Introduction
DNA的复制是所有细胞生命的一个保守的特征。而复制组件的特性和数量有很大的不同，一般机制跨越进化1共享。这里，我们描述了基于凝胶的，不连续的动力学实验，使用的放射性底物，旨在通过T7启动复制体的组分理解体外滞后链DNA合成的动力学。 T7噬菌体的复制机制是很简单的，仅由四种蛋白质（DNA聚合酶，GP5，其持续合成因子， 大肠杆菌硫氧还蛋白，双官能引发酶-解旋GP4，和单链DNA结合蛋白，GP2的。 5）2。这一特性使得它来研究参与DNA复制保守的生化机制有吸引力的模型系统。
特别强调的是由T7 DNA形成的核糖核苷酸引物引发酶，一个critica升步骤中的DNA合成的起始。此外，还可以通过将其包括在反应混合物中检查这些引物由T7 DNA聚合酶或其他复制蛋白的用法。 T7启动引发酶 - 解旋酶，GP4，催化的引物DNA的合成在称为引发酶识别位点，或者PRS特定的DNA序列的形成，（5'-GTC-3'）。在PRS胞嘧啶是隐蔽，它是用于识别站点的必需的，但它不被复制到产品3。在引物合成的第一步由GP4涉及二核苷酸pppAC，然后扩展到三聚体，并最终官能四核苷酸引物pppACCC，pppACCA或pppACAC取决于序列在模板4的形成。这些引物然后可以通过T7 DNA聚合酶被用于启动DNA合成，这也是一个GP4辅助过程5,6。在这方面，引发酶域稳定极短的tetraribonucleotides与模板，防止其分解，以有利于保护底漆/模板到聚合酶活性位点7的方式从事DNA聚合酶。这些步骤（RNA引物的合成，引物越区切换到聚合酶和扩展）中重复多次循环复制后随链，必须与前导链的复制进行协调。
此处所描述的测定法是高度敏感的，并可以在一个温和的时间框架来执行。然而，它们是相对低的通量和必须十分小心以放射性物质的使用和处置行使。取决于在该反应进行时，人们可能会采用一种快速淬火仪在时间尺度适合用于在任一稳定或预稳态反应时间课程有意义的分析获得的样品的速度。最近，我们这里使用的描述测定提供我国证据的引物释放的从GP4的冈崎片段的开始时的引发酶域的重要性即此外，我们发现了为T7启动单链DNA结合蛋白，gp2.5调节作用的证据，在促进高效引物形成和利用8。
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Protocol
注：按照有关放射性物质的安全使用和处置的所有机构的规定，包括但不限于个人防护装备的使用，如手套，防护眼镜，白大褂，和适当的丙烯酸盾牌。
注：标准缓冲液是由40毫米的HEPES-KOH，pH值7.5，50毫米钾谷氨酸，5毫摩尔DTT，0.1毫摩尔EDTA（以5倍浓度此缓冲区是预先定制的），每个的dNTP为0.3毫米的。 T7复制蛋白质如所述8，9，10纯化。含有单一的T7引发酶识别位点（5'-GGGTC-3'，5'-GTGTC-3'，5'-TGGTC-3'）的单链DNA可以从各种不同的DNA合成公司（长度可购买的单链DNA可取决于所选择的酶，T7引发酶，五聚体是最小的模板长度以合成全长的引物11，作为隐蔽C是必不可少的，但是，如果该引物是要通过聚合酶延伸，额外的核苷酸必须出现在模板的3'末端。反应通过加入10mM的MgCl 2的最终浓度的启动，并在25℃温育。人工取样工作得很好，5秒以上的时间点。如果需要的时间点比短，建议使用一个快速骤冷流速仪以获得准确的数据。
1.多成交引物合成反应由手工取样
- 在实验开始前，试样2甲酰胺染料缓冲液（93％（体积/体积）甲酰胺，50毫摩尔EDTA，0.01％二甲苯蓝和0.01％溴酚蓝）转换成8 1.5毫升聚丙烯管中。在一般情况下，管的数目等于所分析的时间点的数量。
- 制备20微升混合物由1×缓冲液，0.1mM的ATP和CTP，0.25毫居里/毫升[α-32 P] CTP，0.1μMSSDNA模板和0.1μMGP4（表示为六聚体浓度 - 0.6μM单体）。
- 在室温下孵育该混合物5分钟。
- 除去使用移液器混合物2微升并在步骤1.1为无反应控制（时间零）制备的1.5毫升管2微升甲酰胺染料缓冲器混合。
- 加入2微升的0.1M的MgCl 2反应混合物（以10mM的最终浓度）。
- 在10秒的间隔手动收回使用移液器反应混合物2μL样品，并在步骤1.1编写的1.5 mL管predispensed甲酰胺染料混合。
- 在95℃下热样品在热块5分钟。
- 加载样品的等分试样到变性凝胶。由T7启动引发酶合成的小tetraribonucleotide底漆产品上的0.4毫米解析以及厚25％的丙烯酰胺：双丙烯酰胺（19：1），3M尿素，1×TBE（100毫摩尔Tris-硼酸盐，1mM EDTA）中。
- 放在整个chromatogra凝胶PHY纸，用保鲜膜覆盖。干凝胶使用凝胶干燥。
- 制备系列稀释的反应混合物的剩余部分，并当场加载的凝胶上色谱纸在相同体积， 即 ，发现稀释液4微升如果样品的4微升装载。
注意：这将作为标准曲线来确定在反应过程中形成的产物的浓度。例如，使用的TE缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH值8.0，1mM EDTA）中很好地工作，跨越一系列五倍稀释1:25到1：15625（5 2 -5 6），但稀释应根据活动的水平进行调整。 - 揭露使用磷光屏干胶和标准。量化在稀释系列中的放射性和描述8构建的标准曲线，12
注：T7 DNA聚合酶的夹杂物向反应混合物允许一个EXA矿井tetraribonucleotide引物，通过这种酶的使用量。最佳地，聚合酶浓度应饱和简化数据的解释。 0.4微米或更高的聚合酶浓度给出了良好的效果。此外，可以以这种方式被检验其他蛋白质，如单链DNA结合蛋白，在任引物合成或滞后链引发的效果。
2.多成交引物合成反应中，用快速淬火仪
- 反应混合物的制备
- 制备溶液A的400微升，含有1x缓冲液，0.2μM的GP4六聚体，0.2微米的ssDNA模板，0.6毫的dNTPs，0.2mM的ATP和CTP（含0.5毫居里/毫升[α-32 P] CTP。
- 制备400μL的溶液B，含有1x缓冲液和20mM的MgCl 2。
- 快速淬火流量仪表的操作
- 开启说唱ID-淬火流量仪表;出现主菜单之后，该仪器的键盘上键入7到注射器驱动器移动到原位置。
- 打开缓冲注射器位置“LOAD”。
- 装载缓冲注射器
- 附上含有缓冲驱动注射器端口10毫升的注射器。更改注射器旋钮位置“LOAD”。
- 使用10毫升注射器，填仪缓冲液储A和B用10mM的Tris，pH值7.5，1mM EDTA和填充骤冷溶液（250毫摩尔EDTA和0.2％SDS）中注射器℃。通过在进出推动柱塞除去气泡。
- 更改旋钮的位置，以“火”。 2型调整注射器驱动器杆的位置。按“向下调整”按钮，直到缓冲区出来的退出循环，以降低注射器（连续7-下降; 8大降压; 9小步向下）。键入“ESC”键，返回到主菜单。
- 清洗油管
- ATTACH出口管线至真空。更改样本旋钮“刷新”。由旋钮设定到水平位置附近的缓冲注射器。打开真空和浸2冲洗循环的H 2 O代表10秒，然后在甲醇浸10秒。干循环通过吮吸〜15秒的空气，或直至干燥。
- 装载样品
- 更改样本旋钮位置“LOAD”。将溶液A到1毫升注射器。注射器插入到样品负荷的港口之一。重复溶液B，并在相反的样品装载口放置。
- 的时间点采集
- 在主菜单中，对于淬火流运行1型。输入反应时间（s），然后按“ENTER”。反应循环使用数量将被显示。切换到所需的反应循环。在步骤2.2.4重复清洗过程。
- 打开样品旋钮“LOAD”。负载反应样品混合循环直到刚刚中央搅拌室外面。将所有旋钮“FIRE“，确认所有的旋钮都在正确的位置。
- 将1.5毫升管到出口环结束。按下“GO”，以运行反应。在步骤2.2.4重复清洗过程。刷新缓冲区注射器A和B，直到他们击中了司机。
- 重复步骤2.2.6.2-2.2.6.3为每个所需时间点。例外：请勿将包含启动试剂（ 如 ， 氯化镁在这种情况下）淬火零时间点控制时的解决方案。
- 当收集完样本，输入“ESC”键返回主菜单。按“7”到缓冲针筒驱动器返回到其初始位置。
- 仪器清理
- 除去反应混合物注射器。打开样品装载旋钮“LOAD”位置。在真空下，洗净用10ml 0.2N的氢氧化钠每个样品环，接着用10毫升0.3的NH 3 PO 4和10ml MeOH中。
- 打开注射器旋钮“LOAD”位置。向下按所有3个SYR英格柱塞检索反应和淬火缓冲区。洗涤用5毫升水2 O注射器至少两次。
- 用5毫升水2 O再次填充注射器和转旋钮“火”的位置。改变旋钮位置并打开真空，除去H 2 O.作为冲洗步骤2.2.4。关闭仪器。
按照步骤1.7-1.12描述分析产品：注意 。此外，T7 DNA聚合酶和其它复制蛋白可以在反应混合物中加入以分析其对引物合成或扩展的效果。
3.单成交引物合成反应
注：单成交引物合成/扩展试验也同样进行了多次失误的反应，有几个主要区别：这些试验遵循放射性标记的ATP到底漆或延伸产品的转化，基板但是浓度和蛋白质considera布莱高。另外，为了达到毫秒的分辨率，以使引物合成反应的分析，必须利用一个快速淬火流的机器。
- 反应混合物的制备。
- 准备溶液A 400微升，含有1x缓冲，3μMGP4六聚体，6μM单链DNA模板，0.6毫米的dNTP，1毫米CTP和2纳米[γ-32 P] ATP。制备400μL的溶液B，含有1x缓冲液和20mM的MgCl 2。
- 快速淬火操作流程
- 进行反应，如步骤2.2所述。如果需要的话，添加T7 DNA聚合酶或T7单链DNA结合蛋白在15μM和20μM的浓度，分别。在这种情况下，延伸产物积聚在允许用于反应的手动采样时间制度。
4.数据分析
- 配合产品进度曲线非线性least-使用市售软件能够最小二乘的配合和/或数值积分平方模型。操作的细节将随所使用的软件变化，但以下是用于拟合数据的方程的广义形式。
- 通过拟合进步曲线的线性方程确定的产物形成多个周转引物合成反应的速率。如果有显著曲率，通过将数据拟合到单指数函数使用初始速率方法13，14：Y = A（五- K t），其中y是产物浓度，A是反应振幅，k被所观察到的速率常数，t是时间，单位为秒。在时间= 0的切线的斜率是初始速率。
注：飞度前稳态引物合成反应的线性方程或预稳态突发方程Y = A（E - K BURST T）+率SS t，其中A是反应幅度，K 爆是预稳态突发观察到的速率常数，速率ss是稳态率SS = K 猫 [酶]），t为时间（秒）。适合单成交引物合成反应发展到一个单一的指数函数y = A曲线（E - K T）。在GP4的情况下，通过数值积分15拟合数据，以具有三个NTP缩合步骤，其中每个中间是在与酶平衡模型，使用市售的软件。
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Representative Results
在协议中的步骤1， 即所述，通过手动采样多个周转条件下，通过GP4催化的引物合成反应获得图1A所示的结果。这里，凝胶电泳后的范围内的产品可以通过使用在引物的合成反应（ 图1A）的α位与32 P标记的CTP进行观察。标记的前体，CTP，显示出最高的流动性和向凝胶的底部，接着通过GP4合成对应于二，三较慢迁移的物种，和tetraribonucleotides迁移。根据孵化的长度，和模板序列的背景下，对应于高级低聚物（pentaribonucleotides 等 ）附加标记的产物可观察到。反应进展曲线是通过首先确定的全长的引物的浓度（即，四绘制和pentaribonucleotides）在每个时间点和绘图的合成作为时间的函数的引物的浓度。
同时，获得从稳态数据，多周转实验是比较容易的，该数据的信息内容是比较有限的，因为数据在很大程度上受到基板限定的结合和产物释放事件， 即 ，这些事件通常支配或大大确定K M和K值猫 16。如果该反应是在足够短的时间点观察到的，在建立稳定状态之前（换句话说，在预稳态）大得多的信息内容可以从动力学实验得出。在预稳态反应的检查可提供的信息宝库。例如，如果观察到的产物形成“预稳态突发”，这是很好的迹象，产品发布是一个限速步骤我n中的反应。此外，一个可以提取的产物形成从反应的稳态前的状态相的速率（或化学工序）。相反，如果没有观察到的产物形成一个突发，那么它是证据表明稳态速率或者由化学步骤，或者它前面的步骤和产物的释放是在比较快速的限制。
当一个快速淬火工具用于检查在秒的范围中的时间尺度由GP4催化的反应降低到几毫秒（该协议的步骤2），显而易见的是，引物积累不是线性的，但显示的双相简介（ 图1B，实线）。这是一个诊断结果证明证据产物积累的预稳态突发，这表明产物形成是迅速并且释放是限速在稳定状态。其他的酶系统可能不显示本行为。例如，一个假想的进展曲线呈现，这将导致如果引物形成由GP4没有用前稳态突发（ 图1B，虚线）进行。在这些情况下，解释将是产物形成，或它前面的一个步骤，是限速步骤。
前稳态动力学的另一实施例是单周转实验，其中标记的衬底的低浓度由饱和酶的量结合（以及DNA和CTP，在GP4的情况下）。这种类型的实验是唯一适合提供关于底物向产物的转化过程中形成和中间物种的衰减信息。在GP4催化反应（该协议的步骤3），引物的形成是三个核苷酸基转移反应的结果。最近，我们采用单成交引物合成反应的披露信息关于引物的中间体8（ 图1C）由二，三，和tetraribonucleotide产品的依赖于时间的积累和消失拟合到三个核苷酸基转移步骤的顺序模型，其中，所述核糖核苷酸中间体与GP4平衡。
图1： 由T7引发酶-解旋酶的引物合成的动力学分析。 （A）中的引物形成由GP4上的单链DNA与单个PRS的时间过程。样品另外的MgCl 2（时间= 0）之前，除去间隔其加入以下采样。产品被指示给凝胶图像的左侧。 （ 二 ） 实线 ：底漆形成由GP4呈现出前稳态爆裂。值是至少三次独立实验的平均值。 虚线升INE：一个反应进展曲线的表示，如果GP4催化反应进行时没有的预稳态突发。从8修改。 （C）单成交引物合成由GP4。 左 ：四聚体形成的时间过程。 右 ：中间形成随时间变化的曲线。值是至少三次独立实验的平均值。数据通过数值积分适合;实线表示的配合。从8修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在执行这些实验的最重要的因素是高活性的纯化的酶的可用性。在我们与GP4的工作，例如，我们发现，在缓冲液中纯化的酶的含50％甘油的存储（20mM磷酸钾，pH 7.4，0.1毫摩尔EDTA，1毫摩尔DTT）在-20℃导致减少制备过几个月的比活性。因此，我们现在在25mM的Tris-HCl，pH值7.5，50 mM氯化钠，0.1毫摩尔EDTA，1毫TCEP纯化GP4，和10％甘油的闪冻小等份用液氮并将其存储在-80℃。在使用快速淬火流仪，特别是采集前几个样品中，它以允许反应物达到反应温度（室温）下开始反应之前是重要的。此外，非常小心，应采取彻底清洗每个时间点之后的管（该协议的步骤2.2.4），如任何剩余淬火试剂在线路将极大地抑制酶的活性，从而导致错误的结果。另一考虑涉及聚丙烯酰胺凝胶和其处理的组合物。通过GP4催化引物合成反应的产品不会在凝胶少于至少20％的丙烯酰胺解决好。事实上，在15％的凝胶，所述核苷酸底物和所有反应产物迁移作为放射性的模糊的区域。因此，这是非常可取相应地调整丙烯酰胺百分比，如果小核糖产品进行分析。使用含有丙烯酰胺的比例很高是他们不坚持好纸胶的主要缺点;因此必须十分小心用于传送它们到色谱纸进行干燥。最后，含有丙烯酰胺的高百分比的凝胶趋向于真空供电凝胶干燥器开裂。我们发现，降低干燥温度到65℃，导致凝胶的较少开裂。或者，该凝胶可以暴露于荧光粉成像屏幕无需烘干。
有在反应条件和试剂的变化，可以使用此协议被测试的一个很大的数目，并且其中我们追求在我们的GP4的研究中，从测试的突变体酶的酶的行为，检查除推定小型的效果分子抑制剂或活化剂，或替代基材，如核苷酸类似物，以及替代的DNA模板，或金属离子辅因子。上述协议使用室温的反应温度。如果另一个反应温度是需要的，最快速的淬工具包含一个阀门，允许一个将仪器连接到热控制的水浴。在电泳产物分离不令人满意，尤其是当反应缓冲液中含有高浓度（> 200毫米）的盐的情况下，最好是具有1-10单位的碱性磷酸酶淬火后处理的样品和在3孵育7℃下至少30分钟。这将删除从国家结核病防治规划和核糖核苷酸产品终端三磷酸和提高他们的电泳分离。但是，如果核苷酸被标记在α位，这是唯一可行的。
一种快速淬火仪器的使用是不方便的高通量分析。一个有经验的用户可以进行快速淬火流动这里描述的协议，从样品制备开始，收集大约18的时间点，并清洗仪器在约两个小时。一个额外的时间限制为凝胶电泳，凝胶曝光，和数据分析所需的时间。另一个限制是典型的实验中，需要反应体积为500〜1000微升，并且获得足够的酶可以是在没有被有效地表达的蛋白质的情况下，具有挑战性。
有在显影测定中，使表面的高通量筛选的极大兴趣本身活性，特别是开发新的抗菌疗法17,18。尽管在开发非放射性，连续测定法引发酶的活性的进步，这些测定从两个主要的限制的影响，从而妨碍它们的使用在快速动力学的分析， 即 ，缺乏足够的时间分辨率和产物的灵敏度。因此，这里所描述的放射性，不连续的测定法是目前金标准在由GP4引发酶的活性的动力学检查和DNA primases一般。这里所描述的协议的更复杂的实施例可以在使用快速骤冷流量仪表的酶催化的反应的动力学途径的测定中使用，例如，在打算确定衬底的动能分区脉冲追踪实验。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
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