Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Kaplama DNA sentezinin kinetiği doi: 10.3791/55312 Published: February 25, 2017

Introduction

DNA replikasyon bütün hücresel yaşam korunmuş bir özelliğidir. Çoğaltma bileşenlerinin kimlik ve sayısı çok çeşitlilik gösterirken, genel mekanizmalar evrim 1 arasında paylaşılır. Burada, T7 replizom bileşenleri ile in vitro koşullarında geri kalmış iplikli DNA sentezinin kinetik anlamaya yönelik radyoaktif substratlar kullanılarak jel bazlı, sürekli olmayan kinetik deneyler tarif eder. Bakteriyofaj T7 çoğaltma makineleri sadece dört protein (DNA polimeraz, GP5, ve processivity faktörü, E coli tiyoredoksin, iki fonksiyonlu primaz-sarmal GP4, ve tek sarmallı DNA bağlama proteini, GP2 oluşan çok basittir. 5) 2. Bu özellik, DNA replikasyonu katılan korunmuş biyokimyasal mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistem yapar.

Özel önem, T7 DNA ile ribonükleotid primerlerin oluşumunun yerleştirilir bir Critica primazDNA sentezinin başlamasından l adımı. Buna ek olarak, bir de, reaksiyon karışımına ekleyerek, T7 DNA polimerazı veya başka kopyalama proteinlerine bu primerlerin kullanımı incelenebilir. T7 primaz-helikaz, GP4 primaz tanıma siteleri ya da PRS olarak adlandırılan özel DNA dizileri DNA sentezi için primerlerin oluşmasını (5'-GTC-3 ') katalize eder. PRS sitozin sitenin tanınması için gerekli olan, şifreli, ancak ürünün 3 kopyalanır değildir. GP4 ile astar sentezlenmesinde birinci basamak, daha sonra bir trimer genişletilmiş ve fonksiyonel olarak tetranukleotıd primerlere pppACCC, pppACCA veya pppACAC şablon 4 sekansına bağlı olan dinükleotidin pppAC, oluşturulmasını içerir. Bu primerler daha sonra da GP4 destekli proses 5, 6, DNA sentezini başlatmak için T7 DNA polimerazı ile kullanılabilmektedir. Bu bağlamda, primazetki, çıkmalarını engelleyen, şablonla son derece kısa tetraribonucleotides stabilize polimeraz aktif bölge 7 içine astar / şablon güvence için elverişli bir şekilde DNA polimeraz yürütmektedir. Bu adımlar (RNA primer sentezi, polimeraz primer yayınım ve uzatma) gecikmeli iplikçik çoğaltmak için birden fazla döngüleri tekrarlanır ve lider sarmalı replikasyonu ile koordine edilmelidir.

Burada tarif edilen deneyler, son derece hassas olan ve bir orta seviyede bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, nispeten düşük verimlilik ve büyük bir dikkatle radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertaraf olunmalıdır. Reaksiyon, bir sabit veya önceden kararlı durumda ya reaksiyon zamanı derslerin anlamlı analiz için mükellef zaman ölçeklerinde örnekleri ulaşmak için hızlı-söndürme cihazı istihdam olabilir hangi hızına bağlı olarak. Son zamanlarda, biz deneyleri Evidenc sağlamak için burada açıklanan kullanılanOkazaki parçaları başlamasında GP4 ve primaz alanından astar salınımının önemi, e. Ayrıca, verimli astar oluşumu ve kullanımı 8. teşvik, protein, gp2.5 bağlayıcı T7 tek iplikli DNA için bir düzenleyici rolünün kanıt bulunamadı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: dahil ancak, eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve uygun akrilik kalkan olarak, sınırlı kişisel koruyucu ekipman kullanımı değil, radyoaktif malzemenin güvenli kullanımı ve bertarafı ile ilgili tüm kurumsal düzenlemelere uyun.

Not: standart tampon 40 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA (Bu tampon 5x konsantrasyonda önceden yapılır) ve her dNTP 0.3 mM oluşur. T7 kopyalama proteinleri, 10 9, 8 tarif edildiği gibi saflaştırılır. Tek bir T7 primaz tanıma sitesi (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') ihtiva eden tek şeritli DNA, DNA sentezi, çeşitli şirketler (uzunluğu satın alınabilir ssDNA T7 primaz için, tercih edilen bir enzim bağlı olabilir, bir pentamer tam uzunlukta bir astar sentezlenmesi için en az bir şablon uzunluğu 1Şifreli Cı esas olarak astar polimerazı ile genişletilmesi için ise 1, ancak, ek nükleotidleri şablonunun 3 'ucunda mevcut olması gerekmektedir. Reaksiyonlar, 10 mM MgCl2 nihai bir konsantrasyona ilave edilmesi ile başlatılır ve 25 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Manuel örnekleme 5 saniye veya daha fazla zaman noktaları için iyi çalışır. daha kısa zaman noktası gerekir, doğru veri elde etmek için bir hızlı soğutma akış aleti kullanmak tavsiye edilir.

Manuel Örnekleme yoluyla 1. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu

  1. Deneye başlamadan önce, formamid boya tamponu kısım 2 uL (% 93 (h / h) formamid, 50 mM EDTA,% 0.01 iksilen siyanol, mavi,% 0.01 bromofenol) 8 1.5 ml polipropilen tüplere. Genel olarak, tüp sayısı analiz zaman noktalarının sayısına eşittir.
  2. , 1 x tampon, 0.1 mM ATP ve CTP, 0.25 mCi / ml [32P α-] CTP oluşan bir 20 uL karışım hazırlayın 0.1 uM SSD(Heksamer konsantrasyon olarak ifade - 0.6 mcM monomer) NA şablon ve 0.1 uM GP4.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
  4. Bir pipet kullanarak karışımı 2 mcL çıkarın ve hiçbir tepki kontrolü (zaman sıfır) için adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüp içinde 2 mL formamid boya tamponu ile karıştırın.
  5. (10 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar), reaksiyon karışımına 0.1 M MgCl2 2 uL ekleyin.
  6. El ile 10 s aralıklarla pipet kullanarak reaksiyon karışımlarının 2 uL örneklerinin alınması ve adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüpler içinde predispensed formamid boya ile karıştırın.
  7. ısı bloğu 5 dakika boyunca 95 ° C de bir ısı örnekleri.
  8. Bir denatüre jel üzerine örneklerin hacimde yükleyin. bisakrilamid T7 primaz tarafından sentezlenen, küçük tetraribonucleotide astar ürünleri 0.4 mm, kalın% 25 akrilamid çözümlenir (19: 1), 3 M üre, 1 x TBE (100 mM Tris-borat, 1mM EDTA).
  9. Kromatografi üzerinde tüm jel yerleştirinplastik örtü ile phy kağıt ve kapak. Bir jel kurutucu kullanılarak kuru jel.
  10. Reaksiyon karışımının geri kalan kısmının bir seyreltme serisi hazırlamak ve kromatografi kağıdı üzerine jel üzerine yüklenmiş aynı ses nokta, yani, numunenin 4 uL yüklendiğindekiyle seyreltme 4 ul nokta.
    NOT: Bu reaksiyon sırasında oluşan ürün konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri olarak hizmet edecektir. Örneğin, TE tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA), bir dizi yayılan iyi iş kullanarak beş kat seyreltme 1:25 ila 1: 15.625 (5 2 -5 6), ama seyreltme olmalıdır aktivitenin seviyesine bağlı olarak ayarlanabilir.
  11. Bir Phosphorimager ekranını kullanarak kuru jel ve standart Açığa. 12 dilüsyon seri radyoaktivite ölçme ve 8 açıklandığı gibi bir standart eğri oluşturmak
    Not: Reaksiyon karışımına, T7 DNA polimerazı dahil edilmesi, bir eksa sağlarbenim bu enzim tarafından tetraribonucleotide primerlerin kullanımı. En uygun olarak, polimeraz konsantrasyonu verilerin yorumlanması kolaylaştırmak için doyurarak olmalıdır. 0.4 uM ya da daha yüksek bir polimeraz konsantrasyonu iyi sonuçlar verir. Ek olarak, astar sentezi veya gecikmeli iplikli başlatılması, ya da tek sarmallı DNA bağlayıcı proteinler gibi başka proteinler, etkisi bu şekilde incelenebilir.

Bir Rapid-söndürme Enstrüman kullanma 2. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu

  1. Reaksiyon karışımlarının hazırlanması
    1. 1x tampon, 0.2 mM ATP ve CTP (CTP [32 P α-] 0.5 mCi / mL olmak üzere 0.2 uM GP4 heksamer, 0.2 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP içeren, çözelti A 400 mcL hazırlayın.
    2. 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın.
  2. Hızlı söndürme akış aracının operasyon
    1. rap açınid-söndürme akış enstrüman; Ana menü görünene sonra, cihaz klavyesinde tip 7 ana konumuna şırınga sürücüsü taşımak için.
    2. "LOAD" Açık tampon şırınga pozisyon.
  3. Yükleme tampon şırıngalar
    1. Sürücü şırınga noktasına 10 ml şırınga içeren tampon takın. "LOAD" şırınga topuzu konumunu değiştirin.
    2. 10 ml şırınga kullanılarak, 10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA ile gösterge tampon hazne A ve B dolum ve söndürme çözeltisi (250 mM EDTA ve% 0.2 SDS) şırınga C doldurun. ve dışarı pistonları iterek hava kabarcıklarını çıkarın.
    3. "YANGIN" değiştirin topuzu pozisyonları. Tip 2 şırınga sürücü çubuğunun konumunu ayarlamak için. Basın tampon çıkış döngü çıkana kadar şırınga düşürmek için düğmeye "AŞAĞI AYARLA": (sürekli aşağı 7-gider; 8-büyük bir adım aşağı, 9-küçük bir adım aşağı). Ana menüye dönmek için "ESC" yazın.
  4. yıkama boru
    1. Avvakum ach çıkış hattı. Örnek topuzlar için "FLUSH" olarak değiştirin. yatay konuma düğmeleri ayarlayarak yakın tampon şırınga. Vakum açın ve 10 saniye süreyle H 2 O 2 floş döngüler daldırma, daha sonra 10 saniye boyunca MeOH batırın. ~ 15 sn için hava emerek kuru döngüler, veya kuru kadar.
  5. yükleme örnekleri
    1. "LOAD" Change örnek topuzu pozisyonu. 1 ml şırınganın içine çözüm A yerleştirin. Numune yük limanlarından birine şırınga takın. Çözelti B için tekrarlayın ve ters örnek yük limanında yerleştirin.
  6. Zaman noktalarında toplanması
    1. Ana menüde, söndürme akış çalıştırmak için 1 yazın. Reaksiyon zamanı (ler) ve Enter tuşuna basın, "ENTER". Reaksiyon döngü numarası gösterilir kullanmak için. Gerekli reaksiyon döngü geçin. Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi.
    2. Örnek topuzlar için "LOAD" çevirin. Yük reaksiyonu sadece merkezi karıştırma bölmesinin dışına kadar örnek döngüler içinde karışır. tüm düğmelerini açmak için "FIRE ". Bütün kolları doğru konumda olduğundan emin olun.
    3. çıkış döngü ucuna 1.5 mL tüp yerleştirin. Basın reaksiyonu çalıştırmak için "GO". Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi. Onlar sürücü vurmak kadar tampon şırıngalar A ve B güncelle.
    4. İstenen her zaman noktası için adımları yineleyin 2.2.6.2-2.2.6.3. İstisna: Başlangıç reaktifi sıfır zaman noktası kontrolünü söndürülmesi (yani, bu durumda MgCl2) içeren solüsyon yüklemeyin.
    5. örneklerin toplanması bittiğinde, ana menüye dönmek için "ESC" girin. Basın "7" başlangıç ​​konumuna tampon şırınga sürücüsünü dönün.
  7. Enstrüman temizlik
    1. Reaksiyon karışımı şırınga çıkarın. örnek yükleme düğmesini "LOAD" pozisyon çevirin. Vakum altında 10 ml 0.3 NH3 PO 4 ve 10 mL MeOH ve ardından 10 ml 0.2 N NaOH ile her bir örnek döngü yıkayın.
    2. için "LOAD" pozisyon şırınga topuzlarını çevirin. 3 Syr bastırıninge pistonları reaksiyon ve soğutma tamponlar almak için. Yıkama en az iki kez 5 ml H2O ile şırınga.
    3. 5 ml H2O ile tekrar şırınga doldurun ve "YANGIN" pozisyon topuzlarını çevirin. Topuzu pozisyon değiştirmek ve adım 2.2.4 deki gibi yıkayın H 2 O. çıkarmak için vakum açın. Cihazı kapatın.
      Not: adımda 1,7-1,12 tarif edildiği gibi ürünler analiz edildi. Buna ek olarak, T7 DNA polimerazı ve kopyalama proteinleri primer sentezi veya uzantı üzerindeki etkisini analiz etmek için, reaksiyon karışımına ilave edilebilir.

3. Tek-ciro Primer Sentez Reaksiyonu

NOT: Tek ciro primer sentezi / uzatma deneyleri birkaç büyük farklılıklar, çoklu-ciro reaksiyonlar benzer yürütülmektedir: Bu analizler substratların ancak konsantrasyon, astar veya uzatma ürünleri içine radyoaktif işaretli ATP dönüşüm izleyin ve proteinler considera vardırbly kadar yüksek olur. Buna ek olarak, primer sentezi reaksiyon analizine izin milisaniyelik çözünürlük elde etmek amacıyla, tek bir hızlı-soğutma akış makinesi kullanmak gerekir.

  1. Reaksiyon karışımlarının hazırlanması.
    1. 1x tamponu, 3 uM GP4 heksamer 6 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP, 1 mM CTP ve 2 nM [P32 γ-] ATP ihtiva eden çözelti, 400 uL hazırlayın. 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın.
  2. Hızlı-soğutma akış işlemi
    1. Adım 2.2 'de açıklandığı gibi reaksiyonlar yürütmek. Eğer arzu edilirse, sırasıyla 15 uM ve 20 uM arasında bir konsantrasyonda T7 DNA polimeraz ya da T7 tek kollu DNA bağlanma proteini ekleyin. Bu durumda, uzantı ürünleri reaksiyonun elle örnekleme izin veren bir zaman rejimi birikirler.

4. Veri Analizi

  1. doğrusal olmayan, en hafif sığdır ürün ilerleme eğrilerien küçük kareler yetenekli uyan ve / veya sayısal entegrasyon ticari olarak mevcut yazılım kullanarak kareler modelleri. operasyonun ayrıntıları kullanılan yazılım ile değişir, ancak aşağıda verileri montaj için kullanılan denklemlerin genelleştirilmiş biçimleridir olacaktır.
  2. lineer bir denklem haline eğrileri ilerlemeye uyan birden fazla devir primer sentezi reaksiyonlarının ürün oluşumunun hızını belirler. Önemli bir kavis ise, tek bir üstel fonksiyon verileri uydurularak başlangıç oranı yöntemi 13, 14 kullanımı: burada: Y (e - k t) = y ürün konsantrasyonu, bir tepkime genlik, k mi gözlenen hız sabiti, t saniye cinsinden zamanı. zaman = 0 teğet çizginin eğimi başlangıçtaki oranıdır.
    NOT: Bir doğrusal denklem ya da önceden kararlı durum patlama denklemine Fit öncesi kararlı durum primer sentezi reaksiyonları y A (e = - k metTepkime genliği ilk t) + oran ss t, k patlama öncesi kararlı durum patlaması için gözlenen oran sabiti, oran ss kararlı durum oranı ss = k cat [Enzim]) 'dir, t zamanı , saniyeler içinde. (- K t e) Tek ciro primer sentezi reaksiyonları tek üstel fonksiyon y = A eğrileri ilerleme takın. GP4 durumunda, ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak, her bir ara enzim ile denge içinde olan, üç NTP kondansasyon adımda, bir model için, sayısal entegrasyonu 15 verileri uygun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El ile birden fazla devir koşulları altında GP4 tarafından katalize edilen bir primer sentezi reaksiyonu örnekleme ile, örneğin, bir protokol aşama 1 'de tarif edildiği gibi, şekil 1A'da gösterilen sonuçlar elde edilmiştir. Burada, jel elektroforezinden sonra bir ürün yelpazesi primer sentezi reaksiyonlarının (Şekil 1A) α-konumunda 32 P ile etiketlenmiş CTP kullanılarak gözlemlenebilir. işaretli ön madde, CTP yüksek hareketlilik gösteren ve GP4 sentezlenebilir daha yavaş göç eden di-, tri- tekabül eden türler ve tetraribonucleotides ardından jel alt doğru göç eder. Inkübasyon süresi ve şablon bir dizi bağlamında bağlı olarak, daha yüksek oligomerlerin (pentaribonucleotides vs.) karşılık gelen ek etiketlenmiş ürünler gözlenebilir. Bir reaksiyon ilerleme eğrisi önce bu, tetra (tam uzunluklu primerler konsantrasyonunun belirlenmesiyle çizilirve pentaribonucleotides) her bir zaman noktasında ve zamanın bir fonksiyonu olarak sentezlenen primerlerindir konsantrasyon çizilerek.

Kararlı durumda veri elde ederken, çoklu-ciro deneyleri verileri büyük ölçüde alt tabaka tarafından tanımlandığı gibi verilerin bilgi içeriği, yani., Bu olaylar genellikle belirlemek büyük ölçüde hakim veya bağlayıcı ve ürün serbest bırakma olayları, biraz sınırlı, nispeten kolaydır K M ve k cat 16 değer verir. kararlı durum kurulmadan önce Reaksiyon kadar kısa zaman noktalarında gözlenirse (diğer bir deyişle, ön-kararlı durum) çok daha büyük bir bilgi içeriği kinetik deney türetilebilir. Önceden kararlı halde reaksiyonların incelenmesi bilgi hazinesi sağlayabilir. Ürün oluşumu, bir "ön-kararlı durum patlaması" görülmektedir, örneğin, ürünün salım hız sınırlayıcı bir adımdır iyi bir göstergesidir Ireaksiyonu n adet. Ayrıca, bir reaksiyon öncesi kararlı durum aşamasından ürün oluşum hızı (veya kimya adım) elde edebilirsiniz. Ürün oluşumu bir kayma görülmez Buna zıt olarak, daha sonra sabit durum oranı kimyasal aşamada ya da önce bir adım ve ürün salma karşılaştırıldığında hızlı olduğu da sınırlı kanıtıdır.

Hızlı-söndürme aleti aşağı birkaç milisaniye (protokol aşama 2) saniyelik bir aralık zaman ölçeklerinde GP4 tarafından katalize edilen tepkime incelemek için kullanıldığı zaman, astar birikimi lineer olmadığı açıktır, ama iki fazlı görüntüler (Şekil 1B, düz çizgi) profil. Bu ürün oluşumu hızlıdır ve salım hızı sınırlayıcı sürekli halde olduğuna işaret etmektedir ürün birimi bir ön denge durumu burst için kanıt gösteren bir teşhis sonucudur. Diğer enzim sistemleri bu göstermeyebilirdavranış. Örneğin, bir varsayımsal, gelişme eğrisi GP4 ile primer oluşumu önceden kararlı durum kaymasının (Şekil 1B, kesikli çizgi) ile devam etmedi sonuçlanacak sunulmuştur. Bu gibi durumlarda, yorumlanması, ürünün oluşumu olacaktır veya önceki bir aşamada, oran-sınırlayıcı bir adımdır.

Önceden sabit durum kinetik bir başka düzenlemesi, etiketli substrat, düşük konsantrasyon (GP4 durumunda, hem DNA ve CTP gibi) enzim miktarları doyurarak bağlı tek devir deneydir. Bu deney türü ürün alt-tabakasının dönüşüm işlemleri sırasında ve ara türlerin çürüme ile ilgili bilgi sağlamak için özel olarak düzenlenmiştir. GP4-katalize edilmiş reaksiyon (protokol aşama 3) 'de, primer oluşumu üç nükleotidil transfer reaksiyonlarının sonucudur. Son zamanlarda, biz bilgiyi ortaya çıkarmak için tek ciro primer sentezi reaksiyonları kullanılanribonükleotid ara GP4 ile dengede olan üç nükleotidil transferi basamaklarının sıralı bir modeli, di-, tri-, ve tetraribonucleotide ürünlerin zamana bağlı birikimini ve kaybolması oturtulması ile astar ara-8 (Şekil 1C) sağlar.

Şekil 1
Şekil 1: T7 primaz-helikaz tarafından astar sentezinin kinetik analizi. (A) Tek PRS ile ssDNA üzerinde GP4 tarafından astar oluşumu Zaman elbette. Numuneler önce, MgCI2 (zaman = 0) eklenmesinden çıkarıldı ve ilave edildikten sonra aralıklarla örneklendi. Ürünleri jel resmin solunda gösterilmiştir. (B) Katı satır: GP4 tarafından Primer oluşumu öncesi kararlı durum patlama sergiler. Değerler, en az üç bağımsız deneyin ortalamasıdır. noktalı line: bir reaksiyon ilerleme eğrisinin Temsil GP4 katalizli reaksiyon öncesi kararlı durum patlama olmadan devam eğer. 8 modifiye. (C) GP4 tarafından Tek ciro primer sentezi. Sol: tetramer oluşumunun zaman elbette. Sağ: Zamana karşı ara oluşumu arsa. Değerler, en az üç bağımsız deneyin ortalamasıdır. Veriler sayısal entegrasyonu ile uyum edildi; düz çizgiler uyum göstermektedir. 8 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu deneyler en önemli faktör son derece aktif saflaştırılmış enzim mevcudiyetidir. GP4 ile çalışma sırasında, örneğin, -20 ° C'de% 50 gliserol ihtiva eden tampon maddesi içinde saflaştırılmış enzim depolama (20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde bulunan bir azalmaya yol açar birkaç ay boyunca preparatın spesifik aktivitesi. Bu nedenle, şu anda, saflaştırılmış 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP içinde GP4 ve% 10 gliserol flaş dondurma, küçük numuneleri, sıvı azot kullanılarak ve -80 ° C'de saklayın. Özellikle ilk birkaç numune alımı sırasında, hızlı soğutma akış aleti kullanırken, reaktanlar reaksiyondan önce başlangıç ​​tepkime sıcaklığı (oda sıcaklığı) ulaşmak için izin önemlidir. Ayrıca, büyük bir dikkatle kalan söndürme reaktif olarak, iyice her zaman noktasından sonra boru (protokol aşaması 2.2.4) temizlemek için alınmalıdırçizgi ölçüde hatalı sonuçlara yol açan, enzim aktivitesini inhibe olur. Diğer bir önemli husus poliakrilamid jeli ve işleme bileşimi içerir. GP4 tarafından katalize primer sentezi reaksiyonları ürünleri, daha az 20, en azından daha% akrilamid ile jeller iyi gidermek. Aslında,% 15 jellerinde nükleotid alt-tabaka ve reaksiyon ürünleri radyoaktivite belirsiz bölge olarak geçirilir. küçük ribonükleotid ürünleri analiz edilecek, bu nedenle, buna göre akrilamid yüzdesini ayarlamak için son derece tavsiye edilir. akrilamid yüksek oranda kağıdın iyi yapışmaması yani içeren jeller kullanılarak önemli bir dezavantajı; Bu nedenle büyük özen kurutma kağıdı kromatografiye aktarmak için kullanılmalıdır. Son olarak, akrilamid yüksek oranda içeren jeller vakum destekli jel kurutma çatlak eğilimindedir. Bu 65 ° C kurutma sıcaklığına düşürülmesi jellerin az çatlamasına neden olduğunu bulmak. Seçenek olarak ise, jeller fosforlu maruz edilebilirkurutmadan Görüntüleyici ekranları.

Orada, bu protokol kullanılarak test edilebilir reaksiyon koşulları ve reaktifler varyasyonların büyük sayıda, ve olası küçük ilavesinin etkisini inceleyen, mutan enzim enzimatik davranışı test kadar, GP4 bizim çalışmalarda devam olan bu tür nükleotid analoglan, hem de alternatif DNA şablonları, ya da metal iyonu kofaktörler gibi molekül inhibitörleri ya da aktivatörler ya da alternatif substratlar. Yukarıda tarif edilen protokol, reaksiyon sıcaklığı oda sıcaklığına kullanır. Başka bir reaksiyon sıcaklığı isteniyorsa, çok hızlı söndürme cihazları, bir ısı kontrollü su banyosuna aleti bağlanmasını sağlayan bir valf içerir. elektroforetik ürün ayrıştırma reaksiyon tamponu yüksek bir konsantrasyon (> 200 mm) tuzu içeren, özellikle tatmin edici olduğu durumlarda, alkali fosfataz 1-10 birimleri ile Sertleştirme sonrası numune tedavi ve 3 inkübe önerilirEn az 30 dakika boyunca 7 ° C. Bu NTP'lere ve ribonükleotid ürünleri terminal trifosfatlar kaldırmak ve onların elektroforetik ayırma artıracaktır. nükleotid α pozisyonunda işaretlenmiş Ancak, bu yalnızca pratiktir.

hızlı-söndürme aygıtının kullanımı, yüksek verimli analizi için uygun değildir. Deneyimli bir kullanıcı hızlı söndürme akış protokolü yaklaşık 18 zaman puan toplayarak, numune hazırlama başlayarak ve yaklaşık iki saat araç temizlik, burada açıklanan işlemleri gerçekleştirebilirsiniz. Ek bir zaman kısıtlaması jel elektroforezi, jel maruz kalma ve veri analizi için gereken zamandır. Diğer bir kısıtlama, tipik bir deney reaksiyon hacminin 500 ila 1000 uL gerektirir ve yeterli bir enzim elde etmek etkili bir şekilde ifade olmayan proteinleri durumunda zor olmasıdır.

prima yüksek verimlilik elenmesini sağlamak deneyleri geliştirme konusunda büyük bir ilgi vardırse aktivite, özellikle de 18 yeni antibakteriyel terapötiklerin 17 geliştirmektir. Primaz aktivitesi için radyoaktif olmayan, sürekli deneyler geliştirme ilerlemelere rağmen, bu deneyler, iki büyük sınırlamalar gerekli değildir ve dolayısıyla, yani hızlı bir kinetik araştırmalar kullanımlarını engellemez yeterli zaman çözünürlüğü ve ürün hassasiyet eksikliği. Bu nedenle, burada açıklanan radyoaktif, süreksiz tahlil genel GP4 tarafından primaz faaliyeti kinetik incelemede altın standart ve DNA primases şu anda. Burada tarif edilen protokol daha gelişmiş düzenlemeleri alt tabakalar kinetik ayırımını saptamak amacıyla darbe kovalayıcı deneyler, örneğin, bir hızlı soğutma akış aleti kullanılarak bir enzim katalizli reaksiyon kinetik yolunun belirlenmesinde kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris pre-set crystals
pH 7.5
SIGMA T4128
Tris base SIGMA 93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate SIGMA G1501 
Magnesium chloride hexahydrate Mallinckrodt Chemicals 5958-04
1,4-Dithiothreitol J.T. Baker F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate MP Biomedicals 811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate Mallinckrodt Chemicals 4931-04
[α-32P] CTP PerkinElmer BLU508H radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP PerkinElmer BLU502A radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP  Affymetrix 77100 four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP Epicentre RN02825 part of NTP set
ssDNA constructs Integrated DNA Technologies N/A custom sequences 
methanol  Macron Fine Chemicals 3017-08
formamide Thermo Scientific 17899
bromophenol blue SIGMA B8026 
cylene xyanol  SIGMA X4126 
acrylamide SIGMA A9099 Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide SIGMA M7279  Toxic
Urea Boston Bioproducts P-940
Boric acid Mallinckrodt Chemicals 2549
Rapid Quench-Flow Instrument  Kintek Corp. RQF-3 
Kintek Explorer Kintek Corp. N/A
Kaleidagraph  Synergy Software N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25, (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11, (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272, (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38, (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267, (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276, (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412, (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587, (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41, (4), e56 (2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, (4), 327-339 (2012).
Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Hernandez, A. J., Richardson, C. C. Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Vis. Exp. (120), e55312, doi:10.3791/55312 (2017).More

Hernandez, A. J., Richardson, C. C. Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Vis. Exp. (120), e55312, doi:10.3791/55312 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter