Introduction
Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution 1 geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang - DNA - Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA - Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli - Thioredoxin, die bifunktionellen Primase-Helikase gp4 und die einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, GP2. 5) 2. Diese Funktion macht es ein attraktives Modellsystem die konservierten biochemischen Mechanismen der DNA-Replikation beteiligt zu studieren.
Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Bildung von Ribonukleotid Primer durch T7-DNA-Primase platziert, ein critical Schritt bei der Initiation der DNA-Synthese. Darüber hinaus kann man auch die Verwendung dieser Primer durch T7-DNA-Polymerase oder andere Replikationsproteine zu untersuchen, indem sie in der Reaktionsmischung einschließlich. Die T7-Primase-Helikase, gp4, katalysiert die Bildung von Primer für DNA-Synthese an spezifische DNA-Sequenzen Primase-Erkennungsstellen oder PRS genannt, (5'-GTC-3 '). Das Cytosin in der PRS ist kryptisch, es für die Anerkennung der Website von wesentlicher Bedeutung ist, aber es wird nicht in das Produkt 3 kopiert. Der erste Schritt bei der Primersynthese durch gp4 beinhaltet die Bildung des Dinucleotid pppAC, die dann zu einem Trimer verlängert wird, und schließlich zu funktionellen Tetranukleotid Primern pppACCC, pppACCA oder pppACAC Abhängigkeit von der Sequenz in der Template - 4. Diese Primer können dann von T7 DNA - Polymerase verwendet werden , um DNA - Synthese zu initiieren, das auch ein gp4 unterstütztes Verfahren 5, 6. In dieser Hinsicht ist die PrimaseDomäne stabilisiert die extrem kurze tetraribonucleotides mit der Vorlage ihrer Dissoziation zu verhindern, greift DNA - Polymerase tatsächlich in einer Weise , um die Primer / Matrize in der Polymerase - aktiven Stelle 7 sichern. Diese Schritte (RNA-Primer-Synthese, Primer-Handoff-Polymerase und Verlängerung) werden in mehreren Zyklen wiederholt, um die nacheilende Strang zu replizieren und mit der Replikation des führenden Stranges koordiniert werden.
Die Assays hier beschrieben sind, sind sehr empfindlich und kann in einem moderaten Zeitrahmen durchgeführt werden. Sie sind jedoch mit relativ niedrigem Durchsatz und großer Sorgfalt muss bei der Nutzung und Entsorgung von radioaktiven Materialien ausgeübt werden. In Abhängigkeit von der Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft, könnte man ein schnelles Abschrecken Instrument einsetzen, um Proben auf Zeitskalen zugänglich für aussagekräftige Analyse der Kurse Reaktionszeit erreichen entweder die stationäre oder die Pre-stabilen Zustand. Vor kurzem haben wir verwendeten Assays hier beschriebenen evidenc zur Verfügung zu stellene die Bedeutung der Primer Freisetzung aus der Primase-Domäne von gp4 in der Einleitung von Okazaki-Fragmenten. Zusätzlich fanden wir Beweise für eine regulatorische Rolle für die T7 einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, gp2.5, bei der Förderung der effizienten Primer Bildung und Nutzung 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Befolgen Sie alle institutionellen Bestimmungen für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verwendung persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille, Kittel und entsprechende Acryl Schilde.
HINWEIS: Der Standardpuffer besteht aus 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dieser Puffer wird bei einer 5-fach Konzentration vorgefertigten) und 0,3 mM jedes dNTP. T7 - Replikationsproteine werden gereinigt , wie beschrieben 8, 9, 10. Einzelsträngige DNA eine einzelne T7 Primase-Erkennungsstelle (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') enthält, kann aus einer Vielzahl von DNA-Synthese Unternehmen erworben werden (die Länge die ssDNA auf das Enzym der Wahl abhängen, für T7 - Primase, ein Pentamer der minimale Schablonenlänge für ein Volllängen - Primers zu synthetisieren 11, wie die kryptische C wesentlich ist jedoch, wenn der Primer durch die Polymerase verlängert werden soll, müssen zusätzliche Nucleotide am 3' - Ende der Matrize vorhanden sein. Reaktionen werden durch die Zugabe einer Endkonzentration von 10 mM MgCl 2 und inkubiert bei 25 ° C eingeleitet. Manuelle Probenahme funktioniert gut für die Zeitpunkte von 5 Sekunden oder länger. Wenn Zeitpunkten kürzer ist als die erforderlich sind, wird empfohlen, ein rapid-quench Strömungs Instrument zu verwenden, um genaue Daten zu erhalten.
1. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion durch manuelle Probenahme
- Vor dem Start des Experiments Aliquot 2 ul Formamid-Farbstoff-Puffer (93% (v / v) Formamid, 50 mM EDTA, 0,01% Xylolcyanol und 0,01% Bromphenol blau) in 8 1,5 ml Polypropylenröhrchen. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Rohre gleich der Anzahl von Zeitpunkten analysiert.
- Bereiten Sie eine 20 & mgr; l Mischung aus 1x Puffer, 0,1 mM ATP und CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32 P] CTP, 0,1 uM ssDNA Vorlage, und 0,1 uM gp4 (als Hexamer Konzentration ausgedrückt - 0,6 & mgr; M-Monomer).
- Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 5 min.
- Entfernen 2 & mgr; l der Mischung ein Pipettiergerät und mischen sich mit 2 ul Formamid-Farbstoff Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen in Schritt unter Verwendung von 1,1 für die keine Reaktionskontrolle (Zeit Null).
- Fügen Sie 2 ul 0,1 M MgCl 2 auf die Reaktionsmischung (auf eine Endkonzentration von 10 mM).
- zurückziehen manuell 2 & mgr; l-Proben der Reaktionsmischungen eine Pipette in 10 s Intervallen und mischen sich mit Formamid Farbstoff vordosiert in 1,5 ml-Röhrchen, hergestellt in Schritt 1.1 verwendet.
- Wärme Proben bei 95 ° C für 5 min in einem Heizblock.
- Laden Aliquots der Proben auf einem denaturierenden Gel. Die kleinen tetraribonucleotide Primer Produkte von der T7-Primase synthetisiert sind auf einer 0,4 mm dicken 25% Acrylamid gelöst: Bisacrylamid (19: 1), 3 M Harnstoff, 1x TBE (100 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA).
- Legen gesamte Gel auf chromatograPHY Papier und Abdeckung mit Plastikfolie. Trockenes Gel mit einem Gel-Trockner.
- Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe der Rest des Reaktionsgemisches und Spot das gleiche Volumen auf dem Gel auf Chromatographie Papier eingelegt, das heißt, vor Ort 4 ul der Verdünnung , wenn 4 ul der Probe geladen wurden.
ANMERKUNG: Diese als Standardkurve dient der Konzentration der Produkte während der Reaktion gebildet zu bestimmen. Zum Beispiel fünffache Verdünnungen TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funktionieren gut, eine Reihe von 01.25 Spanning bis 1: 15.625 (5 2 -5 6), aber die Verdünnungen sollten in Abhängigkeit von dem Aktivitätsniveau eingestellt werden. - Expose trockenes Gel und Standard mit einem Phosporimager Bildschirm. Quantifizierung der Radioaktivität in der Verdünnungsreihe und konstruieren als eine Standardkurve 8 beschrieben, 12
HINWEIS: Inclusion von T7 DNA - Polymerase zu der Reaktionsmischung ermöglicht es , zu EXAMine die Verwendung von tetraribonucleotide Primer durch dieses Enzym. Optimalerweise sollte die Polymerase-Konzentration werden Sättigen der Interpretation der Daten zu vereinfachen. Eine Polymerase-Konzentration von 0,4 & mgr; M oder höher gute Ergebnisse. Zusätzlich kann die Wirkung von anderen Proteinen, wie beispielsweise Einzelstrang-DNA-bindende Proteine, entweder auf der Primersynthese oder nacheilend Stranginitiations kann auf diese Weise untersucht werden.
2. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion einem Rapid-Quench Einsatz des Instruments
- Herstellung von Reaktionsgemischen
- Bereiten 400 ul Lösung A, enthaltend 1x Puffer, 0,2 & mgr; M gp4 Hexamer, 0,2 uM ssDNA Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP und CTP (einschließlich 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP.
- Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2.
- Der Betrieb von S-Quench Fluss Instrument
- Schalten Sie Rapid-Quench-Flow Instruments; nachdem das Hauptmenü angezeigt wird, geben 7 auf dem Instrument Tastatur, um die Spritze Fahrer in die Ausgangsposition zu bewegen.
- Offene Pufferspritzenposition auf "LOAD".
- Ladepuffer Spritzen
- Bringen Sie einen 10-ml-Spritze mit dem Antriebs Spritze Port mit Puffer. Ändern Spritze Knopfposition auf "LOAD".
- Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, füllen Instrument Pufferbehälter A und B mit 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und Spritze C mit Quench-Lösung (250 mM EDTA und 0,2% SDS) zu füllen. Entfernen Sie Luftblasen durch Drücken Kolben, die in die und aus.
- Ändern Knopfpositionen auf "FIRE". Typ-2-Position der Spritze Fahrer bar einzustellen. Drücken Sie "EINSTELLUNG VERRINGERN", um die Spritze zu senken, bis Puffer aus der Austrittsschleife kommt: (7-geht kontinuierlich; 8-großen Schritt nach unten; 9-kleiner Schritt nach unten). Geben Sie "ESC", um in das Hauptmenü zurückzukehren.
- Wash Schlauch
- AttACH Ausfahrt Linie Vakuum. Ändern Probe Knöpfe auf "flush". Schließen Puffer Spritze durch die Knöpfe in die horizontale Position. Schalten Sie Vakuum und tauchen Sie die 2 bündig Schleifen in H 2 O für 10 s, dann tauchen in MeOH für 10 s. Trockenschleifen von Luft für ~ 15 s saugen, oder bis es trocken ist.
- Laden Proben
- Ändern Probe Knopfposition auf "LOAD". Legen Sie die Lösung A in 1-ml-Spritze. Stecken Spritze in einem der Probenladestationen. Wiederholen Sie dies für die Lösung B, und legen Sie in die entgegengesetzte Probenladeöffnung.
- Sammlung von Zeitpunkten
- Auf dem Hauptmenü, geben Sie 1 für Quench-Flow-Lauf. Geben Sie Reaktionszeit (s) ein und drücken Sie "ENTER". Die Reaktionsschleife Nummer verwendet wird angezeigt. Wechseln Sie auf die gewünschte Reaktionsschleife. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4.
- Drehen Probe Knöpfe auf "LOAD". Last Reaktion mischt in Probenschleifen bis kurz außerhalb des zentralen Mischraum. Drehen Sie alle Regler auf "FIRE ". Bestätigen Sie, dass alle Knöpfe in der richtigen Position sind.
- Legen Sie 1,5 ml-Röhrchen auf Ende der Ausfahrt Schleife. Drücken Sie auf "GO" um die Reaktion auszuführen. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. Nachladepuffer Spritzen A und B, bis sie den Fahrer getroffen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6.2-2.2.6.3 für jeden gewünschten Zeitpunkt. Ausnahme: Legen Sie keine Lösung , um die Start - Reagenz (dh MgCl 2 in diesem Fall) , wenn das Abschrecken des Null - Zeit-Punkt - Regelung enthält.
- Wenn die Proben fertig zu sammeln, geben Sie "ESC" zum Hauptmenü zurückzukehren. Drücken Sie "7" Puffer Spritze Fahrer in seine Ausgangsposition zurückzukehren.
- Instrument clean-up
- Entfernen Reaktionsgemisch Spritzen. Drehen Probenladeknopf auf "LOAD" Position. Im Vakuum waschen jede Probenschleife mit 10 ml 0,2 N NaOH, gefolgt von 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 und 10 ml MeOH.
- Drehen Sie Spritze Knöpfe auf "LOAD" Position. Drücken Sie auf allen 3 syringe Plunger Reaktion und Quench-Puffer abzurufen. Waschen Sie die Spritzen mit 5 ml H 2 O mindestens zweimal.
- Füllen Sie Spritzen erneut mit 5 ml H 2 O und drehen Knöpfe auf "FIRE" Position. Ändern Sie Knopfpositionen und schalten Sie Vakuum zu H 2 O Flush , wie in Schritt 2.2.4 entfernen. Schalten Sie das Gerät ab.
HINWEIS: Die Produkte werden in Schritten von 1,7 bis 1,12 , wie beschrieben analysiert. Zusätzlich Polymerase T7 DNA und andere Replikationsproteine können in der Reaktionsmischung hinzugefügt werden, deren Wirkung auf der Primersynthese oder Erweiterung zu analysieren.
3. Single-Umsatz Primer Synthesereaktion
HINWEIS: Single-Umsatz Primersynthese / Extension - Assays sind in ähnlicher Weise zu Mehrumsatz Reaktionen durchgeführt, mit einigen großen Unterschiede: diese Tests folgen die Umwandlung von radiomarkiertem ATP in Primer oder Verlängerungsprodukte, aber die Konzentration von Substraten und Proteinen sind consideraBly höher. Darüber hinaus, um Millisekundenauflösung zu ermöglichen Analyse der Primer-Synthesereaktion zu erreichen, muss man eine schnelle Abschrecken Strömungsmaschine zu nutzen.
- Herstellung der Reaktionsgemische.
- Bereiten Sie 400 ul der Lösung A, bestehend aus 1x Puffer, 3 uM gp4 Hexamer, 6 uM ssDNA - Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP und 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2.
- Schneller-Quench Flow - Betrieb
- Führen Sie Reaktionen wie in Schritt 2.2 beschrieben. Falls gewünscht, fügen T7 DNA-Polymerase oder T7 einzelsträngige DNA-Bindungsprotein in einer Konzentration von 15 uM und 20 uM, respectively. In diesem Fall sammeln sich die Verlängerungsprodukte zu einem Zeitpunkt Regime, das für die manuelle Probennahme der Reaktions ermöglicht.
4. Datenanalyse
- Fit Produkt Verlaufskurven auf nicht-lineare LeastQuadrate Modelle im Handel erhältliche Software, die der kleinsten Quadrate passt und / oder numerische Integration verwendet wird. Die Einzelheiten der Operation wird mit der Software verwendet wird, variieren, aber unterhalb sind verallgemeinerte Formen der Gleichungen verwendet, um die Daten passen.
- Bestimmen die Rate der Produktbildung mehrerer Umsatz Primer Synthesereaktionen von Anpassungskurven in eine lineare Gleichung für den Fortschritt. Bei wesentlichen Krümmung ist, verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit Methode 13, 14 durch die Daten in eine Single-Exponentialfunktion passend: y = A (e - k t), wobei y die Produktkonzentration ist, A die Reaktions Amplitude, k die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, t die Zeit in Sekunden. Die Steigung der Tangente zum Zeitpunkt = 0 ist die Anfangsgeschwindigkeit.
HINWEIS: Fit pre-steady state Primer Synthesereaktionen auf eine lineare Gleichung oder dem Ober steady state Burst Gleichung y = A (e - k burst t) + Rate ss t, wobei A die Reaktions Amplitude, k Burst ist die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Pre-Steady - State - Burst - Rate ss ist die Steady-State - Rate ss = k cat [Enzym]), t die Zeit , in Sekunden. Fit Einzel Umsatz Primer Synthesereaktionen Verlaufskurven auf einer Single-Exponentialfunktion y = A (e - k t). Im Falle von gp4, passen die Daten durch numerische Integration 15 zu einem Modell mit drei NTP Kondensationsschritten, wobei jeder Zwischen in Gleichgewicht mit dem Enzym ist, im Handel erhältliche Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Ergebnisse in Figur 1A gezeigt sind, wurden wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben erhalten, dh durch eine manuell Primer - Synthesereaktion durch gp4 unter mehreren Bedingungen Umsatz katalysierten Abtasten. Hier kann eine Reihe von Produkten nach der Gelelektrophorese unter Verwendung von CTP mit 32 P an der α-Position in Primer - Synthesereaktionen (Abbildung 1A) markiert beobachtet werden. Die markierte Vorläufer, CTP, zeigt die höchste Mobilität und wandert in Richtung der Unterseite des Gels, gefolgt von langsamer wandernde Spezies auf die di-, tri- entspricht, und tetraribonucleotides durch gp4 synthetisiert. In Abhängigkeit von der Länge der Inkubation und Matrizensequenz Zusammenhang weitere gekennzeichnete Produkte zu höheren Oligomeren entsprechenden (pentaribonucleotides usw.) beobachtet werden. Eine Reaktionsverlaufskurve wird durch zuerst Bestimmen der Konzentration von Volllängen-Primer aufgetragen (das heißt, tetra-und pentaribonucleotides) zu jedem Zeitpunkt und Auftragen der Konzentration der Primer als eine Funktion der Zeit synthetisiert.
Während die Daten aus stationären Zustand zu erhalten, ist mit mehreren Umsatz Experimente relativ einfach, den Informationsgehalt der Daten etwas begrenzt ist, da die Daten stark von der Substratbindung und Produktfreigabe Ereignisse definiert, dh., In der Regel diese Ereignisse dominieren oder stark bestimmen K M und k cat Werte 16. Wenn die Reaktion bei kurz genug Zeitpunkten beobachtet wird, bevor der stationäre Zustand hergestellt ist (in anderen Worten, die pre-steady state) können weit größere Informationsgehalt aus kinetischen Experimenten abgeleitet werden. Die Untersuchung von Reaktionen in der Pre-stationären Zustand kann eine Vielfalt von Informationen darüber. Wenn beispielsweise ein "pre-steady state burst" der Produktbildung beobachtet wird, ist es gute Anzeige, daß Produktfreigabe ist ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt in die Reaktion. Darüber hinaus kann man die Rate der Produktbildung zu extrahieren (oder die Chemie Schritt) aus der pre-steady state-Phase der Reaktion. Im Gegensatz dazu wird, wenn ein Burst der Produktbildung nicht beobachtet wird, dann ist es Hinweise darauf, dass die stationäre Rate entweder durch die chemische Schritt beschränkt ist, oder ein Schritt vorausgeht, und dass die Freigabe des Produkts ist schnell im Vergleich.
Wenn ein rapid-quench Instrument verwendet wird , die Reaktion durch gp4 in Zeitskalen im Bereich von Sekunden bis zu wenigen Millisekunden (Schritt 2 des Protokolls) katalysiert zu untersuchen, ist es offensichtlich , dass Primer Akkumulation nicht linear, sondern zeigt eine zweiphasige Profil (Abbildung 1B, durchgezogene Linie). Dies ist ein Diagnoseergebnis Hinweise auf eine vorge steady state Platzen der Produktakkumulation zeigt, was darauf hindeutet, dass die Produktbildung ist schnell und dass die Freisetzung ist geschwindigkeitsbestimmend im eingeschwungenen Zustand. Andere Enzymsysteme können dies nicht zeigenVerhalten. Zum Beispiel wird ein hypothetischer Verlaufskurve dargestellt , welche durch gp4 wenn Primerbildung nicht mit einem vorge steady state - Burst (1B, gepunktete Linie) gehen würde. In solchen Fällen wäre die Interpretation, dass die Produktbildung, oder ein Schritt vorausgeht, ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
Eine weitere Ausführungsform der vorge steady state Kinetik ist die Single-Umsatz Experiment, in dem eine geringe Konzentration an markiertem Substrat gebunden ist, durch Enzymmengen (sowie DNA und CTP, im Fall von gp4) zu sättigen. Diese Art von Experiment ist einzigartig geeignet Informationen über die Bildung und Zerfall von Zwischenspezies während der Umwandlung von Substrat zu Produkt. In der gp4 katalysierten Reaktion (Schritt 3 des Protokolls) ist Grundierungsbildung das Ergebnis von drei Nucleotidyl Transferreaktionen. Vor kurzem haben wir Single-Umsatz Reaktionen der Primersynthese Informationen zu offenbarenüber Primer Zwischenprodukte 8 (1C) durch die zeitabhängige Akkumulierung und Verschwinden der Di-, Tri- und tetraribonucleotide Produkte einem sequentiellen Modell der drei Nucleotidyl Übertragungsschritte Armatur, wobei die Ribonucleotid - Zwischenprodukte im Gleichgewicht mit gp4 sind.
Abbildung 1: Die kinetische Analyse der Primer - Synthese durch die T7 - Primase-Helikase. (A) Zeitverlauf der Primerbildung durch gp4 auf einem ssDNA mit einem einzigen PRS. Proben wurden in Intervallen nach ihrer Zugabe entfernt vor der Zugabe von MgCl 2 (Zeit = 0) und abgetastet. Produkte werden auf der linken Seite des Gels Bild angezeigt. (B) Durchgezogene Linie: Primer Bildung von gp4 weist eine Pre-Steady - State - Burst. Werte sind der Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Gepunktete line: Darstellung eines Reaktionsverlaufskurve , wenn die gp4-katalysierte Reaktion verlief ohne Pre-Steady - State - Burst. Geändert von 8. (C) Einzel Umsatz Primersynthese von gp4. Links: Zeitverlauf der Tetramerbildung. Rechts: Auftragung der Zwischenbildung über die Zeit. Werte sind der Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden durch numerische Integration passen; gezogenen Linien zeigen die Passform. Geändert von 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, und 10% Glycerol unter Verwendung von flüssigem Stickstoff und speichern sie bei -80 ° C. Während die S-Quench-Flow Instrument, vor allem bei der Erfassung der ersten paar Proben, ist es wichtig, die Reaktanden zu ermöglichen, die Reaktionstemperatur (Raumtemperatur) vor dem Start der Reaktion zu erreichen. Auch sollte große Sorgfalt darauf verwendet werden , um gründlich die Schläuche reinigen (Schritt 2.2.4 des Protokolls) nach jedem Zeitpunkt, wie das verbleibende Quenchreagenz indie Linie hemmen stark Enzymaktivität, zu falschen Ergebnissen führen. Eine weitere Überlegung betrifft die Zusammensetzung des Polyacrylamidgels und seine Handhabung. Die Produkte in den Reaktionen der Primersynthese durch gp4 katalysierten löse nicht gut in Gelen mit weniger als mindestens 20% Acrylamid. In der Tat, in 15% Gele, wandern die Nukleotid-Substrat und alle Reaktionsprodukte als undeutliche Zone von Radioaktivität. Daher ist es sehr ratsam, das Acrylamid Prozentsatz entsprechend, wenn kleine Ribonukleotid Produkte analysiert werden sollen einzustellen. Ein wesentlicher Nachteil von Gelen mit einem hohen Prozentsatz an Acrylamid enthält, dass sie haften nicht gut auf Papier; daher große Sorgfalt muss sie verwendet werden, um Transferpapier zum Trocknen der Chromatographie. Schließlich Gele einen hohen Prozentsatz an Acrylamid enthalten, neigen dazu in vakuumbetriebene Geltrockner zu knacken. Wir finden, dass die Trocknungstemperatur auf 65 ° C gesenkt, um weniger Cracken von Gelen führt. Alternativ können die Gele exponiert werden, um phosphorImager-Bildschirme ohne Trocknung.
Es gibt eine große Anzahl von Variationen in den Reaktionsbedingungen und Reagenzien, die dieses Protokoll getestet werden können, unter Verwendung von und die wir in unseren Studien von gp4 verfolgen, im Bereich der enzymatischen Verhalten von mutierten Enzymen testet, die Wirkung der Zugabe von kleinen putative Prüfungs Molekülinhibitoren oder Aktivatoren oder alternative Substrate, wie Nukleotidanaloga sowie alternative DNA-Matrizen oder Metallion-Cofaktoren. Die oben beschriebenen Protokoll verwendet Raumtemperatur als Reaktionstemperatur. Wenn eine andere Reaktionstemperatur gewünscht wird, am schnellsten Quench Instrumente enthalten ein Ventil, das man das Gerät in einen wärmegesteuerten Wasserbad anschließen können. In Fällen, in denen elektrophoretische Trennung Produkt nicht zufriedenstellend ist, insbesondere wenn der Reaktionspuffer mit einer hohen Konzentration (> 200 mM) Salz enthält, ist es ratsam, Proben zu behandeln, nachdem sie mit 1-10 Einheiten alkalischer Phosphatase Abschrecken und Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten. Dies wird die Klemme von NTPs und Triphosphate Ribonukleotid Produkte entfernen und ihre elektrophoretische Trennung zu verbessern. Dies ist jedoch nur praktisch, wenn das Nukleotid an der α-Position markiert ist.
Die Nutzung eines schnellen Quench-Gerät ist nicht geeignet für Hochdurchsatzanalyse. Ein erfahrener Benutzer kann die S-Quench-Flow-Protokoll ausführen hier beschrieben, von der Probenvorbereitung beginnt, etwa 18 Zeitpunkte zu sammeln, und in etwa zwei Stunden, um das Gerät zu reinigen. Eine zusätzliche Zeitbeschränkung ist die Zeit für die Gelelektrophorese, Gel Belichtung erforderlich ist, und die Datenanalyse. Eine weitere Einschränkung ist, dass ein typisches Experiment 500 bis 1000 & mgr; l Reaktionsvolumen erfordert und ausreichend Enzym erhalten könnte im Fall von Proteinen schwierig sein, die nicht effizient exprimiert werden.
Es besteht großes Interesse Assays entwickelt worden, das Hochdurchsatzscreening von prima ermöglichense Aktivität, insbesondere zur Entwicklung neuer antibakterieller Therapeutika 17, 18. Trotz der Fortschritte bei der Entwicklung von nicht-radioaktiv, kontinuierlichen Assays für die Primase - Aktivität leiden diese Assays von zwei Hauptbeschränkungen und somit ihre Verwendung in schnellen kinetischen Untersuchungen ausgeschlossen, dh keine ausreichende Zeitauflösung und die Produktempfindlichkeit. Daher wird die radioaktive, diskontinuierlichen Assay hier beschrieben ist derzeit der Goldstandard in der kinetischen Untersuchung der Primase-Aktivität durch gp4 und DNA-Primasen im Allgemeinen. Anspruchsvollere Ausführungsformen des hier beschriebenen Protokoll kann in Pulse-Chase-Experimente bestimmt, um zu bestimmen, die kinetische Partitionierung von Substraten unter Verwendung einer Rapid-quench Strömungs Instrument bei der Bestimmung der kinetischen Weg eines Enzym-katalysierten Reaktion verwendet werden, beispielsweise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
