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Genetics

ठंड-कतरा डीएनए संश्लेषण की काइनेटिक्स Published: February 25, 2017 doi: 10.3791/55312
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

Introduction

डीएनए की प्रतिकृति सभी सेलुलर जीवन के एक संरक्षित सुविधा है। जबकि पहचान और नकल के घटकों की संख्या में व्यापक रूप से भिन्न है, सामान्य तंत्र विकास 1 में साझा कर रहे हैं। यहाँ, हम जेल आधारित, असंतत गतिज प्रयोगों का वर्णन है, रेडियोधर्मी substrates, T7 replisome के घटकों द्वारा इन विट्रो में ठंड-कतरा डीएनए संश्लेषण के कैनेटीक्स को समझने के उद्देश्य से इस्तेमाल करते हैं। जीवाणुभोजी T7 की प्रतिकृति मशीनरी केवल चार प्रोटीन (डीएनए पोलीमरेज़, gp5, और इसके Processivity कारक, ई कोलाई thioredoxin, bifunctional primase-helicase gp4, और एकल असहाय डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन, GP2 से मिलकर बहुत सरल है। 5) 2। यह विशेषता है कि यह डीएनए प्रतिकृति में शामिल संरक्षित जैव रासायनिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है।

विशेष जोर T7 डीएनए द्वारा ribonucleotide प्राइमरों के गठन पर रखा गया है primase, एक criticaडीएनए संश्लेषण की दीक्षा में एल कदम है। इसके अलावा, एक भी उन्हें प्रतिक्रिया मिश्रण में शामिल करके T7 डीएनए पोलीमरेज़ या अन्य प्रतिकृति प्रोटीन द्वारा इन प्राइमरों के उपयोग की जांच कर सकते हैं। T7 primase-helicase, gp4, विशिष्ट डीएनए primase मान्यता साइटों, या पीआरएस बुलाया दृश्यों पर डीएनए संश्लेषण के लिए प्राइमरों के गठन, (5'-जीटीसी -3 ') उत्प्रेरित। पीआरएस में साइटोसिन गुप्त है, यह साइट की मान्यता के लिए आवश्यक है, लेकिन यह उत्पाद 3 में नकल नहीं है। Gp4 द्वारा प्राइमर संश्लेषण में पहला कदम डाईन्यूक्लियोटाइड पीपीपीएसी, जो फिर एक trimer लिए बढ़ा दिया है, और कार्यात्मक tetranucleotide प्राइमरों अंततः pppACCC, pppACCA, या pppACAC खाका 4 में क्रम पर निर्भर करता है का गठन शामिल है। ये प्राइमरों तो डीएनए संश्लेषण, जो भी एक gp4 की मदद से प्रक्रिया 5, 6 आरंभ करने के लिए T7 डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है। इस संबंध में primaseडोमेन टेम्पलेट के साथ बहुत कम tetraribonucleotides स्थिर, उनके हदबंदी को रोकने, एक तरह से पोलीमर्स सक्रिय साइट 7 में प्राइमर / टेम्पलेट हासिल करने के लिए अनुकूल में डीएनए पोलीमरेज़ संलग्न है। ये कदम (आरएनए प्राइमर संश्लेषण, पोलीमर्स के लिए प्राइमर हैंडऑफ़, और विस्तार) ठंड कतरा दोहराने के लिए कई चक्र में दोहराया जाता है और अग्रणी कतरा की प्रतिकृति के साथ समन्वित किया जाना चाहिए।

assays यहाँ वर्णित अत्यधिक संवेदनशील होते हैं और एक उदारवादी समय सीमा में किया जा सकता है। अपेक्षाकृत हालांकि, वे कर रहे हैं कम throughput और बड़ी सावधानी के उपयोग और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान में प्रयोग किया जाना चाहिए। जिस गति से प्रतिक्रिया आय, एक एक तेजी से बुझाना साधन रोजगार सकता है या तो स्थिर है या पूर्व स्थिर अवस्था में प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रमों के सार्थक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी समय तराजू पर नमूने प्राप्त करने के लिए पर निर्भर करता है। हाल ही में, हम assays यहाँ वर्णित इस्तेमाल evidenc प्रदान करने के लिएOkazaki टुकड़े की दीक्षा में gp4 की primase डोमेन से प्राइमर रिहाई के महत्व के ई। इसके अतिरिक्त, हम कुशल प्राइमर गठन और उपयोग को बढ़ावा देने में 8, T7 एकल असहाय डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन, gp2.5 के लिए एक नियामक की भूमिका के सबूत नहीं मिला।

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Protocol

नोट: इस तरह के दस्ताने सहित, लेकिन, सुरक्षा चश्मा, प्रयोगशाला कोट, और उचित एक्रिलिक ढाल के रूप में, तक ही सीमित नहीं व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग, सुरक्षित उपयोग और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के संबंध में सभी संस्थागत नियमों का पालन करें।

नोट: मानक बफर 40 मिमी HEPES-कोह, पीएच 7.5, 50 मिमी पोटेशियम ग्लूटामेट, 5 मिमी डीटीटी, 0.1 मिमी EDTA (इस बफर एक 5x एकाग्रता में पूर्व बनाया जाता है) और प्रत्येक dNTP के 0.3 मिमी के होते हैं। T7 प्रतिकृति प्रोटीन 8 वर्णित, 9, 10 के रूप में शुद्ध कर रहे हैं। एक भी T7 primase मान्यता साइट (5'-GGGTC -3 ', 5'-GTGTC -3', 5'-TGGTC-3 ') युक्त एकल असहाय डीएनए डीएनए संश्लेषण कंपनियों की एक किस्म (की लंबाई से खरीदा जा सकता है ssDNA T7 primase के लिए पसंद की एंजाइम पर निर्भर हो सकता है, एक pentamer एक पूरी लंबाई की प्राइमर के संश्लेषण के लिए न्यूनतम लंबाई टेम्पलेट है 11, के रूप में गुप्त सी आवश्यक है, हालांकि, अगर प्राइमर पोलीमर्स द्वारा बढ़ाया जा रहा है, अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड टेम्पलेट के 3 'अंत में उपस्थित होना चाहिए। प्रतिक्रियाओं 10 मिमी 2 MgCl के अंतिम एकाग्रता के अलावा द्वारा शुरू की और 25 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं। मैनुअल नमूने 5 सेकंड या अधिक से अधिक का समय अंक के लिए अच्छी तरह से काम करता है। उस से भी कम समय अंक आवश्यक हैं, तो यह सही आंकड़ा प्राप्त करने के लिए एक तेजी से बुझाना प्रवाह साधन का उपयोग करने की सिफारिश की है।

मैनुअल नमूना द्वारा 1. कई कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रिया

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, विभाज्य 2 formamide डाई बफर के μL (93% (वी / वी) formamide, 50 मिमी EDTA, 0.01% xylene cyanol और 0.01% bromophenol नीला) 8 1.5 एमएल polypropylene ट्यूबों में। सामान्य में, ट्यूब की संख्या समय अंक का विश्लेषण की संख्या के बराबर है।
  2. एक 20 μL मिश्रण 1x बफर, 0.1 मिमी एटीपी और CTP, 0.25 एमसीआई / एमएल [32 पी α-] सीटीपी मिलकर तैयार करें, 0.1 माइक्रोन के एसएसडीएनए टेम्पलेट, और 0.1 माइक्रोन के gp4 (hexamer एकाग्रता के रूप में व्यक्त - 0.6 माइक्रोन के मोनोमर)।
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
  4. एक pipettor का उपयोग मिश्रण के 2 μL निकालें और कोई प्रतिक्रिया नियंत्रण (समय शून्य) के लिए 1.1 चरण में तैयार एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 2 μL formamide डाई बफर के साथ मिश्रण।
  5. 0.1 एम 2 MgCl प्रतिक्रिया मिश्रण करने के 2 μL (10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) जोड़ें।
  6. मैन्युअल 10 S अंतराल पर एक pipettor का उपयोग प्रतिक्रिया मिश्रण के 2 μL नमूने वापस लेने और 1.1 चरण में तैयार 1.5 एमएल ट्यूबों में predispensed formamide डाई के साथ मिश्रण।
  7. एक गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी नमूने हैं।
  8. एक denaturing जेल पर नमूने की aliquots लोड। bisacrylamide: छोटे tetraribonucleotide प्राइमर T7 primase द्वारा संश्लेषित उत्पादों को अच्छी तरह एक 0.4 मिमी मोटी 25% एक्रिलामाइड हल कर रहे हैं (19: 1), 3 एम यूरिया, 1x TBE (100 मिमी Tris-borate, 1 मिमी EDTA)।
  9. chromatogra पर पूरे जेल की जगहबनावट कागज और प्लास्टिक की चादर के साथ कवर। सूखी जेल एक जेल सुखाने की मशीन का उपयोग कर।
  10. , यानी प्रतिक्रिया मिश्रण के शेष के कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार है और एक ही मात्रा क्रोमैटोग्राफी कागज पर जेल पर लोड हाजिर, कमजोर पड़ने के 4 μL हाजिर अगर नमूना के 4 μL भरी हुई थी।
    नोट: यह मानक वक्र प्रतिक्रिया के दौरान गठित उत्पादों की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए के रूप में काम करेगा। उदाहरण के लिए, पांच गुना dilutions ते बफर (10 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA) अच्छी तरह से काम करते हैं, की एक सीमा का उपयोग कर फैले 01:25 1: 15,625 (5 2 -5 6), लेकिन dilutions चाहिए गतिविधि के स्तर के आधार पर समायोजित किया जाए।
  11. सूखी जेल और मानक एक phosphorimager स्क्रीन का उपयोग बेनकाब। कमजोर पड़ने श्रृंखला में रेडियोधर्मिता यों और 8 के रूप में वर्णित एक मानक वक्र का निर्माण, 12
    नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए T7 डीएनए पोलीमरेज़ का समावेश एक EXA के लिए अनुमति देता हैमेरा इस एंजाइम द्वारा tetraribonucleotide प्राइमरों का उपयोग। बेहतर, पोलीमर्स एकाग्रता डेटा की व्याख्या सरल करने के लिए संतृप्त किया जाना चाहिए। 0.4 माइक्रोन या अधिक की एक पोलीमर्स एकाग्रता अच्छे परिणाम देता है। इसके अतिरिक्त, इस तरह के एकल असहाय डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन, या तो प्राइमर संश्लेषण या ठंड-कतरा दीक्षा पर के रूप में अन्य प्रोटीन, के प्रभाव के इस तरीके से जांच की जा सकती है।

2. एकाधिक कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रिया एक तेजी से बुझाना साधन का उपयोग कर

  1. प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
    1. 1x बफर, 0.2 माइक्रोन gp4 hexamer, 0.2 माइक्रोन ssDNA टेम्पलेट, 0.6 मिमी dNTPs, 0.2 मिमी एटीपी और CTP (0.5 एमसीआई / एमएल [α- 32 पी] सीटीपी सहित युक्त समाधान ए के 400 μL तैयार करें।
    2. समाधान बी के 400 μL तैयार करें, 1x बफर और 20 मिमी 2 MgCl युक्त।
  2. तेजी से बुझाना प्रवाह साधन के आपरेशन
    1. रैप चालू करेंID-बुझाना प्रवाह साधन; मुख्य मेनू प्रकट होता है के बाद, साधन कीबोर्ड पर टाइप 7 घर की स्थिति के लिए सिरिंज चालक स्थानांतरित करने के लिए।
    2. "लोड" के लिए खुला बफर सिरिंज की स्थिति।
  3. बफर लोड हो रहा है सीरिंज
    1. ड्राइव सिरिंज बंदरगाह के लिए एक 10 एमएल सिरिंज युक्त बफर संलग्न। "लोड" के लिए सिरिंज घुंडी स्थिति बदलें।
    2. 10 एमएल सीरिंज का प्रयोग, 10 मिमी Tris, पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA के साथ साधन बफर जलाशय ए और बी भरने और बुझाना समाधान (250 मिमी EDTA, और 0.2% एसडीएस) के साथ सिरिंज सी भरें। में और बाहर plungers धक्का द्वारा हवाई बुलबुले निकालें।
    3. "आग" को घुंडी बदलें पदों। टाइप 2 सिरिंज चालक बार की स्थिति को समायोजित करने के लिए। प्रेस सिरिंज कम जब तक बफर बाहर निकलें पाश आता है करने के लिए बटन "नीचे समायोजित": (नीचे लगातार 7 चला जाता है, 8-बड़े कदम के नीचे; नीचे 9-छोटे कदम)। टाइप करें "ईएससी" मुख्य मेनू पर लौटने के लिए।
  4. धो ट्यूबिंग
    1. Attवैक्यूम करने के लिए बाहर निकलने के ACH लाइन। नमूना knobs के लिए "फ्लश" बदलें। बंद क्षैतिज स्थिति के लिए knobs की स्थापना करके बफर सिरिंज। वैक्यूम चालू करें और 10 एस के लिए एच 2 ओ में 2 फ्लश छोरों डुबकी, तो 10 S के लिए MeOH में डुबकी। के लिए ~ 15 एस हवा चूसने से सूखी छोरों, या सूखी जब तक।
  5. नमूने लोड हो रहा है
    1. "लोड" के लिए नमूना बदलें घुंडी स्थिति। समाधान एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में रखें। नमूना लोड बंदरगाहों में से एक में सिरिंज प्लग। समाधान बी के लिए दोहराएँ, और विपरीत नमूना लोड बंदरगाह में जगह है।
  6. समय अंक का संग्रह
    1. मुख्य मेनू पर, बुझाना प्रवाह रन के लिए टाइप 1। प्रतिक्रिया समय (एस) और प्रेस दर्ज, "प्रवेश"। प्रतिक्रिया पाश नंबर का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित किया जाएगा। अपेक्षित प्रतिक्रिया पाश में स्विच करें। कदम 2.2.4 में धो दोहराएँ प्रक्रिया।
    2. नमूना knobs के लिए "लोड" मुड़ें। लोड प्रतिक्रिया सिर्फ केंद्रीय मिश्रण डिब्बे के बाहर जब तक नमूना छोरों में घोला जा सकता है। सभी knobs बारी "प्राथमिकीई "। पुष्टि करें कि सभी knobs सही स्थिति में हैं।
    3. बाहर निकलने के पाश के अंत पर रखें 1.5 एमएल ट्यूब। प्रेस "जाओ" प्रतिक्रिया चलाने के लिए। कदम 2.2.4 में धो दोहराएँ प्रक्रिया। पुनः लोड बफर सीरिंज ए और बी, जब तक वे ड्राइवर मारा।
    4. दोहराएँ कदम 2.2.6.2-2.2.6.3 प्रत्येक वांछित समय बिंदु के लिए। अपवाद: प्रारंभ अभिकर्मक (यानी, इस मामले में MgCl 2) जब शून्य समय बिंदु नियंत्रण शमन युक्त समाधान लोड नहीं है।
    5. जब नमूने एकत्र समाप्त, मुख्य मेनू पर लौटने के लिए "ईएससी" दर्ज करें। अपने घर की स्थिति के लिए बफर सिरिंज चालक वापस करने के लिए प्रेस "7"।
  7. साधन साफ-अप
    1. प्रतिक्रिया मिश्रण सीरिंज निकालें। नमूना लोड हो रहा घुंडी करने के लिए "लोड" स्थिति बदल जाते हैं। वैक्यूम के अंतर्गत, 10 एमएल 0.2 एन NaOH के साथ प्रत्येक नमूना पाश, 10 एमएल 0.3 राष्ट्रीय राजमार्ग 3 पीओ 4 और 10 एमएल MeOH के द्वारा पीछा धो लें।
    2. चालू करने के लिए "लोड" स्थिति सिरिंज knobs। सभी 3 SYR पर नीचे प्रेसइंगे plungers प्रतिक्रिया और बुझाना बफ़र्स निकालते हैं। धोने में कम से कम दो बार 5 एमएल एच 2 ओ के साथ सीरिंज।
    3. 5 एमएल एच 2 ओ के साथ फिर से सीरिंज भरें और knobs "आग" स्थिति बदल जाते हैं। घुंडी स्थिति को बदलने और हटाने के लिए एच 2 ओ फ्लश कदम 2.2.4 के रूप में निर्वात पर बारी। साधन बंद कर दें।
      नोट: उत्पाद कदम 1.7-1.12 में वर्णित के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं। इसके अलावा, T7 डीएनए पोलीमरेज़ और अन्य प्रतिकृति प्रोटीन संश्लेषण प्राइमर या विस्तार पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जा सकता है।

3. एकल कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रिया

नोट: एकल कारोबार प्राइमर संश्लेषण / विस्तार assays के बाहर कुछ बड़े अंतर के साथ, कई-कारोबार प्रतिक्रियाओं को इसी तरह से किया जाता है: इन assays प्राइमर या विस्तार उत्पादों में radiolabeled एटीपी के रूपांतरण, हालांकि substrates की एकाग्रता का पालन करें और प्रोटीन considera हैंBly अधिक है। इसके अलावा, आदेश मिलीसेकंड संकल्प प्राप्त करने के लिए प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रिया के विश्लेषण अनुमति देने के लिए, एक एक तेजी से बुझाना प्रवाह मशीन का उपयोग करना चाहिए।

  1. प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना।
    1. 1x बफर, 3 सुक्ष्ममापी gp4 hexamer, 6 माइक्रोन ssDNA टेम्पलेट, 0.6 मिमी dNTPs, 1 मिमी सीटीपी, और 2 एनएम [32 γ- पी] एटीपी युक्त समाधान ए के 400 μL तैयार करें। समाधान बी के 400 μL तैयार करें, 1x बफर और 20 मिमी 2 MgCl युक्त।
  2. रैपिड-बुझाना प्रवाह आपरेशन
    1. 2.2 कदम के रूप में वर्णित प्रतिक्रियाओं बाहर ले। अगर वांछित, क्रमश: 15 और 20 माइक्रोन के माइक्रोन की एकाग्रता पर T7 डीएनए पोलीमरेज़ या T7 एकल असहाय डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन जोड़ें। इस मामले में, विस्तार उत्पादों को एक समय शासन है कि प्रतिक्रिया के मैनुअल नमूना लेने के लिए अनुमति देता है पर जमा है।

4. डेटा विश्लेषण

  1. गैर रेखीय least- करने के लिए फ़िट उत्पाद प्रगति घटताव्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कम से कम वर्गों में सक्षम फिट बैठता है और / या संख्यात्मक एकीकरण चौकों मॉडल। ऑपरेशन का ब्यौरा कार्यरत सॉफ्टवेयर के साथ अलग अलग होंगे, लेकिन नीचे डेटा फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया समीकरणों की सामान्यीकृत रूप हैं।
  2. एक रेखीय समीकरण को घटता प्रगति के लिए फिटिंग द्वारा कई कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के उत्पाद गठन की दर निर्धारित करते हैं। अगर वहाँ महत्वपूर्ण वक्रता, एक एकल घातीय समारोह के लिए डेटा फिटिंग द्वारा प्रारंभिक दर विधि 13, 14 का उपयोग करें: y = एक (ई - कश्मीर टी), जहां y उत्पाद एकाग्रता है, एक प्रतिक्रिया आयाम, कश्मीर है मनाया दर लगातार, टी सेकंड में समय है। समय = 0 पर स्पर्श रेखा की ढलान प्रारंभिक दर है।
    नोट: एक रेखीय समीकरण को या पूर्व स्थिर राज्य फट समीकरण के लिए फ़िट पूर्व स्थिर राज्य प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं y = एक (ई - कश्मीर बूआरएसटी टी) + दर एस एस टी, जहां एक प्रतिक्रिया आयाम है, कश्मीर फट पूर्व स्थिर राज्य फट के लिए मनाया दर स्थिर है, दर एसएस स्थिर राज्य दर एस एस = कश्मीर बिल्ली [एनजाइम]) है, टी समय है , कुछ लम्हों में। फ़िट एकल कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं प्रगति एक एकल घातीय समारोह y = एक करने के लिए घटता (ई - कश्मीर टी)। Gp4 के मामले में, डेटा संख्यात्मक एकीकरण 15 से, तीन एनटीपी संक्षेपण कदम है, जहां प्रत्येक मध्यवर्ती एंजाइम के साथ संतुलन में है के साथ एक मॉडल के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग फिट बैठते हैं।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के चरण 1, अर्थात् में वर्णित के रूप में स्वयं एक प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रिया एकाधिक कारोबार की शर्तों के तहत gp4 द्वारा उत्प्रेरित नमूने द्वारा, चित्रा 1 ए में दिखाया परिणाम प्राप्त किया गया। इधर, जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद उत्पादों की एक श्रृंखला प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं (चित्रा 1 ए) में α-स्थिति पर 32 पी के साथ लेबल सीटीपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। लेबल अग्रदूत, सीटीपी, उच्चतम गतिशीलता पता चलता है और जेल के नीचे, धीमी पलायन di-, त्रिकोणीय को इसी प्रजातियों, और tetraribonucleotides gp4 द्वारा संश्लेषित द्वारा पीछा किया ओर माइग्रेट करती है। ऊष्मायन की लंबाई, और टेम्पलेट अनुक्रम संदर्भ पर निर्भर करता है, अतिरिक्त लेबल उच्च oligomers (pentaribonucleotides, आदि) के लिए इसी उत्पादों मनाया जा सकता है। एक प्रतिक्रिया प्रगति वक्र पहले (पूर्ण लंबाई प्राइमरों की एकाग्रता का निर्धारण करने में, tetra- है द्वारा साजिश रची हैऔर प्रत्येक timepoint पर और समय के एक समारोह के रूप में संश्लेषित प्राइमरों की एकाग्रता की साजिश रचने pentaribonucleotides)।

स्थिर राज्य से डेटा प्राप्त करते हैं, कई-कारोबार प्रयोगों अपेक्षाकृत आसान है, डेटा की जानकारी सामग्री बंधन और उत्पाद जारी की घटनाओं, अर्थात्।, इन घटनाओं को आम तौर पर हावी है या बहुत निर्धारण के रूप में डेटा बहुत सब्सट्रेट द्वारा परिभाषित किया गया है, कुछ हद तक सीमित है कश्मीर एम और कश्मीर बिल्ली 16 महत्व देता है। प्रतिक्रिया काफी कम समय अंक पर मनाया जाता है, तो इससे पहले कि स्थिर राज्य की स्थापना की है (दूसरे शब्दों में, पूर्व स्थिर राज्य) तक अधिक से अधिक जानकारी सामग्री गतिज प्रयोगों से प्राप्त किया जा सकता है। पूर्व स्थिर अवस्था में प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के बारे में जानकारी का एक निधि प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अगर एक उत्पाद गठन की "पूर्व स्थिर राज्य फट" मनाया जाता है, यह अच्छा संकेत है कि उत्पाद जारी एक दर सीमित कदम है मैंप्रतिक्रिया एन। इसके अलावा, एक प्रतिक्रिया के पूर्व स्थिर राज्य चरण से उत्पाद गठन की दर (या रसायन विज्ञान कदम) निकाल सकते हैं। इसके विपरीत, यदि उत्पाद गठन के एक पटाखे नहीं मनाया जाता है, तो यह सबूत है कि राज्य स्थिर दर या तो रासायनिक कदम है, या एक कदम यह पूर्ववर्ती से और उस उत्पाद की रिहाई की तुलना में तेजी है सीमित है।

जब एक तेजी से बुझाना साधन कुछ मिसे (प्रोटोकॉल का चरण 2) करने के लिए नीचे प्रतिक्रिया सेकंड की रेंज में समय के तराजू में gp4 द्वारा उत्प्रेरित जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह स्पष्ट है कि प्राइमर संचय रैखिक नहीं है, लेकिन एक biphasic प्रदर्शित करता है प्रोफ़ाइल (चित्रा 1 बी, ठोस लाइन)। यह एक नैदानिक ​​उत्पाद संचय के एक पूर्व स्थिर राज्य फट, जो पता चलता है कि उत्पाद के गठन की तेजी है और कहा कि रिहाई दर सीमित स्थिर अवस्था में है के लिए सबूत का प्रदर्शन परिणाम है। अन्य एंजाइम सिस्टम यह नहीं दिखा सकते हैंव्यवहार। उदाहरण के लिए, एक काल्पनिक प्रगति की अवस्था में प्रस्तुत किया है जो अगर gp4 द्वारा प्राइमर गठन के एक पूर्व स्थिर राज्य फट (चित्रा 1 बी, बिंदीदार रेखा) के साथ आगे बढ़ना नहीं था पर नतीजा होगा। जैसे कि इन मामलों में, व्याख्या यह है कि उत्पाद गठन किया जाएगा, या एक कदम यह पूर्ववर्ती, दर सीमित कदम है।

पूर्व स्थिर राज्य कैनेटीक्स का एक और अवतार एकल कारोबार प्रयोग है, जहां लेबल सब्सट्रेट के एक कम एकाग्रता एंजाइम की मात्रा को संतृप्त से (के रूप में अच्छी तरह से डीएनए और CTP के रूप में, gp4 के मामले में) के लिए बाध्य किया जाता है। इस प्रकार के प्रयोग करने के लिए उत्पाद सब्सट्रेट के रूपांतरण के दौरान गठन और मध्यवर्ती प्रजाति के क्षय के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए विशिष्ट रूप से अनुकूल है। Gp4 उत्प्रेरित प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल के चरण 3) में, प्राइमर गठन के तीन nucleotidyl हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं का परिणाम है। हाल ही में, हम जानकारी प्रकट करने के लिए एकल कारोबार प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल कियाप्राइमर मध्यवर्ती 8 (चित्रा 1 सी) तीन nucleotidyl हस्तांतरण कदम की एक अनुक्रमिक मॉडल है, जहां ribonucleotide मध्यवर्ती gp4 के साथ संतुलन में हैं समय पर निर्भर संचय और di-, त्रिकोणीय, और tetraribonucleotide उत्पादों के लापता होने के बारे में फिटिंग द्वारा।

आकृति 1
चित्रा 1: T7 primase-helicase द्वारा प्राइमर संश्लेषण की काइनेटिक विश्लेषण। (ए) एक भी पीआरएस के साथ एक ssDNA पर gp4 द्वारा प्राइमर गठन के समय पाठ्यक्रम। नमूने 2 MgCl (समय = 0) के अलावा करने से पहले हटा दिया है और उसके अलावा निम्नलिखित अंतराल पर नमूना थे। उत्पाद जेल छवि के बाईं ओर संकेत कर रहे हैं। (बी) ठोस पंक्ति: gp4 द्वारा प्राइमर गठन के एक पूर्व स्थिर राज्य फट दर्शाती है। मान कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब कर रहे हैं। बिंदीदार एलine: अगर gp4 उत्प्रेरित प्रतिक्रिया एक पूर्व स्थिर राज्य फट बिना दीं एक प्रतिक्रिया प्रगति अवस्था का प्रतिनिधित्व। 8 से संशोधित। (सी) gp4 द्वारा एकल कारोबार प्राइमर संश्लेषण। वाम: टेट्रामर गठन के समय पाठ्यक्रम। अधिकार: समय बनाम मध्यवर्ती गठन की साजिश है। मान कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब कर रहे हैं। डेटा संख्यात्मक एकीकरण से फिट किया गया; ठोस लाइनों फिट दिखाने के लिए। 8 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इन प्रयोगों का प्रदर्शन करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक अत्यधिक सक्रिय शुद्ध एंजाइम की उपलब्धता है। gp4 के साथ अपने काम के दौरान, उदाहरण के लिए, हम 50% ग्लिसरॉल युक्त बफर में शुद्ध एंजाइम की है कि भंडारण (20 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4, 0.1 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी) -20 डिग्री सेल्सियस पर पाया में कमी आती है कुछ महीनों में तैयार करने की विशिष्ट गतिविधि। इसलिए अब हम 25 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 50 मिमी NaCl, 0.1 मिमी EDTA, 1 मिमी TCEP में शुद्ध gp4, और 10% ग्लिसरॉल के फ्लैश फ्रीज छोटे aliquots तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। तेजी से बुझाना प्रवाह साधन का उपयोग कर, विशेष रूप से पहले कुछ नमूने के अधिग्रहण के दौरान है, यह अभिकारकों प्रतिक्रिया तापमान (कमरे के तापमान) प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, महान देखभाल के क्षेत्र में किसी भी शेष बुझाना अभिकर्मक के रूप में, अच्छी तरह से ट्यूबिंग (प्रोटोकॉल के कदम 2.2.4) प्रत्येक समय बिंदु के बाद साफ करने के लिए लिया जाना चाहिएलाइन बहुत एंजाइम गतिविधि को बाधित, गलत परिणाम के लिए अग्रणी होगा। दूसरा विचार यह polyacrylamide जेल और अपने को संभालने की रचना शामिल है। प्राइमर संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में उत्पादों gp4 द्वारा उत्प्रेरित कम से कम 20% से कम एक्रिलामाइड साथ जैल में अच्छी तरह से हल नहीं है। वास्तव में, 15% जैल में, न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट और सभी प्रतिक्रिया उत्पादों रेडियोधर्मिता का एक अस्पष्ट क्षेत्र के रूप में पलायन। इसलिए, यह तदनुसार एक्रिलामाइड प्रतिशत समायोजित करने के लिए अत्यधिक की सलाह दी जाती है अगर छोटे ribonucleotide उत्पादों का विश्लेषण किया जा सकता है। एक्रिलामाइड के एक उच्च प्रतिशत से युक्त है कि वे कागज के लिए अच्छी तरह से छड़ी नहीं है जैल का उपयोग करने का एक बड़ा नुकसान; इसलिए महान देखभाल के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए सुखाने के लिए कागज क्रोमैटोग्राफी करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अंत में, एक्रिलामाइड के एक उच्च प्रतिशत से युक्त जैल वैक्यूम संचालित जेल dryers में दरार करने के लिए करते हैं। हम पाते हैं कि 65 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम सुखाने जैल के कम खुर की ओर जाता है। वैकल्पिक रूप से, जैल भास्वर से अवगत कराया जा सकता हैसुखाने के बिना इमेजर स्क्रीन।

प्रतिक्रिया की स्थिति और अभिकर्मकों में बदलाव कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग परीक्षण किया जा सकता की एक बड़ी संख्या है, और जो हम gp4 के हमारे अध्ययन में पीछा कर रहे हैं, उत्परिवर्ती एंजाइमों के enzymatic व्यवहार के परीक्षण से लेकर, ख्यात छोटे के अलावा के प्रभाव की जांच इस तरह के न्यूक्लियोटाइड analogs, साथ ही वैकल्पिक डीएनए टेम्पलेट्स, या धातु आयन सहकारकों के रूप में अणु inhibitors या activators, या वैकल्पिक substrates। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित प्रतिक्रिया तापमान के रूप में कमरे के तापमान का उपयोग करता है। एक और प्रतिक्रिया तापमान वांछित है, सबसे तेजी से बुझाना उपकरणों एक वाल्व है कि एक एक गर्मी नियंत्रित पानी से स्नान करने के लिए साधन कनेक्ट करने के लिए अनुमति देता है होते हैं। मामलों में जहां electrophoretic उत्पाद जुदाई संतोषजनक नहीं है, खासकर अगर प्रतिक्रिया बफर एक उच्च एकाग्रता (> 200 मिमी) नमक का होता है में, यह alkaline फॉस्फेट 1-10 इकाइयों के साथ शमन के बाद नमूनों का इलाज और 3 पर सेते करने की सलाह दी जाती हैकम से कम 30 मिनट के लिए 7 डिग्री सेल्सियस। इस NTPS और ribonucleotide उत्पादों से टर्मिनल triphosphates निकालने और उनके electrophoretic जुदाई में वृद्धि होगी। बहरहाल, यह केवल व्यावहारिक अगर न्यूक्लियोटाइड α स्थिति पर लेबल है।

एक तेजी से बुझाना साधन का उपयोग उच्च throughput विश्लेषण के लिए सुविधाजनक नहीं है। एक अनुभवी उपयोगकर्ता तेजी से बुझाना प्रवाह प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, नमूना तैयार करने से शुरू, लगभग 18 समय अंक एकत्रित करना, और लगभग दो घंटे में साधन की सफाई प्रदर्शन कर सकते हैं। एक अतिरिक्त समय की कमी के समय जेल वैद्युतकणसंचलन, जेल जोखिम, और डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक है। एक और सीमा एक ठेठ प्रयोग प्रतिक्रिया मात्रा के 500 से 1000 μL की आवश्यकता है, और पर्याप्त एंजाइम प्राप्त प्रोटीन का मामला है कि कुशलता से व्यक्त नहीं कर रहे हैं में चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

वहाँ assays कि प्रथम के उच्च throughput स्क्रीनिंग सक्षम विकसित करने में बहुत रुचि हैएसई गतिविधि, विशेष रूप से उपन्यास जीवाणुरोधी चिकित्सा विज्ञान विकसित करने के लिए 17, 18। Primase गतिविधि के लिए गैर रेडियोधर्मी, निरंतर assays के विकास के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, इन assays दो प्रमुख सीमाओं से पीड़ित हैं और इस प्रकार तेजी से गतिज जांच में उनके उपयोग में बाधा, यानी, पर्याप्त समय संकल्प और उत्पाद संवेदनशीलता की कमी है। इसलिए, रेडियोधर्मी, असंतत परख यहाँ वर्णित वर्तमान में gp4 द्वारा primase गतिविधि की गतिज परीक्षा में सोने के मानक, और सामान्य में डीएनए primases है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के और अधिक परिष्कृत embodiments, एक एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रिया एक तेजी से बुझाना प्रवाह साधन का उपयोग करने की गतिज मार्ग के निर्धारण में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए substrates की गतिज विभाजन का निर्धारण करने का इरादा पल्स-चेस प्रयोगों में।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris pre-set crystals
pH 7.5		 SIGMA T4128
Tris base SIGMA 93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate SIGMA G1501 
Magnesium chloride hexahydrate Mallinckrodt Chemicals 5958-04
1,4-Dithiothreitol J.T. Baker F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate MP Biomedicals 811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate Mallinckrodt Chemicals 4931-04
[α-32P] CTP PerkinElmer BLU508H radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP PerkinElmer BLU502A radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP  Affymetrix 77100 four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP Epicentre RN02825 part of NTP set
ssDNA constructs Integrated DNA Technologies N/A custom sequences 
methanol  Macron Fine Chemicals 3017-08
formamide Thermo Scientific 17899
bromophenol blue SIGMA B8026 
cylene xyanol  SIGMA X4126 
acrylamide SIGMA A9099 Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide SIGMA M7279  Toxic
Urea Boston Bioproducts P-940
Boric acid Mallinckrodt Chemicals 2549
Rapid Quench-Flow Instrument  Kintek Corp. RQF-3 
Kintek Explorer Kintek Corp. N/A
Kaleidagraph  Synergy Software N/A

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References

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आनुवंशिकी अंक 120 डीएनए संश्लेषण replisome कैनेटीक्स तेजी से बुझाना primase पोलीमर्स
ठंड-कतरा डीएनए संश्लेषण की काइनेटिक्स<em&gt; इन विट्रो</em&gt; जीवाणुभोजी T7 प्रतिकृति प्रोटीन से
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Hernandez, A. J., Richardson, C. C.… More

Hernandez, A. J., Richardson, C. C. Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Vis. Exp. (120), e55312, doi:10.3791/55312 (2017).

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