Introduction
De replicatie van DNA is geconserveerd kenmerk van alle cellulaire leven. Hoewel de identiteit en het aantal replicatie componenten sterk variëren, zijn de algemene mechanismen gedeeld over de evolutie 1. We beschrijven gel gebaseerde discontinue kinetische experimenten, met behulp van radioactieve substraten, gericht op het begrijpen van de kinetiek van achterblijvende streng DNA synthese in vitro door componenten van de T7 replisome. De replicatiemachinerie van bacteriofaag T7 is zeer eenvoudig, bestaande uit slechts vier eiwitten (DNA polymerase, GP5 en de processivity factor, E. coli thioredoxine, de bifunctionele primase-helicase GP4, en de enkelstrengs DNA-bindend eiwit, GP2. 5) 2. Deze functie maakt het een aantrekkelijke modelsysteem om de geconserveerde biochemische mechanismen van DNA-replicatie bestuderen.
Speciale nadruk wordt gelegd op de vorming van ribonucleotide primers door T7 DNA primase, een criticaIk stap in de initiatie van DNA-synthese. Bovendien kan men ook het gebruik van deze primers door T7 DNA- polymerase replicatie of andere eiwitten onderzocht door ze in het reactiemengsel. De T7 primase-helicase, GP4, katalyseert de vorming van primers voor DNA-synthese op specifieke DNA-sequenties genoemd primase herkenningsplaatsen of PRS, (5'-GTC-3 '). De cytosine in het PRS cryptisch, is het essentieel voor herkenning van de website, maar het is niet gekopieerd naar het product 3. De eerste stap in de synthese primer door GP4 omvat de vorming van het dinucleotide pppAC, die vervolgens wordt uitgebreid tot een trimeer en uiteindelijk functionele tetranucleotide primers pppACCC, pppACCA of pppACAC afhankelijk van de sequentie in de mal 4. Deze primers kunnen vervolgens worden gebruikt door T7 DNA polymerase om DNA-synthese, die ook een gp4 werkwijze met 5, 6 initiëren. In dit opzicht is de primasedomein stabiliseert de extreem korte tetraribonucleotides de sjabloon, voorkomen van dissociatie grijpt DNA polymerase zodanig bevorderlijk is voor een primer / matrijs in de polymerase actieve plaats 7. Deze stappen (RNA primer synthese primer handoff te polymerase en extensie) worden herhaald in meerdere cycli op de bekledings bundel repliceren en worden gecoördineerd met de replicatie van de belangrijke bundel.
De hier beschreven assays zijn zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd in een gematigd tijdsbestek. Ze zijn echter relatief lage-throughput en goede zorg moet worden betracht bij het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen. Afhankelijk van de snelheid waarmee de reactie verloopt, kan men een snelle quench-instrument te gebruiken om monsters opbrengen op tijdschalen vatbaar voor zinvolle analyse reactietijd gangen in zowel de constante of de pre-steady state. Onlangs hebben we gebruikten assays hier beschreven evidenc biedene van het belang van primer vrijlating uit de primase domein van GP4 in de inleiding van Okazaki fragmenten. Bovendien toonden we aan een regulerende rol voor het T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit, gp2.5, voor de efficiëntie van vorming en gebruik 8 primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Volg alle institutionele voorschriften met betrekking tot het veilig gebruik en de verwijdering van radioactief materiaal, inclusief maar niet beperkt tot, het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, een veiligheidsbril, laboratoriumjas en passende acryl schilden.
OPMERKING: De standaard buffer bestaat uit 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kalium- glutamaat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dit buffer wordt pre een 5x concentratie) en 0,3 mM van elke dNTP. T7 replicatie eiwitten gezuiverd zoals beschreven 8, 9, 10. Enkelstrengs DNA bevattende één T7 primase herkenningsplaats (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') is verkrijgbaar bij diverse bedrijven DNA-synthese (de lengte van de ssDNA kan afhangen van het enzym van keuze, voor T7 primase, een pentameer is de minimale lengte template volledige lengte primer te synthetiseren 11, de cryptische C is echter essentieel indien de primer verlengd met polymerase, additionele nucleotiden aanwezig op het 3 'uiteinde van de template. Reacties worden geïnitieerd door het toevoegen van een eindconcentratie van 10 mM MgCl2 en geïncubeerd bij 25 ° C. Handmatige sampling werkt goed voor tijdstippen van 5 seconden of meer. Als tijdstippen korter dan die vereist, wordt aanbevolen een snelle quench-stroom instrument om nauwkeurige gegevens te verkrijgen.
1. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie door Manual Sampling
- Voordat de proef begon, monster 2 pl formamide kleurstof buffer (93% (v / v) formamide, 50 mM EDTA, 0,01% xyleencyanol en 0,01% broomfenolblauw) in 8 1,5 ml polypropyleen buizen. In het algemeen is het aantal buizen is gelijk aan het aantal tijdstippen geanalyseerd.
- Bereid een 20 pi mengsel bestaande 1x buffer, 0,1 mM ATP en CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32P] CTP, 0,1 uM ssdNA template en 0,1 uM GP4 (uitgedrukt als hexameer concentratie - 0,6 uM monomeer).
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Verwijder 2 pi van het mengsel met behulp van een pipet en meng met 2 pl formamide kleurstof buffer in een 1,5 ml buis bereid in stap 1.1 voor de niet reactiecontrole (tijdstip nul).
- Voeg 2 ul van 0,1 M MgCl2 tot reactiemengsel (een eindconcentratie van 10 mM).
- Handmatig intrekken 2 pl monsters van de reactiemengsels onder toepassing van een pipet in 10 s intervallen en meng met formamide kleurstof voorverdeeld in 1,5 ml buisjes bereid in stap 1.1.
- Warmte monsters bij 95 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok.
- Laad porties van de monsters op een denaturerende gel. De kleine tetraribonucleotide primer gesynthetiseerd door T7 primase goed ontbonden op een 0,4 mm dikke 25% acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M ureum, 1x TBE (100 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA).
- Plaats de gehele gel op ChromatograPHY papier en dek af met plastic folie. Droog onder toepassing van een gel droger.
- Bereid een verdunningsreeks van de rest van het reactiemengsel en spot hetzelfde volume geladen op de gel chromatografie op papier, dat wil zeggen, spotten 4 pl van de verdunning of 4 pl monster werd geladen.
Opmerking: Dit zal dienen als de standaardcurve om de concentratie van de producten gevormd tijdens de reactie te bepalen. Bijvoorbeeld vijfvoudige verdunningen behulp TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) werken goed, verspreid over een bereik van 1:25 tot 1: 15.625 (5 2 -5 6), maar de verdunningen worden aangepast afhankelijk van de mate van activiteit. - Expose droge gel en standaard gebruik van een phosphorimager scherm. Kwantificeren van de radioactiviteit in de verdunningsreeks en bouw een standaardkromme zoals beschreven 8, 12
OPMERKING: Opname van T7 DNA polymerase aan het reactiemengsel maakt het mogelijk om EXAmine het gebruik van tetraribonucleotide primers door dit enzym. Optimaal dienen de polymerase concentratie te verzadigen met de interpretatie van de gegevens te vereenvoudigen. Een polymerase concentratie van 0,4 pM of hoger geeft goede resultaten. Bovendien kan het effect van andere eiwitten, zoals enkelstrengs DNA bindende eiwitten, aan beide primer synthese of achterblijvende streng inleiding op deze manier onderzocht.
2. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie Met behulp van een Rapid-demping Instrument
- Bereiding van reactiemengsels
- Bereid 400 ul oplossing A, die 1 x buffer, 0,2 uM GP4 hexameer, 0,2 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP en CTP (inclusief 0,5 mCi / ml [α- 32P] CTP.
- Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2.
- Werking van rapid-demping doorstroming instrument
- Schakel rapid-doof stroming instrument; na het hoofdmenu verschijnt, type 7 op het instrument toetsenbord om de spuit chauffeur te verplaatsen naar de beginpositie.
- Open buffer spuit positie om "LOAD".
- Laadbuffer spuiten
- Bevestig een 10 ml spuit met buffer om de drive spuit poort. Verander spuit knop positie op "LOAD".
- Gebruik 10 ml spuiten, vul instrument bufferreservoir A en B met 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA en vul spuit C met afschrikoplossing (250 mM EDTA en 0,2% SDS). Verwijder luchtbellen door te drukken zuigers in en uit.
- Change knop posities om 'vuur'. Type 2 om de positie van de spuit bestuurder bar aan te passen. Druk op de "ADJUST DOWN" knop om de spuit te verlagen tot buffer komt uit de exit lus: (7-onder gaat continu; 8-grote stap naar beneden, 9-small step down). Typ "ESC" om terug te keren naar het hoofdmenu.
- wash tubing
- attach exit lijn naar vacuüm. Verander sample knoppen om "FLUSH". Afsluiten buffer spuit door de knoppen in de horizontale stand. Zet vacuüm en dompel de 2 flush lussen in H 2 O voor 10 s, dan duik in MeOH gedurende 10 s. Droog lussen door te zuigen lucht voor ~ 15 s, of tot het droog is.
- Loading samples
- Change monster knop positie op "LOAD". Plaats oplossing A bij 1 ml spuit. Sluit spuit in één belading van het monster poorten. Herhaal dit voor oplossing B en plaats in tegengestelde sample load-poort.
- Het verzamelen van time-punten
- Op het hoofdmenu, type 1 voor demping-flow run. Voer reactietijd (s) en druk op "ENTER". De reactie lusnummer te gebruiken wordt weergegeven. Overschakelen naar verplichte reactie lus. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4.
- Draai sample knoppen om "LOAD". Load reactie mengt in sampleloops tot net buiten het centrale mengen compartiment. Draai alle knoppen op "FIRE '. Controleer of alle knoppen in de juiste positie.
- Plaats 1,5 ml buis op het einde van de afrit loop. Druk op "GO" om de reactie te draaien. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4. Reload buffer spuiten A en B totdat ze de bestuurder raken.
- Herhaal stap 2.2.6.2-2.2.6.3 voor elk gewenst tijdstip. Uitzondering: Laat oplossing die de start reagens (bijv MgCl 2 in dit geval) bij afschrikken van het tijdstip nul-punt controle niet geladen.
- Wanneer u klaar bent het verzamelen van monsters, voert u "ESC" om terug te keren naar het hoofdmenu. Druk op "7" om buffer spuit bestuurder terug te keren naar de uitgangspositie.
- Instrument clean-up
- Verwijderen reactiemengsel spuiten. Draai monster laden knop om "LOAD" -stand. Onder vacuüm, wassen elk monster lus met 10 ml 0,2 N NaOH, gevolgd door 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 en 10 mL MeOH.
- Draai spuit knoppen om "LOAD" -stand. Druk naar beneden op alle 3 SYRinge zuigers om reactie en demping buffers op te halen. Wassen spuiten met 5 ml H2O ten minste tweemaal.
- Vul spuiten opnieuw met 5 mL H2O en draai knoppen om "vuur" positie. Verander knop posities en zet vacuum aan H 2 O. Flush te verwijderen zoals in stap 2.2.4. Schakel instrument.
LET OP: De producten worden geanalyseerd zoals beschreven in stappen 1,7-1,12. Bovendien kan T7 DNA-polymerase en andere eiwitten replicatie in het reactiemengsel worden toegevoegd om het effect op synthese primer of uitbreiding analyseren.
3. Single-omzet Primer Synthese Reactie
OPMERKING: Single-omzet primer synthese / extensie assays zijn eveneens uitgevoerd om meerdere omzet reacties, met enkele belangrijke verschillen: deze assays volgen de omzetting van radioactief gemerkt ATP in of primer verlengingsproducten, maar de concentratie van substraten en eiwitten considerably hoger. Bovendien, teneinde milliseconde bereiken analyse van de primer synthesereactie toelaten, moet men een snelle quench-stroom machine gebruiken.
- Bereiding van reactiemengsels.
- Bereid 400 ul oplossing A, bevattende 1 x buffer, 3 uM GP4 hexameer, 6 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP en 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2.
- Rapid-demping stroom operatie
- Verricht reacties zoals beschreven in stap 2.2. Voeg desgewenst T7 DNA polymerase of T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit bij een concentratie van 15 uM en 20 uM, respectievelijk. In dit geval, de verlengingsproducten accumuleren tegelijk regeling die voorziet in handmatige bemonstering van het reactiemengsel.
4. Data Analysis
- Fit product vooruitgang curves voor niet-lineaire minstpleinen modellen met behulp van commercieel verkrijgbare software die in staat kleinste kwadraten horten en / of numerieke integratie. De details van de operatie zal variëren met de gebruikte software, maar onder zijn algemene vorm vergelijkingen voor de montage van de data.
- Bepaal de snelheid van vorming product van meerdere omzet primer synthese reacties door het aanbrengen naar krommen ontwikkelen tot een lineaire vergelijking. Als er een aanzienlijke kromming Gebruik de initiële werkwijze tarief 13, 14 door het aanbrengen van de data voor een enkelvoudige exponentiële functie: y = A (e - k t), waarbij y de productconcentratie, A de reactie amplitude, k de waargenomen snelheidsconstante, t de tijd in seconden. De helling van de raaklijn op tijdstip = 0 is de initiële snelheid.
OPMERKING: Geschikte pre-steady state primer synthesereacties een lineaire vergelijking of de pre-steady state burst vergelijking y = A (e - k bueerste t) + rate ss t, waarbij A de reactie amplitude, k burst is de waargenomen snelheidsconstante voor de pre-steady state burst, percentage ss is de constante frequentie ss = kcat [Enzyme]), t de tijd , in seconden. Fit single-omzet primer synthese reacties vooruitgang bochten om een single-exponentiële functie y = A (e - k t). Bij GP4, bij de data door numerieke integratie 15, een model met drie NTP condensatiestappen, waarbij elke tussenproduct in evenwicht met het enzym, met in de handel verkrijgbare software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in Figuur 1A resultaten werden verkregen zoals beschreven in stap 1 van het protocol, dat wil zeggen, door handmatig een primer synthese gekatalyseerd door gp4 onder meervoudige omzetvoorwaarden bemonstering. Hier kan een reeks producten na gelelektroforese worden waargenomen door CTP gemerkt met 32P bij de α-plaats in primer synthesereacties (Figuur 1A). Het gemerkte precursor, CTP, toont de hoogste mobiliteit en migreert naar de onderkant van de gel, gevolgd door een tragere migratie soort die de di-, tri- en tetraribonucleotides gesynthetiseerd door GP4. Afhankelijk van de lengte van incubatie en matrijssequentie context kunnen bijkomende gelabelde producten gevonden volgens hogere oligomeren (pentaribonucleotides, etc.) worden waargenomen. Een reactievoortgang geplot door eerst de concentratie van volledige lengte primers bepalen (dat wil zeggen, tetra-en pentaribonucleotides) bij elke tijdstip en uitzetten van de concentratie van primers gesynthetiseerd als functie van de tijd.
Terwijl het verkrijgen van gegevens van steady-state, multiple-omzet experimenten is relatief eenvoudig, de informatie-inhoud van de gegevens is enigszins beperkt, omdat de gegevens sterk wordt bepaald door substraat binding en productversie gebeurtenissen, dwz., Deze gebeurtenissen meestal domineren of sterk te bepalen KM en k cat waarden 16. Wanneer de reactie wordt waargenomen bij kort genoeg tijdstippen, voor de steady-state is vastgesteld (dat wil zeggen, de pre-steady state) kan veel grotere informatie-inhoud afkomstig van kinetische experimenten. Onderzoek van de reacties in de pre-steady state kan een schat aan informatie te verstrekken. Als bijvoorbeeld een "pre-steady state burst" van productvorming waargenomen, is het goede indicatie dat productvrijgave een snelheidsbeperkende stap in de reactie. Voorts kan men de snelheid van productvorming (of chemie stap) vanaf het pre-stationaire fase van het reactiemengsel te extraheren. Als daarentegen een uitbarsting van productvorming niet wordt waargenomen, dan is het bewijs dat de steady state snelheid wordt beperkt worden door de chemische stap of een stap vóór en dat de afgifte van het product is snel vergeleken.
Als een snel-quench instrument wordt gebruikt om de reactie gekatalyseerd door gp4 in tijdschaal in de orde van seconden onderzoeken tot een paar milliseconden (stap 2 van het protocol), blijkt dat primer accumulatie is niet lineair, maar vertoont een bifasische profiel (Figuur 1B, doorgetrokken lijn). Dit is een diagnostisch resultaat tonen bewijs voor een pre-steady state uitbarsting van productaccumulatie, wat suggereert dat productvorming snel is en dat release snelheidsbeperkende in de steady state. Andere enzym-systemen kunnen dit niet laten ziengedrag. Zo is een hypothetische kromme vooruitgang gepresenteerd die zou optreden als primer vorming van gp4 niet overgaan tot een pre-stationaire reeks (Figuur 1B, stippellijn). In dergelijke gevallen, zou de interpretatie productvorming zijn of een stap vorige, is de snelheidsbeperkende stap.
Een andere uitvoeringsvorm van pre-steady state kinetiek is de single-omzet experiment, waarbij een lage concentratie van gelabeld substraat wordt gebonden door verzadigende hoeveelheden enzym (als DNA en CTP, bij GP4). Dergelijke experimenten is bij uitstek geschikt om informatie over de vorming en afbraak van tussenvormen tijdens de omzetting van substraat naar product. In het GP4-gekatalyseerde reactie (stap 3 van het protocol), primer vorming het resultaat van drie nucleotidyl overdrachtreacties. Onlangs hebben we gebruik single-omzet primer synthese reacties op informatie te onthullenongeveer primer tussenproducten 8 (figuur 1C) door het aanbrengen van de tijdsafhankelijke accumulatie en verdwijnen van de di-, tri- en tetraribonucleotide producten aan een sequentiële model van drie stappen nucleotidyl overdracht, waarbij het ribonucleotide tussenproducten zijn in evenwicht met GP4.
Figuur 1: Kinetische analyse van primer synthese door T7 primase-helicase. (A) Tijdsverloop primer oprichting via gp4 op een ssDNA met één PRS. Monsters werden voorafgaand aan toevoeging van MgCl2 (tijd = 0) en worden bemonsterd op intervallen na de toevoeging ervan. De producten worden aangegeven aan de linkerzijde imago van de gel van. (B) Doorlopende lijn: Primer vorming door gp4 vertoont een pre-steady state uitbarsting. Waarden zijn het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten. gestippelde line: Vertegenwoordiging van een reactie vooruitgang curve als de GP4-gekatalyseerde reactie verliep zonder een pre-steady state uitbarsting. Gewijzigd ten opzichte van 8. (C) Single-omzet primer synthese door GP4. Links: tijdsverloop van tetrameer formatie. Rechts: plot van intermediaire formatie tegen de tijd. Waarden zijn het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten. De gegevens werden fit door numerieke integratie; vaste lijnen geven de pasvorm. Gewijzigd ten opzichte van 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste factor bij het uitvoeren van deze experimenten is de beschikbaarheid van zeer actieve gezuiverd enzym. Tijdens ons werk met GP4, bijvoorbeeld, vonden wij dat de opslag van het gezuiverde enzym in buffer (20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) bevattende 50% glycerol bij -20 ° C leidt tot een vermindering de specifieke activiteit van het preparaat over een paar maanden. Daarom hebben we nu flash-freeze kleine fracties gezuiverd gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP en 10% glycerol behulp van vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C. Bij gebruik van de snelle quench-stroommeter, vooral tijdens verwerving van de eerste monsters, is het belangrijk dat de reactanten bij de reactietemperatuur (kamertemperatuur) bereikt voor het begin van de reactie. Ook moet grote zorg worden genomen om de buis (stap 2.2.4 van het protocol) na elk tijdpunt grondig reinigen, aangezien het resterende quench reagensde lijn zal sterk enzymactiviteit te remmen, wat leidt tot foutieve resultaten. Andere overweging betreft de samenstelling van de polyacrylamidegel en de behandeling. De producten in primer synthese gekatalyseerd door gp4 niet goed oplossen in gels met minder dan ten minste 20% acrylamide. In feite, in 15% gels, de nucleotidesubstraat en alle reactieproducten migreren als een onduidelijke zone radioactiviteit. Daarom is het zeer wenselijk om de acrylamide percentage aan te passen als kleine ribonucleotide producten worden geanalyseerd. Een belangrijk nadeel van gels die een hoog percentage acrylamide is dat ze niet goed plakken op papier; Daarom moet grote zorg worden gebruikt om ze om lijnen chromatografie voor het drogen. Tenslotte gels die een hoog percentage acrylamide neiging te kraken vacuüm aangedreven gel drogers. We zien dat het verlagen van de droogtemperatuur 65 ° C leidt tot minder kraken van gels. Als alternatief kunnen de gels worden blootgesteld aan fosforimager schermen zonder drogen.
Er zijn een groot aantal variaties in reactieomstandigheden en reagentia die kunnen worden getest met dit protocol, en die wij nastreven in onze studies GP4, van het testen van de enzymatische gedrag van mutante enzymen, onderzoekt het effect van toevoeging van vermeende kleine molecule inhibitoren of activatoren of alternatieve substraten, zoals nucleotide-analoga, evenals alternatieve DNA-matrijzen of metaalion cofactoren. De hierboven beschreven protocol gebruikt kamertemperatuur en de reactietemperatuur. Als een andere reactietemperatuur gewenst, snelste-quench instrumenten bevatten een klep die toelaat om het instrument op een warmte geregeld waterbad. Wanneer elektroforetische scheiding product is niet bevredigend, vooral als de reactiebuffer bevat een hoge concentratie (> 200 mM) zout, is het raadzaam om monsters te behandelen na blussen met 1-10 eenheden alkalische fosfatase en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten. Dit zal de terminal trifosfaten van NTP's en ribonucleotide producten te verwijderen en verbeteren van hun elektroforetische scheiding. Dit is echter alleen nuttig als de nucleotide gelabeld op de α positie.
Het gebruik van een snelle-demping instrument is niet geschikt voor high-throughput analyse. Een ervaren gebruiker kan de snelle-demping doorstroming protocol hier beschreven, uitgaande van monstervoorbereiding, het verzamelen van ongeveer 18 tijdstippen, en het schoonmaken van het instrument in ongeveer twee uur uit te voeren. Een extra tijdsbeperking is de tijd die gelelektroforese blootstelling gel en gegevensanalyse. Een andere beperking is dat een typisch experiment vereist 500 tot 1000 pl reactievolume, en het verkrijgen van voldoende enzym kan moeilijk in het geval van eiwitten die niet efficiënt uitgedrukt worden.
Er is grote belangstelling voor de ontwikkeling van tests die het mogelijk maken high-throughput screening van primase-activiteit, met name op nieuwe antibacteriële geneesmiddelen 17 ontwikkelen 18. Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van niet-radioactieve, continu testen voor primase activiteit, deze testen lijden aan twee belangrijke beperkingen en daarmee de weg aan het gebruik ervan in een snelle kinetische onderzoeken, dat wil zeggen, niet over voldoende tijd resolutie en gevoeligheid van de producten. Daarom is de radioactieve discontinue test hier beschreven is momenteel de gouden standaard op het kinetische onderzoek primase-activiteit door GP4 en DNA primases in het algemeen. Meer geavanceerde uitvoeringsvormen van de hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor de bepaling van de kinetische route van een enzym gekatalyseerde reactie met een snelle quench-stroommeter, bijvoorbeeld in pulse-chase experimenten bedoeld om de kinetische verdeling van substraten bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
