Introduction
השכפול של הדנ"א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג'ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ"א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ"א.
דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5'-GTC-3 '). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל.
המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ"א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים.
הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ"מ, 5 מ"מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ"מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר 8, 9, 10. דנ"א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5'-GGGTC-3 ", 5'-GTGTC-3", 5'-TGGTC-3 ') ניתן לרכוש ממגוון רחב של חברות סינתזה DNA (אורך של ssDNA יכול להיות תלוי האנזים של בחירה עבור primase T7, pentamer הוא אורך תבנית המינימום לסנתז פריימר באורך מלא 11, כמו C הנסתר חיוני, אולם אם היה פריימר הוא תוארך פולימראז, נוקלאוטידים נוסף חייב להיות נוכח בסוף '3 של התבנית. תגובות יזומים על ידי תוספת של ריכוז סופי של 10 מ"מ MgCl 2 וטופחו על 25 מעלות צלזיוס. דגימה ידנית עובדת היטב עבור נקודות זמן של 5 שניות או יותר. אם בזמן נקודות קצרות מזו נדרשות, מומלץ להשתמש באמצעי זרימה מהיר-להרוות להשיג נתונים מדויקים.
1. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור ידי דגימה ידנית
- לפני תחילת הניסוי, aliquot 2 μL של חיץ לצבוע לפוראמיד (93% (V / V לפוראמיד), 50 מ"מ EDTA, 0.01% cyanol קסילן ו 0.01% bromophenol כחול) לתוך 8 1.5 צינורות פוליפרופילן מ"ל. באופן כללי, מספר צינורות שווה למספר נקודות זמן המנותח.
- הכינו תערובת 20 μL המורכב חיץ 1x, 0.1 מ"מ ATP ו CTP, 0.25 MCI / מ"ל [α- 32 P] CTP, 0.1 מיקרומטר SSDתבנית NA, ו -0.1 מיקרומטר gp4 (מבוטא ריכוז hexamer - 0.6 מיקרומטר מונומר).
- דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הסר 2 μL של התערובת באמצעות pipettor ומערבבים עם 2 μL חיץ לצבוע לפוראמיד צינור 1.5 מ"ל מוכן בשלב 1.1 עבור כל שליטה התגובה (זמן אפס).
- הוסף 2 μL של 0.1 M MgCl 2 לתערובת התגובה (לריכוז סופי של 10 מ"מ).
- באופן ידני למשוך 2 דגימות μL של תערובות התגובה באמצעות pipettor ב 10 מרווחי ים ומערבבים עם צבע לפוראמיד predispensed ב 1.5 צינורות מ"ל מוכן בשלב 1.1.
- דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום.
- טען aliquots של דגימות על ג'ל denaturing. המוצרים פריימר tetraribonucleotide קטן מסונתז על ידי primase T7 נפתרות היטב על acrylamide 0.4 מ"מ עובי 25%: bisacrylamide (19: 1), 3 M אוריאה, TBE 1x (100 מ"מ טריס-borate, 1 mM EDTA).
- מניחים ג'ל כולו על chromatograPHY נייר ומכסים בניילון נצמד. ג'ל ניקוי באמצעות היבשים ג'ל.
- כן סדרת דילול של שארית תערובת התגובה ספוט באותו הנפח טעון על הג'ל על גבי נייר כרומטוגרפיה, כלומר, במקום 4 μL של הדילול אם 4 μL של מדגם הועמס.
הערה: זה ישמש את עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז של מוצרים נוצרו במהלך התגובה. לדוגמה, פי חמישה דילולים באמצעות TE חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) עובד טוב, פורש מגוון של 1:25 עד 1: 15.625 (5 2 -5 6), אבל דילולים צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הפעילות. - לחשוף ג'ל יבש רגיל באמצעות מסך phosphorimager. לכמת את הרדיואקטיביות בסדרת הדילול לבנות עקום סטנדרט כמתואר 8, 12
הערה: הכללה של DNA פולימראז T7 לתערובת התגובה מאפשרת לאדם EXAשלי השימוש של פריימרים tetraribonucleotide ע"י אנזים זה. באופן אופטימלי, ריכוז פולימראז יש להרוות כדי לפשט את הפרשנות של הנתונים. ריכוז פולימראז של 0.4 מיקרומטר ומעלה נותן תוצאות טובות. בנוסף, ההשפעה של חלבונים אחרים, כגון חלבונים מחייב חד גדילי דנ"א, משני סינתזה פריימר או חניכה גדיל מפגרת ניתן לבדוק בדרך זו.
2. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור באמצעות מכשיר Rapid-להרוות
- הכנת תערובות התגובה
- הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 0.2 מיקרומטר hexamer gp4, 0.2 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ"מ dNTPs, 0.2 מ"מ ATP ו CTP (כולל 0.5 MCI / מ"ל [α- 32 P] CTP.
- הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ"מ MgCl 2.
- מבצע של מכשיר זרימה מהירה-להרוות
- הפעל ראפמכשיר זרימה id-להרוות; לאחר הופעת התפריט הראשי, הקלד 7 במקלדת המכשיר כדי להזיז את נהג המזרק לעמדת המוצא.
- חיץ מזרק להרחיב בעמדה "עומס".
- מזרקי חיץ טוען
- צרף חוצץ המכיל מזרק 10 מ"ל לנמל מזרק הכונן. שינוי מיקום ידית מזרק כדי "לטעון".
- באמצעות 10 מזרקים מ"ל, למלא מאגר חיץ מכשיר ו- B עם 10 מ"מ טריס, pH 7.5, 1 mM EDTA ולמלא מזרק C עם פתרון להרוות (250 מ"מ EDTA, ו -0.2% SDS). הסר בועות אוויר על ידי דחיפת בוכנות פנימה והחוצה.
- ידית שינוי עמדות "אש". סוג 2 כדי לשנות את מיקום של בר נהג מזרק. לחץ "להתאים DOWN" על מנת להקטין את המזרק עד חיץ יוצא לולאת היציאה: (7-יורדים ברציפות; צעד גדול 8 למטה; 9-קטן צעד למטה). הקלד "ESC" כדי לחזור לתפריט הראשי.
- צינורות Wash
- עו"דאח היציאה בתור ואקום. שנת ידיות מדגם "סומק". מזרק חיץ לסגור על ידי קביעת הידיות למצב האופקי. הפעל ואקום לטבול 2 לולאות הסומק H 2 O עבור 10 s, ואז לטבול MeOH במשך 10 שניות. ניקוי לולאות ידי מציצת אוויר עבור ~ 15 שניות, או עד יבש.
- דגימות טוענים
- מיקום ידית מדגם שנה "עומס". מניחים פתרון לתוך מזרק 1 מ"ל. חבר מזרק לתוך לאחת מיציאות עומס המדגם. חזור על הפעולה עבור פתרון B, ומניחים בנמל עומס מדגם ההפך.
- אוסף של נקודות זמן
- בתפריט הראשי, מסוג 1 לריצה להרוות-זרימה. זן זמן תגובה (ים) ולחץ "ENTER". מספר לולאת התגובה להשתמש יוצג. Switch to לולאת תגובה הנדרשת. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4.
- הפעל מדגם ידיות "לטעון". תגובה טען מתערבבת לולאות מדגם עד ממש מחוץ לתא הערבוב המרכזי. הפעל את כל הכפתורים כדי "FIRE ". מוודא שכל הכפתורים נמצאים בעמדה הנכונה.
- מניח 1.5 מיליליטר מתחנת רכבת תחתי לתוך סוף לולאת יציאה. לחץ "GO" כדי להפעיל את התגובה. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. מזרקי חיץ רענן A ו- B עד שהם להכות את הנהג.
- חזרו על שלבי 2.2.6.2-2.2.6.3 עבור כל נקודת זמן רצויה. יוצא מן הכלל: אל תטען תמיסה המכילה מגיב ההתחלה (כלומר, MgCl 2 במקרה זה) כאשר מרווה השליטה אפס זמן נקודות.
- בסיום איסוף דגימות, הזן "ESC" כדי לחזור לתפריט הראשי. לחץ "7" כדי לחזור נהג מזרק חיץ לעמדת המוצא שלה.
- מכשיר לניקוי
- סור מזרקי תערובת תגובה. הפעל ידית טעינה מדגם למצב "עומס". תחת ואקום, לשטוף כל לולאה המדגם עם 10 מ"ל 0.2 N NaOH, ואחריו 10 מ"ל 0.3 NH 3 PO 4 ו -10 מ"ל MeOH.
- הפעל ידיות מזרק למצב "עומס". לחץ כלפי מטה על כל 3 SYRבוכנות אינגה לאחזר מאגרי תגובה להרוות. לשטוף מזרקים עם 5 מ"ל H 2 O לפחות פעמיים.
- מלאו מזרקים שוב עם 5 מ"ל H 2 O ולהפוך ידיות למצב "אש". שינוי עמדות כפתור ולהדליק ואקום כדי להסיר H 2 O. Flush כמו בשלב 2.2.4. כבה המכשיר.
הערה: מוצרים מנותחים כמתואר בשלבים 1.7-1.12. בנוסף, DNA פולימרז T7 וחלבונים שכפול אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה לנתח את השפעתם על סינתזה פריימר או הרחבה.
3. תגובת סינתזת פריימר חד מחזור
הערה: סינתזת פריימר חד מחזור / מבחני הרחבה מתבצעים באופן דומה לתגובות מרובה-מחזור, עם הבדלים גדולים כמה: מבחנים אלה בצעו את ההמרה של ה- ATP רדיואקטיבי לתוך מוצרים פריימר או רחבה, אולם ריכוז המצעים וחלבונים הם consideraבליי גבוה. בנוסף, על מנת להשיג ברזולוציה אלפית השנייה כדי לאפשר ניתוח של סינתזת התגובה פריימר, אחד חייב לנצל מכונת זרימה מהירה-להרוות.
- הכנת תערובות תגובה.
- הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 3 מיקרומטר hexamer gp4, 6 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ"מ dNTPs, 1 מ"מ CTP, ו -2 ננומטר [γ- 32 P] ATP. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ"מ MgCl 2.
- מבצע זרימה מהיר-להרוות
- לבצע תגובות כמתוארות בשלב 2.2. אם תרצה בכך, להוסיף פולימראז T7 DNA או T7 חד גדילי ה- DNA חלבון מחייב בריכוז של 15 מיקרומטר ו 20 מיקרומטר, בהתאמה. במקרה זה, את המוצרים הרחבים להצטבר משטר זמן המאפשר דגימה ידנית של התגובה.
ניתוח 4. נתונים
- עקומות התקדמות מוצר לנכונות שאינו ליניארי least-מודלי ריבועים באמצעות תוכנה זמינה מסחרי מסוגלים ריבועים לפחות מתאימים ו / או אינטגרציה נומרית. הפרטים של המבצע ישתנו עם התוכנה מועסקת, אך להלן צורות כלליות של משוואות המשמשות התאמת הנתונים.
- קבע את קצב היווצרות התוצר של תגובות סינתזת פריימר מספר המחזור ידי ההתאמה להתקדם עקומות למשוואה ליניארית. אם יש עיקום ניכר, השתמש בשיטת שיעורו הראשונית 13, 14 על ידי התאמת הנתונים לפונקציה יחידה מעריכים: y = A (e - t k), כאשר y הוא ריכוז המוצר, A היא משרעת התגובה, k הוא הקבוע לקצב המהיר שנמדד בטלסקופים, t הוא הזמן, בשניות. השיפוע של המשיק בשלב = 0 הוא השיעור הראשוני.
הערה: Fit טרום יציב תגובות סינתזת פריימר מדינת משוואה ליניארית או למשוואה טרום יציבה פרץ מדינת Y = A (e - k buהראשון t) + שיעור ss t, כאשר A הוא משרעת התגובה, פרץ k הוא קבוע קצב ציין עבור פרץ במצב טרום יציב, ss השיעור הוא ss שיעור היציב = חתול k [אנזים]), t הוא הזמן , בשניות. התאם תגובות סינתזת פריימר חד מחזור להתקדם עקומות על יחיד מעריכי פונקציה y = A (ה - k t). במקרה של gp4, להתאים את הנתונים על ידי אינטגרציה נומרית 15, למודל עם שלושה שלבי עיבוי NTP, כאשר כל ביניים נמצאים בשיווי משקל עם האנזים, באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג'ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם 32 P במיקום-α בתגובות סינתזה פריימר (איור 1 א). מבשר שכותרתו, CTP, מציגה את הניידות הגבוהה ביותר נודד לכיוון החלק התחתון של הג'ל, ואחריו מינים נודדים איטי המתאים דוּ, תלת, ו tetraribonucleotides מסונתז על ידי gp4. בהתאם לאורך של דגירה, והקשר רצף תבנית, מוצרים שכותרתו נוספים המתאימים oligomers הגבוה (pentaribonucleotides, וכו ') ניתן לצפות. עקומת התקדמות תגובה זומם הראשון על ידי קביעת הריכוז של פריימרים באורך מלא (כלומר, אַרְבַּע-ו pentaribonucleotides) בכל timepoint והתוויית ריכוז פריימרים מסונתז כפונקציה של זמן.
בעוד קבלת נתוני מצב יציב, ניסויים-מחזור מרובה קלים יחסית, תוכן המידע של הנתונים הוא מוגבל למדי, כמו מהנתונים מוגדרים מאוד על ידי מצע מחייב ואירועי שחרור המוצר, כלומר., אירועים אלה בדרך כלל שולטים או מאוד לקבוע K M וחתול k ערכים 16. אם התגובה הוא ציין נקודות זמן קצר מספיק, לפני היציב מוקמת (או במילים אחרות, המדינה טרום יציב) הרבה תוכן מידע רב יותר ניתן לגזור מניסויים קינטית. בחינת התגובות במדינת טרום היציבה יכולה לספק מידע רב. לדוגמא, אם "פרץ במצב טרום יציב" של היווצרות המוצר הוא ציין, היא אינדיקציה טובה כי שחרור המוצר הוא צעד שער הגבלת in התגובה. יתר על כן, אפשר לחלץ את קצב היווצרות מוצר (או שלב הכימיה) מהשלב שלפני קום המדינה-היציב של התגובה. לעומת זאת, אם פרץ של היווצרות מוצר לא הוא ציין, אז זה ראיות כי שיעור המצב היציב מוגבל באמצעות הצעד הכימי, או שלב מקדים אותו כי שחרורו של המוצר הוא מהיר בהשוואה.
כאשר מכשיר מהיר-להרוות משמש כדי לבחון את התגובה מזורזת על ידי gp4 בקשקשים זמן בטווח של שניות עד כמה אלפיות (שלב 2 לפרוטוקול), ברור כי הצטברות פריימר אינה ליניארית, אלא מציג biphasic פרופיל (איור 1B, קו מוצק). זוהי תוצאת אבחון הוכחת ראיות בפרץ במצב טרום יציב של הצטברות מוצר, אשר טוען כי היווצרות המוצר היא מהירה השחרור הוא הגבלת גודל על המצב היציב. מערכות אנזימים אחרות עשויות לא להראות זאתהִתְנַהֲגוּת. לדוגמא, עקומת התקדמות היפותטי מוצגת אשר תביא אם היווצרות פריימר ידי gp4 לא להמשיך עם בפרץ במצב טרום יציב (האיור 1B, קו מקווקו). במקרים כגון אלה, הפרשנות תהיה כי היווצרות המוצר, או צעד שקדם לה, הוא צעד שער הגבלה.
התגלמות נוספת של קינטיקה במצב טרום היציב היא הניסוי הבודד-מחזור, שבו ריכוז נמוך של מצע שכותרתו מחויב להרוות סכומי האנזים (כמו גם דנ"א CTP, במקרה של gp4). סוג של ניסוי זה הוא מתאים באופן ייחודי כדי לספק מידע על ההיווצרות והריקבון של מיני ביניים במהלך ההמרה של מצע למוצר. תגובת catalyzed-gp4 (שלב 3 לפרוטוקול), היווצרות פריימר היא התוצאה של שלוש תגובות העברת nucleotidyl. לאחרונה, השתמשנו תגובות סינתזת פריימר חד מחזור לחשוף מידעעל ביניים פריימר 8 (תרשים 1C) על ידי התאמת הצטברות והיעלמות תלוי זמן של דוּ, תלת, ומוצרים tetraribonucleotide למודל רציף של שלוש מדרגות העברת nucleotidyl, שבו ביניים ribonucleotide נמצאים בשיווי משקל עם gp4.
איור 1: ניתוח קינטי של סינתזה פריימר ידי primase-helicase T7. (א) זמן כמובן של היווצרות פריימר ידי gp4 על ssDNA עם PRS יחיד. דוגמאות הוסרו לפני תוספת של MgCl 2 (זמן = 0) וטעמו במרווחים הבאים בנוסף שלה. מוצרים מסומנים בצד שמאל של התמונה ג'ל. (ב) קו מוצק: היווצרות פריימר ידי gp4 מפגין פרץ טרום המדינה יציב. ערכים הם הממוצעים של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. l מנוקדine: ייצוג עקומת התקדמות התגובה אם התגובה catalyzed-gp4 המשיך בלי פרץ טרום המדינה יציב. השתנה מ 8. (C) סינתזה פריימר Single-מחזור ידי gp4. משמאל: זמן כמובן של היווצרות tetramer. מימין: עלילה של היווצרות ביניים לעומת זמן. ערכים הם הממוצעים של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. הנתונים היו בכושר ידי אינטגרציה נומרית; קווים מוצקים להראות את ההתאמה. השתנה מ 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ"מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ"מ, 1 מ"מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. לכן אנו עכשיו להקפיא פלאש aliquots קטן של gp4 מטוהרים 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 מ"מ TCEP, ו -10% גליצרול באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 ° C. בעוד השימוש במכשיר הזרימה מהיר-להרוות, במיוחד במהלך הרכישה של כמה הדגימות הראשונות, חשוב לאפשר המגיב להגיע (בטמפרטורת חדר) טמפרטורת תגובה לפני תחילת התגובה. כמו כן, בזהירות רבה יש לנקוט כדי לנקות את הצינורות ביסודיות (שלב 2.2.4 לפרוטוקול) לאחר כל פעם נקודות, כמו כל מגיב להרוות שנותרהקו יהיה לעכב פעילות אנזים מאוד, מה שהוביל לתוצאות שגויות. שיקול נוסף כרוך בהרכב הג'ל polyacrylamide והטיפול בו. המוצרים בתגובות סינתזת פריימר מזורזים על ידי gp4 אינם פותרים גם ג'ל עם פחות מ לפחות acrylamide 20%. למעשה, ב -15 ג'לי%, מצע נוקלאוטיד וכל תוצרי התגובה להעביר כאזור לא ברור של רדיואקטיביות. לכן, רצוי מאוד להתאים את אחוז acrylamide בהתאם אם מוצרי ribonucleotide קטנים הם להיות מנותחים. חסרון עיקרי של שימוש ג'לי המכילים אחוז גבוה של acrylamide הוא שהם לא מקלים גם על נייר; ולכן בזהירות רבה יש להשתמש כדי להעביר אותם כרומטוגרפיה נייר לייבוש. לבסוף, ג'לי המכילים אחוז גבוה של acrylamide נוטים פצחו מייבשי ג'ל מופעל ואקום. אנו מוצאים כי הורדת טמפרטורת הייבוש עד 65 מעלות צלזיוס מוביל פיצוח פחות של ג'לים. לחלופין, ג'ל יכול להיחשף זרחןמסך תרמי ללא ייבוש.
ישנם מספר רב של שינויים בתנאי תגובה ריאגנטים כי ניתן לבדוק באמצעות פרוטוקול זה, ואשר אנחנו רודפים אחרי במחקרים שלנו של gp4, החלו בבדיקת ההתנהגות האנזימטית של אנזימים מוטנטיים, בוחנים את השפעת תוספת של קטנים המשוערת מעכבים או activators מולקולה, או מצעים חלופיים, כגון אנלוגים נוקלאוטיד, כמו גם תבניות DNA חלופיות, או קו-פקטורי יון מתכת. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש בטמפרטורת חדר כמו טמפרטורת התגובה. אם אחר טמפרטורת תגובה היא רצויה, רוב המכשירים מהירים להרוות מכילים שסתום המאפשר אחד כדי לחבר את המכשיר באמבט מים שבשליטת חום. במקרים בם הפרדת מוצר electrophoretic אינה משביעת רצון, במיוחד אם חיץ התגובה מכיל ריכוז גבוה (> 200 מ"מ) של מלח, רצוי לטפל דגימות לאחר מרווה עם 1-10 יחידות של phosphatase אלקליין לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות. פעולה זו תסיר את triphosphates מסוף מ NTPs ומוצרים ribonucleotide ולשפר ההפרדה electrophoretic שלהם. עם זאת, זה מעשי רק אם נוקלאוטיד מסומן במיקום α.
שימוש של מכשיר מהיר-להרוות הוא לא נוח לניתוח תפוקה גבוהה. משתמש מנוסה יכול לבצע את הפרוטוקול זרימה מהירה-להרוות המתואר כאן, החל הכנת המדגם, איסוף כ -18 בזמן נקודות, וניקוי המכשיר כשעתיים. מגבלת זמן נוספת היא הזמן הנדרש עבור ג'ל אלקטרופורזה, חשיפה ג'ל, וניתוח נתונים. מגבלה נוספת היא כי ניסוי טיפוסי דורש 500 1,000 μL של עוצמת התגובה, וקבלת אנזים מספיק יכול להיות מאתגר במקרה של חלבונים שלא באים לידי ביטוי ביעילות.
יש עניין רב בפיתוח מבחני המאפשרים הקרנת תפוקה גבוהה של פרימהse בפעילות, במיוחד לפתח תרופה אנטיבקטריאלי רומן 17, 18. למרות התקדמות בפיתוח שאינו רדיואקטיביים, מבחני רציפה לפעילות primase, מבחנים אלה סובלים שתי מגבלות עיקריות ובכך למנוע את השימוש בם בחקירות הקינטית מהירות, כלומר, חסרים ברזולוציה מספיק זמן ורגישות מוצר. לכן, assay רדיואקטיבי, הרציף המתוארת כאן הוא כיום תקן הזהב בבחינה הקינטית של פעילות primase ידי gp4, ו primases DNA בכלל. עוד התגלמות מתוחכמת של הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בקביעת מסלול הקינטית של תגובת אנזים-catalyzed באמצעות מכשיר זרימה מהיר-להרוות, למשל, בניסויים דופקים מרדף נועדו לקבוע את המחיצות הקינטית של מצעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
