滞后链DNA合成的动力学研究体外由T7噬菌体复制蛋白

Summary

我们描述了灵敏的、基于凝胶的不连续测定，以使用噬菌体 T7 的复制蛋白检查滞后链起始的动力学。

Abstract

这里我们提供了通过噬菌体 T7 的复制蛋白在体外对滞后链 DNA 合成进行动力学检查的方案。T7 复制体是已知最简单的复制系统之一，仅由四种蛋白质组成，这对于生化实验来说是一个有吸引力的特征。特别强调 T7 引物酶-解旋酶合成核糖核苷酸引物，DNA 聚合酶使用核糖核苷酸引物来启动 DNA 合成。因为 DNA 复制的机制在进化过程中是保守的，所以这些协议应该适用于使用其他模型系统的研究人员，或作为概念跳板。此处描述的方案具有高度敏感性，经验丰富的研究人员可以在大约一天内进行这些实验并获得用于分析的数据。唯一需要的专用设备是快速淬火流仪，但这种设备相对常见，可以从各种商业来源获得。然而，这些分析的主要缺点包括使用放射性和相对较低的通量。

Introduction

DNA的复制是所有细胞生命的一个保守的特征。而复制组件的特性和数量有很大的不同，一般机制跨越进化¹共享。这里，我们描述了基于凝胶的，不连续的动力学实验，使用的放射性底物，旨在通过T7启动复制体的组分理解体外滞后链DNA合成的动力学。 T7噬菌体的复制机制是很简单的，仅由四种蛋白质（DNA聚合酶，GP5，其持续合成因子， 大肠杆菌硫氧还蛋白，双官能引发酶-解旋GP4，和单链DNA结合蛋白，GP2的。 ^5）2。这一特性使得它来研究参与DNA复制保守的生化机制有吸引力的模型系统。

特别强调的是由T7 DNA形成的核糖核苷酸引物引发酶，一个critica升步骤中的DNA合成的起始。此外，还可以通过将其包括在反应混合物中检查这些引物由T7 DNA聚合酶或其他复制蛋白的用法。 T7启动引发酶 - 解旋酶，GP4，催化的引物DNA的合成在称为引发酶识别位点，或者PRS特定的DNA序列的形成，（5'-GTC-3'）。在PRS胞嘧啶是隐蔽，它是用于识别站点的必需的，但它不被复制到产品^3。在引物合成的第一步由GP4涉及二核苷酸pppAC，然后扩展到三聚体，并最终官能四核苷酸引物pppACCC，pppACCA或pppACAC取决于序列在模板⁴的形成。这些引....

Protocol

注:按照有关放射性物质的安全使用和处置的所有机构的规定，包括但不限于个人防护装备的使用，如手套，防护眼镜，白大褂，和适当的丙烯酸盾牌。

注:标准缓冲液是由40毫米的HEPES-KOH，pH值7.5，50毫米钾谷氨酸，5毫摩尔DTT，0.1毫摩尔EDTA（以5倍浓度此缓冲区是预先定制的），每个的dNTP为0.3毫米的。 T7复制蛋白质如所述^8，9，10纯化。含有单一的T7引发酶识别位点（5'-GGGTC-3'，5'-GTGTC-3'，5'-TGGTC-3'）的单链DNA可以从各种不同的DNA合成公司（长度可购买的单链DNA可取决于所选择的酶，T7引发酶，五聚体是最小的模板长度以合成全长的引物¹1，作为隐蔽C是必不可少的，但是，如果该引物是要通过聚合酶延伸，额外的核苷酸必须出现在模板的3'末端。反应通过加入10mM的MgCl ₂的最终浓度的启动，并在25℃温育。人工取样工作得很好，5秒以上的时间点。如果需要的时间点比短，建议使用一个快速骤冷流速仪以获得准确的数据。

1.多成交引物合成反应由手工取样

Results

在协议中的步骤1， 即所述，通过手动采样多个周转条件下，通过GP4催化的引物合成反应获得图1A所示的结果。这里，凝胶电泳后的范围内的产品可以通过使用在引物的合成反应（ 图1A）的α位与³² P标记的CTP进行观察。标记的前体，CTP，显示出最高的流动性和向凝胶的底部，接着通过GP4合成对应于二，三较慢迁移的物种，和tetraribonucleotides迁移。根据孵化的长度，和模板序列的背景下，对应于高级低聚物（pentaribonucleotides 等 ）附加标记的产物可观察到。反应进展曲线是通过首先确定的全长的引物的浓度（即，四绘制和pentaribonucleotides）在每个时间点和绘图的合成作为时间的函数的引物的浓度。

同时，获得从稳态数据，多周转实验是比较容易的，该数据的信息内容.......

Discussion

在执行这些实验的最重要的因素是高活性的纯化的酶的可用性。在我们与GP4的工作，例如，我们发现，在缓冲液中纯化的酶的含50％甘油的存储（20mM磷酸钾，pH 7.4，0.1毫摩尔EDTA，1毫摩尔DTT）在-20℃导致减少制备过几个月的比活性。因此，我们现在在25mM的Tris-HCl，pH值7.5，50 mM氯化钠，0.1毫摩尔EDTA，1毫TCEP纯化GP4，和10％甘油的闪冻小等份用液氮并将其存储在-80℃。在使用快速淬火流仪，特别是采集前几个样品中，它以允许反应物达到反应温度（室温）下开始反应之前是重要的。此外，非常小心，应采取彻底清洗每个时间点之后的管（该协议的步骤2.2.4），如任何剩余淬火试剂在线路将极大地抑制酶的活性，从而导致错误的结果。另一考虑涉及聚丙烯酰胺凝胶和其处理的组合物。通过GP4催化引物合成反应的产品不会在凝胶少于至少20％的丙烯酰胺解决好。事实上，在15％的凝胶，所述核苷酸底物和所有反应产物迁移作为放射性的模糊的区域。因此，这是非常可取相应地调整丙烯酰胺百分比，如果小核糖产品进行分析。使用含有丙烯酰胺的比例很高是他们不坚持好纸胶的主要缺点;因此必须十分小心用于传送它们到色谱纸.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris 预设晶体 pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris 碱	SIGMA	93362
L-谷氨酸钾盐一水合	SIGMA	G1501
氯化镁六水合	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-二硫苏糖醇	J.T. Baker	F780-02
十二烷基硫酸钠	MP Biomedicals	811030
（乙烯二硝基） 四乙酸，二钠盐，二水合	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	放射性，采取防护措施
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	放射性，采取防护措施
100 mM dATP， dCTP， dGTP， dTTP	Affymetrix	77100	四个 dNTP 是
100 mM ATP 和 CTP	震中	RN02825	NTP 的一部分
ssDNA 构建	集成 DNA 技术	N/A	定制序列
甲醇	Macron Fine Chemicals	3017-08
甲酰胺	Thermo Scientific	17899
溴酚蓝	SIGMA	B8026
Cylene xyanol	适马	X4126
丙烯酰胺	SIGMA	A9099	Toxic
N，N′-亚甲基双丙烯酰胺	SIGMA	M7279	有毒
Urea	Boston Bioproducts	P-940
硼酸	Mallinckrodt Chemicals	2549
快速淬火流仪	Kintek 公司	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek 公司	N/A
Kaleidagraph	Synergy 软件	N/A