを準備（六量濃度として表現 - 0.6μMモノマー）NAテンプレート、および0.1μMGP4。
- 5分間、室温で混合物をインキュベートします。
- ピペットを用いて混合物の2μLを削除し、無反応制御（時間ゼロ）のためのステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに2μLのホルムアミド色素バッファーと混合。
- （10mMの最終濃度）を反応混合物に0.1 MのMgCl 2の2μLを追加します。
- 手動で10秒間隔でピペットを用いて反応混合物の2μLのサンプルを撤回し、ステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに予め分配ホルムアミド染料と混合します。
- ヒートブロックで5分間95℃で熱サンプル。
- 変性ゲル上にサンプルのアリコートをロードします。ビスアクリルアミド（19：1）、3 M尿素、1×TBE（100mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）T7プライマーゼによって合成された小さなtetraribonucleotideプライマー製品は、0.4ミリメートルの厚さの25％アクリルアミドでうまく解決されます。
- chromatograにゲル全体を置きますプラスチック製のラップでPHY紙とカバー。ゲル乾燥機を使用して乾燥ゲル。
- サンプルの4μLをロードした場合、反応混合物の残りの希釈系列を準備し、クロマトグラフィー紙上にゲル上にロードされた同じボリュームを発見、 すなわち 、希釈のスポット4μL。
注：これは、反応の間に形成された生成物の濃度を決定するための標準曲線となります。 （5 2 -5 6）15,625が、希釈物べきたとえば、TE緩衝液（10mMトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）を用いて5倍希釈を1に1:25の範囲にわたる、うまく機能します活動のレベルに応じて調整します。 - ホスホイメージャ画面を使用して乾燥ゲルと標準を公開します。希釈系列で放射能を定量化し、8が記載されているように、標準曲線を作成、12
注：反応混合物のT7 DNAポリメラーゼを含めることは、一つのEXAすることができこの酵素による鉱山tetraribonucleotideプライマーの使用を。最適には、ポリメラーゼ濃度は、データの解釈を簡素化するために飽和されるべきです。 0.4μM以上のポリメラーゼ濃度は、良好な結果を与えます。さらに、そのような一本鎖DNA結合タンパク質などの他のタンパク質の効果は、プライマー合成またはラギング鎖開始のいずれかで、このようにして調べることができます。
ラピッドクエンチ機器の使用2.マルチターンオーバープライマー合成反応
- 反応混合物の調製
- 0.5 mCiの/ mLの[α-32 P] CTPを含むバッファー（1x）、0.2μMGP4六、0.2μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、0.2 mMのATPとCTPを（含む、A液の400μLを準備します。
- バッファー（1x）および20mMのMgCl 2を含む、溶液Bの400μLを準備します。
- 急速クエンチフロー機器の操作
- ラップをオンにしますID-クエンチフロー機器;メインメニューが表示された後、楽器キーボードのタイプ7はホームポジションにシリンジポンプを移動します。
- 「LOAD」にオープンバッファシリンジ位置。
- ローディングバッファーシリンジ
- ドライブシリンジポートにバッファを含む10 mLシリンジを取り付けます。 「LOAD」にシリンジノブの位置を変更します。
- 10 mLのシリンジを用いて、10 mMトリス、pHは7.5、1 mMのEDTAを用いて器具バッファリザーバA及びBを充填し、クエンチ液（250mMのEDTA、および0.2％SDS）を用いて注射器Cを満たします。 inとoutプランジャーを押すことにより気泡を除去。
- 「FIRE」にノブの位置を変更します。シリンジポンプバーの位置を調整するタイプ2。プレスバッファが出口ループから出てくるまで、注射器を下げるためにボタンを「DOWN ADJUST」：（継続的にダウン7は-進み、8-大きなステップダウン; 9-小さなステップダウン）。メインメニューに戻るには「ESC」と入力します。
- ウォッシュチューブ
- ATT真空へのACHの出口ライン。サンプルのノブに「FLUSH」に変更します。水平位置にノブを設定して閉じるバッファ用シリンジ。真空をオンにして、10秒間のH 2 Oで2フラッシュループを浸し、その後10秒間MeOHに浸し。 〜15秒間、または乾燥するまで空気を吸引することにより、ドライループ。
- 読み込んサンプル
- サンプルノブの位置は、「LOAD」に変更します。 1 mLのシリンジに溶液Aを配置します。サンプルロードポートのいずれかに注射器を差し込みます。溶液Bのために繰り返し、反対側のサンプルのロードポートに配置します。
- 時点のコレクション
- メインメニューで、クエンチフロー実行のタイプ1。反応時間（秒）を入力し、Enterキーを押し、「ENTER」。使用する反応ループ回数が表示されます。必要な反応ループに切り替えます。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。
- 「LOAD」にサンプルのノブを回します。負荷反応は、ちょうど中央混合室の外側まで、サンプルループをミックス。 FIR」にすべてのノブを回してE "は。すべてのツマミが正しい位置にあることを確認します。
- 出口ループの最後に1.5 mLのチューブを置きます。押して反応を実行するために「GO」。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。彼らはドライバーを打つまで、バッファの注射器のAとBをリロードします。
- 所望の各時点での手順を繰り返し2.2.6.2-2.2.6.3。例外：開始試薬ゼロ時点のコントロールを急冷（ すなわち 、この場合のMgCl 2）を含む溶液をロードしないでください。
- サンプルを収集が終了したら、メインメニューに戻るには「ESC」を入力します。押して「7」は、そのホームポジションにバッファシリンジポンプを返します。
- インストゥルメントのクリーンアップ
- 反応混合物の注射器を取り外します。 「LOAD」の位置にサンプルローディングノブを回します。真空下、10 mLの0.3 NH 3 PO 4および10mLのMeOH、続いて10 mLの0.2 N NaOHで各サンプルループを、洗います。
- 「LOAD」の位置に注射器のつまみを回します。すべての3 SYRを押し下げますインゲプランジャは、反応やクエンチバッファーを取得します。ウォッシュは、少なくとも2倍の5mLのH 2 Oで注射器。
- 5mLのH 2 Oで再びシリンジを記入し、「FIRE」の位置にノブを回します。ノブの位置を変更し、ステップ2.2.4のようにフラッシュのH 2 Oを除去するために、真空をオンにします。楽器の電源をオフにします。
注：手順1.7から1.12に記載されているように製品を分析しています。また、T7 DNAポリメラーゼおよび他の複製タンパク質は、プライマー合成または伸長に対する効果を分析するために反応混合物に添加することができます。
3.シングルターンオーバープライマー合成反応
注：シングルターンオーバープライマー合成/伸長アッセイは、いくつかの主要な違いは、複数のターンオーバー反応と同様に実施されています。これらのアッセイは、プライマーまたは拡張製品に放射性標識されたATPの変換に従う、しかし基質の濃度およびタンパク質はconsideraありますBLY高いです。また、プライマー合成反応の分析を可能にするために、ミリ秒の分解能を達成するために、一方が急速クエンチフロー・マシンを利用しなければなりません。
- 反応混合物を調製します。
- 1×緩衝液を含む、A液の400μLを準備し、3μMGP4量体、6μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、1 mMのCTP、および2 nMの[γ-32 P] ATP。バッファー（1x）および20mMのMgCl 2を含む、溶液Bの400μLを準備します。
- 急速クエンチフロー操作
- ステップ2.2で説明したように反応を行います。必要であれば、それぞれ、15μMおよび20μMの濃度で、T7 DNAポリメラーゼまたはT7一本鎖DNA結合タンパク質を追加します。この場合には、伸長生成物は、反応の手動サンプリングを可能にする時間体制で蓄積します。
4.データ解析
- 非線形least-にフィット製品プログレス曲線最小二乗フィットおよび/または数値積分することのできる市販のソフトウェアを使用して正方形モデル。動作の詳細は、使用するソフトウェアによって変化しますが、以下のデータをフィッティングするために使用される方程式の一般形であるだろう。
- 線形方程式にカーブを進行するために適合させることによって、複数の代謝回転プライマー合成反応の生成物形成の速度を決定します。かなりの曲率がある場合、単一指数関数にデータを当てはめることにより初速度法13、14を使用する ：Y = A（E - Tを K）yは、生成物濃度であり、Aは、反応の振幅であり、kは観察された速度定数、tは時間（秒）です。時間= 0における接線の傾きは、初速度です。
注： - k個 府線形方程式にまたは前定常状態バースト方程式y = A（Eへ前定常状態のプライマー合成反応をフィットAは反応振幅で第1のT）+レートSS tは、k個の バーストは、前定常状態のバーストのために観察された速度定数であり、レートssは定常状態速度SS = の k cat [酵素]）であり、tは時間であります、 すぐに。シングルターンオーバープライマーの合成反応は、シングル指数関数y = A（ - トンを K E）に進行曲線フィット。 GP4の場合には、市販のソフトウェアを使用して、各中間体は、酵素と平衡状態に。3つのNTP縮合段階でモデルに、数値積分15によってデータをフィット。
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Representative Results
手動多代謝回転条件下GP4によって触媒されるプライマーの合成反応をサンプリングすることによって、 すなわち 、プロトコルのステップ1に記載したように、図1Aに示した結果が得られました。ここで、ゲル電気泳動後の製品の範囲は、プライマー合成反応（ 図1A）内のα位の32 Pで標識されたCTPを用いて観察することができます。標識前駆体、CTPは、最も高い移動度を示し、GP4によって合成遅い移行ジ、トリに対応する種、およびtetraribonucleotidesに続くゲルの底部に向かって移動します。インキュベーションの長さ、および鋳型配列の文脈に応じて、より高いオリゴマー（pentaribonucleotides、 等 ）に対応する付加的な標識された製品を観察することができます。反応進行曲線は、最初の完全長のプライマーの濃度（即ち、テトラを決定することによって、プロットされそして、pentaribonucleotides）各時点における、時間の関数として合成したプライマーの濃度をプロットします。
定常状態、多代謝回転実験からのデータを得ることが比較的容易であるが、データの情報内容が多少制限されているデータが大幅基質結合および製品リリースイベント、 すなわち、によって定義されるように、これらのイベントは、典型的には、支配または大いに決定しますK Mとの k catは 、16値 。定常状態が確立される前に反応が、十分に短い時間点で観察された場合（つまり、前定常状態）はるかに大きな情報量が運動実験から導出することができます。前定常状態での反応の検査は情報の宝庫を提供することができます。生成物形成の「前定常状態のバースト」が観察される場合、それは、製品放出が律速段階であるという良好な指標であるI反応をn個。さらに、一つの反応の前定常状態相から生成物形成の速度（または化学工程）を抽出することができます。生成物形成のバーストが観察されない場合は対照的に、定常状態速度は、化学的工程、またはそれに先行する工程で、生成物の放出を比較して迅速であることも限定されることの証拠です。
急速クエンチ器具は、数ミリ秒（プロトコルのステップ2）までの秒の範囲の時間スケールでGP4によって触媒される反応を調べるために使用される場合、プライマーの蓄積は線形ではないことは明らかであるが、二相性を表示します（ 図1B、実線）プロファイル。これは、生成物の形成が迅速であり、その放出が律速定常状態であることを示唆している生成物の蓄積の前定常状態のバーストの証拠を示す診断結果です。他の酵素系はこれを表示されないことがあります動作。例えば、仮定の進捗曲線はGP4によるプライマー形成は前定常状態のバースト（ 図1B、点線）で進行しなかった場合に生じるであろうその提示されています。このような場合、解釈はその生成物の形成になる、またはそれに先行するステップは、律速段階です。
前定常状態の動力学の別の実施形態は、標識された基質の低濃度（GP4の場合、並びにDNA及びCTP）酵素の量を飽和させることにより結合されているシングルターンオーバー実験です。実験のこのタイプは、一意の製品への基質の変換中に中間体種の形成と減衰に関する情報を提供するために適しています。 GP4触媒反応（プロトコールのステップ3）において、プライマー形成が3ヌクレオチジル転移反応の結果です。最近、我々は、情報を明らかにするために、シングルターンオーバープライマー合成反応を使用しリボヌクレオチド中間体は、GP4と平衡状態に3つのヌクレオチジル転写工程の連続モデルにジ- 、トリ- 、及びtetraribonucleotide製品の時間依存的蓄積および消失を嵌合することにより、プライマー中間体8（ 図1C）に関する。
図1：T7 プライマーゼ・ヘリカーゼによるプライマー合成の動態解析。 （A）単一PRSとのssDNA上GP4によるプライマー形成の時間経過。サンプルは、前のMgCl 2（時間= 0）の添加を除去し、その添加後の間隔でサンプリングしました。生成物は、ゲル画像の左側に示されています。 （B） 実線 ：GP4によってプライマー形成は、前定常状態のバーストを示します。値は少なくとも3回の独立した実験の平均です。 点線リットル伊根：反応進行曲線の表現は、GP4触媒反応は、前定常状態のバーストなしで進行している場合。 8から修正されました。 （C）GP4によって、シングルターンオーバープライマー合成。 左 ：四量体形成の時間経過。 右 ：対時間中間体形成のプロット。値は少なくとも3回の独立した実験の平均です。データは、数値積分によりフィットさせました。実線はフィット感を示しています。 8から修正されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
これらの実験を行う際に最も重要な要因は、高活性精製された酵素の利用です。 GP4との作業中に、例えば、我々は、-20℃で50％グリセロールを含むそのバッファ中の精製酵素の貯蔵（20 mMリン酸カリウム、pH7.4中、0.1mMのEDTA、1mMのDTT）に見出さはの減少をもたらします数ヶ月にわたる準備の具体的な活動。したがって、我々は今、精製25mMトリス - 塩酸、pH7.5の、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、1mMのTCEPでGP4、および10％グリセロールのフラッシュ凍結小分けし、液体窒素を使用して、-80℃で保管してください。特に、最初のいくつかのサンプルの取得中に、急速クエンチフロー機器を使用しながら、その反応物は、反応前に開始し、反応温度（室温）に到達させることが重要です。また、細心の注意を十分に残っている消光試薬として、各時点の後、チューブ（プロトコールのステップ2.2.4）をきれいにするために取られるべきですラインが大幅に誤った結果をもたらす、酵素活性を阻害します。別の考慮事項は、ポリアクリルアミドゲルとその取り扱いの組成物を含みます。 GP4によって触媒プライマー合成反応中の製品は、以下の少なくとも20％のアクリルアミドを有するゲルでうまく解決されません。実際には、15％ゲル中で、ヌクレオチド基質及び全ての反応生成物は放射能の不明瞭な領域として移動します。小さなリボヌクレオチド産物が分析される場合、したがって、それに応じて、アクリルアミドの比率を調整することが非常に賢明です。アクリルアミドの高い割合を含有するゲルを使用することの主な欠点は、紙に十分に付着しないことです。したがって、細心の注意は、乾燥のために紙をクロマトグラフィーにそれらを転送するために使用されなければなりません。最後に、アクリルアミドの高い割合を含有するゲルは、真空駆動のゲルドライヤーでクラックする傾向があります。 65乾燥温度を下げる°Cにゲルのより少ない分解をもたらすことを我々見つけます。あるいは、ゲルは、蛍光体に露出させることができます乾燥させないイメージャの画面。
変異酵素の酵素的挙動を試験するに至るまで優れたこのプロトコルを使用して試験することができる反応条件および試薬の変化の数、及びその我々はGP4の我々の研究に進めているが、推定上の小規模の添加の影響を調べ、ありますそのようなヌクレオチド類似体、ならびに代替的なDNAテンプレート、または金属イオン補因子などの分子の阻害剤または活性化剤、又は代替基質。上記のプロトコルは、反応温度として室温を使用しています。別の反応温度が所望される場合に、最も急速クエンチ機器は、一方が熱制御水浴に機器を接続することを可能にする弁を含みます。電気製品の分離は、反応緩衝液は、高濃度の塩（> 200 mm）を含んでいる場合は特に、満足のいくものではない場合には、アルカリホスファターゼの1-10単位でクエンチした後、サンプルを処理し、3でインキュベートすることをお勧めします少なくとも30分間、7℃です。これは、NTPをとリボ製品からターミナル三リン酸を除去し、その電気泳動分離を強化します。ヌクレオチドはα位置で標識されている場合は、これは実用的です。
急速クエンチ機器の使用法は、ハイスループット分析のために便利ではありません。経験豊富なユーザは、急速クエンチフロープロトコルを実行することができ、約18時間ポイントを収集、サンプル調製から開始し、ここで説明し、そして約2時間で器具を洗浄します。追加の時間制限は、ゲル電気泳動、ゲル曝露、およびデータ解析のために必要な時間です。別の制限は、典型的な実験は、反応体積の500〜1,000μLを必要とし、十分な酵素を得ることが効率的に発現されていないタンパク質の場合で挑戦することができたということです。
プリマのハイスループットスクリーニングを可能にするアッセイの開発に大きな関心があります特に、新規な抗菌治療17,18を開発するためにそれ自体活性。プライマーゼ活性のための非放射性の、連続的なアッセイの開発の進歩にもかかわらず、これらのアッセイは、2つの主要な制限を受け、従って、迅速な動態研究におけるそれらの使用を妨げる、 すなわち 、十分な時間分解能と製品感度を欠いています。したがって、ここで説明する放射性、不連続アッセイは、一般的には、現在GP4によって、プライマーゼ活性の動態調査におけるゴールドスタンダードであり、およびDNAプライマーゼ。ここで説明されたプロトコルのより洗練された実施形態は、基板の運動区分を決定することを意図し、パルスチェイス実験において、例えば、急速クエンチフロー機器を用いて、酵素触媒反応の速度論的経路の決意に使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
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