Introduction
Replikationen af DNA er et konserveret egenskab ved alle cellulære liv. Mens identitet og antallet af replikation komponenter varierer meget, er de generelle mekanismer deles på tværs af evolution 1. Her beskriver vi gel-baseret, diskontinuerte kinetiske eksperimenter under anvendelse radioaktive substrater, der tager sigte på at forstå kinetikken af tilbagestående-DNA-syntese in vitro ved komponenter af T7 replisome. Replikation maskiner af bakteriofag T7 er meget enkel og består af kun fire proteiner (DNA-polymerasen, GP5, og dets processivitet faktor, E. coli thioredoxin, de bifunktionelle primase-helicase GP4, og det enkeltstrengede DNA-bindende protein, GP2. 5) 2. Denne funktion gør det til et attraktivt modelsystem til at studere de konserverede biokemiske mekanismer involveret i DNA-replikation.
Der lægges særlig vægt på dannelsen af ribonukleotid primere ved T7 DNA primase, en critical trin i initiering af DNA-syntese. Derudover kan man også undersøge brugen af disse primere ved hjælp af T7-DNA-polymerase eller andre replikationsproteiner ved at inkludere dem i reaktionsblandingen. T7-primase-helicase, GP4, katalyserer dannelsen af primere til DNA-syntese ved specifikke DNA-sekvenser kaldet primase genkendelsessteder eller PRS, (5'-GTC-3 '). Den cytosin i PRS er kryptisk, det er vigtigt for anerkendelse af hjemmesiden, men det er ikke kopieres ind i produkt 3. Det første trin i primer syntese ved GP4 involverer dannelsen af dinukleotidet pppAC, som derefter udvides til en trimer, og i sidste ende til funktionelle tetranukleotid primere pppACCC, pppACCA eller pppACAC afhængigt af sekvensen i skabelonen 4. Disse primere kan dernæst anvendes af T7-DNA-polymerase at initiere DNA-syntese, som også er et GP4-assisteret proces 5, 6. I denne forbindelse primasedomæne stabiliserer de ekstremt korte tetraribonucleotides med skabelonen, hindring af dissociering, indgriber DNA-polymerase på en måde bidrage til at sikre primer / skabelon i polymerase aktive sted 7. Disse trin (RNA primer syntese, primer handoff til polymerase, og udvidelse) er gentaget i flere cyklusser at kopiere halter streng og skal koordineres med replikation af de førende streng.
De her beskrevne assays er meget følsomme og kan udføres i en moderat tidsramme. Men de er relativt lav-throughput og stor omhu skal udvises i brug og bortskaffelse af radioaktive materialer. Afhængig af hastigheden, hvormed reaktionen forløber, kan man anvende et hurtigtvirkende quench instrument til at opnå prøver på tidsskalaer som kan underkastes en meningsfuld analyse af reaktionen tidsforløb i enten stabil eller præ-steady state. For nylig brugte vi assays beskrevet her for at give evidence af vigtigheden af primer frigivelse fra primase domæne GP4 i indledningen af Okazaki-fragmenter. Derudover fandt vi tegn på en regulerende rolle for T7 enkeltstrenget DNA-bindende protein, gp2.5, at fremme en effektiv primer dannelse og udnyttelse 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følg alle institutionelle regler om sikker brug og bortskaffelse af radioaktivt materiale, herunder, men ikke begrænset til, brug af personlige værnemidler, såsom handsker, sikkerhedsbriller, kittel, og passende akryl skjolde.
BEMÆRK: standard puffer består af 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kalium glutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (denne buffer er foruddefineret ved en 5x koncentration) og 0,3 mM af hver dNTP. T7 replikering proteiner oprenses som beskrevet 8, 9, 10. Enkeltstrenget DNA indeholder et enkelt T7 primase genkendelsessted (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') kan købes fra en række DNA-syntese selskaber (længden af ssDNA'et kan afhænge af enzymet af valg, for T7 primase, en pentamer er den mindste skabelon længde til at syntetisere et fuldlængde-primer 11, da det kryptiske C er imidlertid væsentligt, hvis primeren skal udvides ved hjælp af polymerase, yderligere nukleotider skal være til stede ved 3'-enden af templaten. Reaktioner initieres ved tilsætning af en slutkoncentration på 10 mM MgCl2 og inkuberet ved 25 ° C. Manuel prøvetagning fungerer godt for tidspunkter på 5 sekunder eller mere. Hvis der kræves tidspunkter kortere end det, anbefales det at bruge en hurtig-quench flow instrument til at opnå nøjagtige data.
1. Multiple-omsætning Primer Synthesis Reaktion ved manuel Sampling
- Før start af forsøget, aliquot 2 pi formamid farvestof puffer (93% (volumen / volumen) formamid, 50 mM EDTA, 0,01% xylencyanol og 0,01% bromphenolblåt) i 8 1,5 ml polypropylenrør. Generelt er antallet af rør er lig med antallet af tidspunkter analyseres.
- Klargør en blanding 20 uL bestående 1x buffer, 0,1 mM ATP og CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32P] CTP, 0,1 uM SSDNA skabelon, og 0,1 uM GP4 (udtrykt som hexamer koncentration - 0,6 uM monomer).
- Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 5 min.
- Fjern 2 pi af blandingen under anvendelse af en pipette og blandes med 2 pi formamid farvestof puffer i en 1,5 ml rør fremstillet i trin 1.1 for ingen reaktion kontrol (tid nul).
- Tilsæt 2 pi 0,1 M MgCl2 til reaktionsblandingen (til en slutkoncentration på 10 mM).
- Manuelt trække 2 pi prøver af reaktionsblandingerne bruger pipette ved 10 s intervaller og blandes med formamid farvestof afdelt i 1,5 ml rør fremstillet i trin 1.1.
- Heat prøver ved 95 ° C i 5 min i en varme blok.
- Indlæse alikvoter af prøverne på en denaturerende gel. De små tetraribonucleotide primer produkter syntetiseret af T7 primase løses godt på en 0,4 mm tyk 25% acrylamid: bisacrylamid (19: 1), 3 M urinstof, 1x TBE (100 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
- Placer hele gel på chromatography papir og dække med plastfolie. Tørre gel ved anvendelse af en gel tørrer.
- Der fremstilles en fortyndingsrække af resten af reaktionsblandingen og spot samme volumen fyldt på gelen på kromatografi papir, dvs. Spot 4 pi af fortyndingen hvis 4 pi prøve blev indlæst.
BEMÆRK: Denne vil tjene som standardkurven for at bestemme koncentrationen af produkter, der dannes under reaktionen. For eksempel fem gange fortyndinger under anvendelse TE-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA) fungerer godt, spænder over en række 1:25 til 1: 15.625 (5 2 -5 6), men de fortyndinger bør justeres afhængig af aktivitetsniveauet. - Eksponere tør gel og standard under anvendelse af en phosphorimager skærm. Kvantificere radioaktiviteten i fortyndingsserier og konstruere en standardkurve som beskrevet 8, 12
BEMÆRK: Optagelse af T7-DNA-polymerase til reaktionsblandingen tillader en at EXAminen brugen af tetraribonucleotide primere af dette enzym. Optimalt set bør polymerasen koncentrationen mættende at forenkle fortolkningen af dataene. En polymerase-koncentration på 0,4 uM eller højere giver gode resultater. Desuden kan virkningerne af andre proteiner, såsom enkeltstrengede DNA-bindende proteiner, på hver primer syntese eller halter-streng initiering undersøges på denne måde.
2. Multiple-omsætning Primer Synthesis Reaktion Ved hjælp af en hurtig-quench Instrument
- Fremstilling af reaktionsblandinger
- Forbered 400 pi opløsning A indeholdende 1 X buffer, 0,2 uM GP4 hexamer, 0,2 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTP'er, 0,2 mM ATP og CTP (herunder 0,5 mCi / ml [α- 32P] CTP.
- Forbered 400 pi opløsning B indeholdende 1 X buffer og 20 mM MgCl2.
- Drift af hurtigtvirkende quench flow instrument
- Tænd rapid-quench flow instrument; efter hovedmenuen vises, at type 7 på instrumentet tastatur flytte sprøjten driveren til udgangspositionen.
- Åbent buffer sprøjte position til "LOAD".
- Påsætningsbuffer sprøjter
- Vedhæft en 10 ml sprøjte indeholdende buffer til drevet sprøjte port. Skift sprøjte knop position til "LOAD".
- Anvendes 10 ml sprøjter, fylde instrument pufferreservoir A og B med 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA og fyld sprøjten C med quench-opløsning (250 mM EDTA og 0,2% SDS). Fjerne luftbobler ved at skubbe stempler ind og ud.
- Skift knop positioner til "BRAND". Type 2 for at justere positionen af sprøjten drivstykket. Tryk på "ADJUST DOWN" knappen for at sænke sprøjten, indtil bufferen kommer ud exit loop: (7-går ned hele tiden; 8-stort skridt ned, 9-lille skridt ned). Skriv "ESC" for at vende tilbage til hovedmenuen.
- Vask slange
- AttACH exit linje til vakuum. Skift prøve drejeknapper til "FLUSH". Luk buffer sprøjten ved at indstille grebene til vandret position. Tænd vakuum og dyppe de to flush sløjfer i H 2 O i 10 s, så dyppe i MeOH i 10 s. Tørre sløjfer ved at suge luft til ~ 15 s, eller indtil tør.
- isætning af prøver
- Skift prøve knop position til "LOAD". Placer opløsning A i 1 ml sprøjte. Sæt sprøjten ind i en af de prøve belastning porte. Gentag til opløsning B, og placere i modsat prøve belastning port.
- Indsamling af tidspunkter
- På hovedmenuen, type 1 til quench-flow løb. Indtast reaktionstid (r), og tryk "ENTER". Reaktionen loop nummer til at bruge, vil blive vist. Skift til nødvendig reaktion loop. Gentag vask procedure i trin 2.2.4.
- Drej sample drejeknapper til "Load". Belastningsreaktion blander i prøveceller sløjfer indtil lige uden for det centrale blandekammeret. Drej alle knapper til "FIRE ". Kontroller, at alle knapper er i den korrekte position.
- Placer 1,5 ml rør på enden af exit loop. Tryk på "GO" for at køre reaktionen. Gentag vask procedure i trin 2.2.4. Opdater buffer sprøjter A og B, indtil de ramte føreren.
- Gentag trin 2.2.6.2-2.2.6.3 for hver ønsket tidspunkt. Undtagelse: Læg ikke opløsning indeholdende start reagens (dvs. MgCl2 i dette tilfælde), når quenching nul tid-point kontrol.
- Når du er færdig indsamling af prøver, indtaste "ESC" for at vende tilbage til hovedmenuen. Tryk på "7" for at vende tilbage buffer sprøjte driver til udgangspositionen.
- Instrument oprydning
- Fjern reaktionsblandingens sprøjter. Drej prøve lastning knappen til "LOAD" position. Under vakuum, vaskes hver prøve loop med 10 ml 0,2 N NaOH, efterfulgt af 10 ml 0,3 NH3 PO 4 og 10 ml MeOH.
- Drej sprøjte drejeknapper til "LOAD" position. Tryk ned på alle 3 syrInge stempler til at hente reaktions- og quench buffere. Vask sprøjter med 5 ml H2O mindst to gange.
- Fyld sprøjter igen med 5 ml H2O og slå drejeknapper til "BRAND" position. Skift knop holdninger og tænd vakuum for at fjerne H 2 O. Flush som i trin 2.2.4. Sluk instrumentet.
BEMÆRK: Produkter analyseres som beskrevet i trin 1.7-1.12. Desuden kan T7-DNA-polymerase og andre replikationsproteiner indsættes i reaktionsblandingen for at analysere deres virkning på primersyntese eller udvidelse.
3. Single-omsætning Primer Synthesis Reaction
BEMÆRK: Single-omsætning primer syntese / forlængelse analyser udføres på samme måde som multiple-omsætning reaktioner, med et par store forskelle: disse analyser følger omdannelsen af radioaktivt mærket ATP i primer eller udvidelse produkter, men koncentrationen af substrater og proteiner er consideraligt højere. Desuden for at opnå millisekund for at tillade analyse af primeren syntesereaktionen, må man anvende et hurtigtvirkende quench flow maskine.
- Fremstilling af reaktionsblandinger.
- Forbered 400 pi opløsning A indeholdende 1 X buffer, 3 pM GP4 hexamer, 6 pM ssDNA template, 0,6 mM dNTP'er, 1 mM CTP og 2 nM [γ- 32P] ATP. Forbered 400 pi opløsning B indeholdende 1 X buffer og 20 mM MgCl2.
- Rapid-quench flow operation
- Udførelse af reaktioner som beskrevet i trin 2.2. Hvis det ønskes, tilsættes T7 DNA-polymerase eller T7 enkeltstrenget-DNA-bindende protein i en koncentration på 15 uM og 20 uM. I dette tilfælde er de forlængelsesprodukter akkumulerer på et tidspunkt regime, der giver mulighed for manuel prøveudtagning af reaktionen.
4. Data Analysis
- Fit produkt fremskridt kurver til ikke-lineær dårligstfirkanter modeller ved hjælp kommercielt tilgængelig software er i stand til mindste kvadraters fits og / eller numerisk integration. Detaljerne i operationen vil variere med den software der anvendes, men nedenfor er generaliserede former for ligninger anvendes til montering af data.
- Bestem hastigheden af produktets dannelse af flere omsætning primer syntese reaktioner ved at montere at komme videre kurver til en lineær ligning. Hvis der er betydelig krumning, bruge initial metode 13, 14 ved tilpasning af dataene til en enkelt-eksponentiel funktion: y = A (e - k t), hvor y er produktkoncentration den, A er reaktionsproduktet amplitude, k den observerede hastighedskonstant, t er tiden i sekunder. Hældningen af tangenten ved tid = 0 er den oprindelige sats.
BEMÆRK: Fit pre-steady state primer syntese reaktioner på en lineær ligning eller til præ-steady state burst ligning y = A (e - k burst t) + rate ss t, hvor A er reaktionsproduktet amplitude, k burst er den observerede hastighedskonstanten for den præ-steady state burst, bedøm ss er steady-state rate ss = kcat [Enzyme]), t er tiden i sekunder. Monter single-omsætning primer syntese reaktioner fremskridt kurver på en enkelt-eksponentiel funktion y = A (e - k t). I tilfælde af GP4, passer til dataene ved numerisk integration 15, til en model med tre NTP kondensationsprodukter trin, hvor hvert mellemprodukt er i ligevægt med enzymet, under anvendelse af kommercielt tilgængeligt software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne vist i figur 1A resultater blev opnået som beskrevet i trin 1 i protokollen, dvs. ved manuelt prøveudtagning en primer syntese katalyseret af GP4 under multiple-omsætning betingelser. Her kan en række produkter efter gelelektroforese observeres ved anvendelse CTP mærket med 32P ved α-stillingen i primer syntesereaktioner (figur 1A). Det mærkede precursor, CTP, viser den højeste mobilitet og vandrer mod bunden af gelen, efterfulgt af langsommere migrerende arter, der svarer til den di-, tri- og tetraribonucleotides syntetiseret af GP4. Afhængigt af længden af inkubation og skabelon-sekvens sammenhæng kan observeres yderligere mærkede produkter svarende til højere oligomerer (pentaribonucleotides, etc.). En reaktion fremskridt kurve plottes ved først at bestemme koncentrationen af fuldlængde-primere (dvs. tetra-og pentaribonucleotides) ved hvert tidspunkt og plotte koncentrationen af primere syntetiseret som en funktion af tid.
Mens indhente data fra steady-state, multiple-omsætning eksperimenter er forholdsvis let, indholdet af datainformation er noget begrænset, da dataene er stærkt defineret ved substratbinding og produkt frigivelse begivenheder, dvs.., Disse begivenheder typisk dominerer eller i høj grad bestemme K M og kcat-værdier 16. Hvis der iagttages reaktionen ved korte nok tidspunkter, før ligevægt er etableret (med andre ord, præ-steady state den) kan langt større informationsindhold afledes ud fra kinetiske forsøg. Undersøgelse af reaktioner i præ-steady state kan give en trove af oplysninger. For eksempel, hvis der observeres en "pre-steady state burst" af produktdannelse, er det god indikation af, at produktet frigivelse er et hastighedsbegrænsende trin in reaktionen. Endvidere kan man uddrage hastigheden af produktdannelse (eller kemi trin) fra præ-steady state fase af reaktionen. I modsætning, hvis der ikke observeres en byge af produkt dannelse, så er det tegn på, at steady state sats er begrænset enten af kemisk trin, eller et trin forud det og at frigivelsen af produktet er hurtig i sammenligning.
Når der anvendes en hurtig-quench instrument til at undersøge reaktionen katalyseret af GP4 i tidsskalaer i området fra sekunder ned til nogle få millisekunder (trin 2 i protokollen), er det klart, at primer akkumulation ikke er lineær, men viser en tofaset profil (figur 1B, optrukket linje). Dette er et diagnostisk resultat demonstrerer evidens for en pre-steady state burst af produkt akkumulering, hvilket antyder, at produktdannelse er hurtig, og at frigivelsen er hastighedsbegrænsende i steady state. Andre enzymsystemer kan ikke vise denneopførsel. For eksempel er en hypotetisk fremskridt kurve præsenteret som ville opstå, hvis primer dannelse ved GP4 ikke gik med en pre-steady state burst (figur 1B, punkteret linie). I sager som disse, ville den fortolkning, være, at produktet dannelse, eller et skridt forud det, er det hastighedsbegrænsende trin.
En anden udførelsesform af præ-steady state kinetik er den enkelt-omsætningen eksperiment, hvor en lav koncentration af mærket substrat er bundet af mættende mængder af enzym (samt DNA og CTP, i tilfælde af GP4). Denne type forsøg er unikt egnet til at give oplysninger om dannelse og nedbrydning af mellemliggende arter under omdannelsen af substrat til produkt. I GP4-katalyseret reaktion (trin 3 i protokollen), primer dannelse er resultatet af tre nukleotidyltransferase transfer reaktioner. For nylig brugte vi single-omsætning primer syntese reaktioner til at afsløre oplysningerom primer mellemprodukter 8 (figur 1C) ved montering af tidsafhængige ophobning og forsvinden af di-, tri- og tetraribonucleotide produkter til en sekventiel model af tre trin i flytningen nukleotidyltransferase, hvor ribonucleotid mellemprodukter er i ligevægt med GP4.
Figur 1: Kinetisk analyse af primer syntese af T7 primase-helicase. (A) Tidsforløb af primer formation ved GP4 på en ssDNA med en enkelt PRS. Prøver blev fjernet før tilsætning af MgCI2 (tid = 0) og samples med intervaller efter tilsætning. Produkter er angivet til venstre for gelen billedet. (B) Solid line: Primer formation ved GP4 udviser en præ-steady state burst. Værdier er gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg. punkteret line: Repræsentation af en reaktion fremskridt kurve, hvis GP4-katalyserede reaktion forløb uden en forud steady state burst. Modificeret fra 8. (C) Single-omsætning primer syntese af GP4. Venstre: tidsforløbet for tetramer formation. Højre: plot af mellemprodukt dannelse versus tid. Værdier er gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg. Data blev passe ved numerisk integration; fuldt optrukne linier viser pasform. Modificeret fra 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vigtigste faktor i at udføre disse eksperimenter er tilgængeligheden af højaktive oprenset enzym. Under vores arbejde med GP4, for eksempel fandt vi, at opbevaring af det oprensede enzym i buffer (20 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) indeholdende 50% glycerol ved -20 ° C fører til en reduktion i den specifikke aktivitet af præparatet over et par måneder. Derfor har vi nu flash-freeze små portioner af oprenset GP4 i 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, og 10% glycerol ved anvendelse af flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Mens anvendelse af flow instrument hurtig-quench, især under erhvervelse af de første få prøver, er det vigtigt at tillade reaktanterne at nå reaktionstemperaturen (stuetemperatur) før start af reaktionen. Desuden bør der udvises stor forsigtighed at rengøre slangen (trin 2.2.4 i protokollen) efter hver gang-punkt, som eventuelt resterende quench reagens ilinjen vil i høj grad inhibere enzymaktivitet, hvilket fører til fejlagtige resultater. En anden overvejelse indebærer sammensætningen af polyacrylamidgel og dets håndtering. Produkterne i primer syntesereaktioner katalyseret af GP4 ikke løser godt i geler med mindre end mindst 20% acrylamid. Faktisk i 15% geler, nukleotidet substrat og alle reaktionsprodukter migrere som en utydelig zone af radioaktivitet. Derfor er det yderst tilrådeligt at justere acrylamid procent overensstemmelse hermed, hvis små ribonucleotid produkter skal analyseres. En væsentlig ulempe ved anvendelse af geler indeholdende en høj procentdel af acrylamid er, at de ikke klæber godt til papir; derfor stor omhu skal anvendes til at overføre dem til kromatografi papir til tørring. Endelig geler indeholder en høj procentdel af acrylamid tendens til at revne i vakuum-drevne gel tørretumblere. Vi finder, at sænke tørretemperaturen til 65 ° C fører til mindre krakning af geler. Alternativt kan gelerne udsættes for fosforbronzeimager skærme uden tørring.
Der er et stort antal variationer i reaktionsbetingelser og reagenser, der kan testes ved hjælp af denne protokol, og som vi forfølger i vores studier af GP4, der spænder fra at teste den enzymatiske adfærd mutant enzymer, undersøger effekten af tilsætning af formodede små molekyle inhibitorer eller aktivatorer, eller alternative substrater, såsom nukleotidanaloger samt alternative DNA-templates, eller en metalion cofaktorer. Den ovenfor beskrevne protokol anvender stuetemperatur, idet reaktionstemperaturen. Hvis der ønskes en anden reaktion temperatur, de fleste hurtig quench instrumenter indeholder en ventil, der tillader en at tilslutte instrumentet til en varme-kontrolleret vandbad. I tilfælde, hvor elektroforetisk produkt separation ikke er tilfredsstillende, især hvis reaktionen puffer indeholder en høj koncentration (> 200 mM) salt, er det tilrådeligt at behandle prøver efter standsning med 1-10 enheder af alkalisk phosphatase og inkuberes ved 37 ° C i mindst 30 minutter. Dette vil fjerne de terminale triphosphater fra NTP'er og ribonukleotid produkter og forbedre deres elektroforetiske adskillelse. Men dette er kun praktisk, hvis nukleotidet er mærket ved α position.
Anvendelse af en hurtig-quench instrument er ikke praktisk for high-throughput analyse. En erfaren bruger kan udføre den hurtige-quench flow beskrevne protokol her, startende fra prøveforberedelse, indsamle ca. 18 tidspunkter, og rengøring af instrumentet i omkring to timer. En yderligere tidsfrist er den nødvendige tid til gelelektroforese, gel eksponering, og dataanalyse. En anden begrænsning er, at et typisk forsøg kræver 500 til 1.000 pi reaktionsvolumen, og opnåelse af tilstrækkelig enzym kunne være udfordrende i tilfælde af proteiner, der ikke udtrykkes effektivt.
Der er stor interesse for at udvikle assays, der muliggør høj-throughput screening af primase aktivitet, især for at udvikle nye antibakterielle lægemidler 17, 18. Trods fremskridt i udviklingen af ikke-radioaktive, kontinuerlige assays til primase aktivitet, lider disse analyser fra to store begrænsninger og dermed udelukke deres anvendelse i hurtige kinetiske undersøgelser, dvs mangler tilstrækkelig tid opløsning og produkt følsomhed. Derfor er den radioaktive, diskontinuerlig assay beskrevet her er i øjeblikket den gyldne standard i den kinetiske undersøgelse af primase aktivitet ved GP4, og DNA primases generelt. Mere avancerede udførelsesformer af protokollen beskrevet her, kan anvendes ved bestemmelsen af den kinetiske pathway af et enzym-katalyseret reaktion under anvendelse af en hurtig bratkøling flow instrument, for eksempel i puls-chase-eksperimenter til bestemmelse af den kinetiske opdeling af substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C.
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
