Summary
Este protocolo describe una metodología detallada para detectar la localización de2 H2O en Solea senegalensis espermatozoides con un fluorocromo sensible DCFH-DA para ROS, una mancha de mitocondrias vivo para las mitocondrias y DAPI para núcleos visualización, respectivamente. El protocolo está diseñado para ser realizado dentro de 2 h con espermatozoides frescos o descongelados.
Abstract
El estrés oxidativo es uno de los factores importantes en la disminución de la calidad del esperma. El desarrollo de protocolos eficientes para la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) en espermatozoides es de gran importancia en cualquier especie, pero estos métodos son raramente usados y aún menos en teleósteos. La criopreservación es una técnica útil en acuicultura para diversos propósitos, incluyendo banca de gene y garantizada la disponibilidad de espermatozoides durante todo el año. Procedimientos de congelación/descongelación puede causar producción de ROS y dañar las células de esperma. Teniendo en cuenta los posibles dañan podría causar un exceso de producción de ROS en espermatozoides dependiendo de su localización, aquí una metodología detallada para detectar H2O2 y evaluar su localización intracelular mediante microscopía confocal se proporciona. Para ello, se utiliza una combinación de 3 fluorocromos (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una mancha en mitocondrias y 4′, diclorhidrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) para evaluar la co-localización de H2O2 con núcleos de espermatozoides o mitocondrias en Solea senegalesis muestras de esperma.
Introduction
La producción de especies reactivas de oxígeno se ha relacionado con la calidad del esperma recientemente1. Aunque la producción de ROS en la mitocondria puede ser considerada un proceso fisiológico normal, estrés oxidativo por exceso de producción de ROS es una causa clara de daño en los espermatozoides en los diferentes niveles. En los seres humanos, el estrés oxidativo se asocia a infertilidad, alteración de la motilidad y la capacidad de someterse a capacitación2; en los mamíferos, el cambio de la integridad del ADN en las muestras de esperma congelado se ha relacionado también a la síntesis de H2O23.
La criopreservación es una técnica común para la banca en acuicultura, gen. Esta tecnología es particularmente importante en las especies con problemas reproductivos como Solea senegalensis. Esta especie valiosa en el mercado muestra disfunción reproductiva en individuos nacidos en cautividad debido a la falta de cortejo. Este hecho hace que la criopreservación de espermatozoides necesario contar con la disponibilidad de espermatozoides para la fertilización artificial. Sin embargo, la criopreservación podría ser una fuente de estrés oxidativo que podría ser perjudicial para los espermatozoides4 como estudios han reportado un efecto beneficioso de la suplementación con antioxidantes. Inhibición de ROS a través de antioxidantes mitocondriales dirigido fue supuestamente beneficiosa para la criopreservación de espermatozoides en el bagre amarillo5.
Por lo tanto, los niveles de ROS en las muestras de semen son importantes conocer, particularmente después de la criopreservación6,7 ya que estas moléculas han sido reconocidas como una desventaja para la supervivencia de la esperma y fertilidad8. Por otra parte, estudiar la distribución de ROS dentro de la célula podría ser crucial para inferir el nivel de daño potencial. Por ejemplo, bajos niveles de ROS en la mitocondria podrían suponerse normal y compatible con la función del esperma, pero altos niveles de ROS en el núcleo podrían ser indicadores de daño del ADN de espermatozoides. H2O2 es uno de los ROS más relevantes que podrían ser liberados de la mitocondria y penetrar en el núcleo porque es una molécula pequeña y sin carga9. Diacetato de Diclorofluoresceína (DCFH-DA) puede revelar específicamente peróxido intracelular emite fluorescencia verde. En este artículo, se presenta un protocolo detallado para detectar la localización intracelular de H2O2 en Solea senegalensis esperma usando microscopia confocal.
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Protocol
Nota: Incubación de fluorocromo y análisis confocal tendrá al menos 2-3 h para un control y una muestra tratada. Procesamiento de datos no está incluido en este cálculo de tiempo. Materiales pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Este protocolo se puede aplicar a los espermatozoides frescos o criopreservados. Solea senegalensis es una especie de pez que desova en aguas frías, trabajo siempre bajo condiciones de frío (4-7 ° C). Vea la figura 1 para una visión general del protocolo.
1. preparativos antes del experimento
- Prepare solución de grado analítico DMSO con un 1 mM las mitocondrias de la mancha.
- Preparar un 4′ de 1 μg/mL, solución en agua desionizada diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Preparar una solución de Ringer mOsm/kg 200 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)
- Preparar un 2 ' 4 mM, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) solución en metanol grado analítico.
Nota: Mantenga las soluciones stock en alícuotas a-20 ° C hasta que se necesite. - Establecer la microcentrífuga a 4-7 ° C.
2. preparación antes de la incubación del fluorocromo
Nota: Manejo cuidadoso de los espermatozoides es deseable cuando pipeteo y resuspender.
- Si trabaja con células cryopreserved, prepare un baño de agua para descongelar a 40 º C para Solea senegalensis espermatozoides10. Sumergir las muestras de paja en el baño de agua durante 7 s.
- Con unas tijeras para cortar, vaciar la muestra en un tubo de microcentrífuga y centrifugar a 1000 x g, 4-7 ° C por 1 min.
- Eliminar el plasma seminal o plasma seminal con crioprotectores de la muestra criopreservada mediante pipeteo para descartar cualquier componente que pudiera interferir con el protocolo de tinción.
- Resuspender las células en 50-100 μL de 4 º C 200 mOsm/kg solución de Ringer.
- Determinar la concentración de esperma con una Neubauer o una cámara de conteo similar bajo un microscopio estereoscópico.
- Diluir la suspensión de células para arriba con 1-2 x 106 células/mL en un volumen final de 0.5 mL en 4 ° C solución de Ringer.
3. fluorocromo incubación
Nota: Fluorocromos deben manipularse en condiciones de poca luz, especialmente cuando están en solución.
- Añadir 3,125 μL de solución stock DCFH-DA (concentración final en la muestra: 25 μM) para la dilución de la muestra de trabajo. Incubar a 4-7 ° C por 40 min en oscuridad10.
- Después de 30 min, Añadir 0,5 μL de la solución madre de DAPI (concentración final en la muestra: 2 μM) y 0,5 μL de la mitocondria mancha solución (concentración final en la muestra: 100 nM) a la muestra. Incubar ambos fluorocromos para 10 min en la oscuridad.
4. preparación para Microscopía Confocal
- Después del tiempo de incubación, Centrifugue la suspensión de células a 1000 x g, 4-7 ° C durante 1 minuto.
- Descartar el sobrenadante cuidadosamente mediante pipeteo.
- Añadir un 10-20 μL de 200 mOsm/kg de solución Ringer.
- Lugar 5 μL de una suspensión concentrada de células de la gota en un portaobjetos.
- Con cuidado, poner una diapositiva de cubierta sobre la preparación y selle con esmalte. Una vez seco el esmalte, la preparación está lista para la microscopia confocal.
5. confocal configuración antes del experimento
Nota: Dependiendo del microscopio, DCFH-DA podría ser "quemado". Establecer las mejores condiciones con una muestra no valiosos primero.
- Encender el microscopio, láser, cámara y el equipo con el microscopio.
- Conjunto de láseres de excitación teniendo en cuenta los máximos de excitación y de emisión de cada fluorocromo:
- Para DAPI, utilice un máximo de excitación de 358 nm y un máximo de emisión de 465 nm.
- Para la mancha mitocondrial, use un máximo de excitación de 644 nm y un máximo de emisión de 662 nm.
- Para DCFH-DA, utilice un máximo de excitación de 504 nm y un máximo de emisión de 525 nm.
- Empezar a trabajar con el objetivo de 25 X a centrarse en los espermatozoides. Seleccione el canal DAPI para enfocar porque este fluorocromo informa la intensidad más alta. Una vez que las células se concentran, utilizar un 63 X o 100 X objetivo de una evaluación cuidadosa porque Solea senegalensis espermatozoides tamaño es alrededor de 2 μm.
- Para cada canal, optimizar el poro, la ganancia y la tensión. De la misma manera, ajustar el offset digital para reducir a fondo. Una vez que todos los parámetros están optimizados para el fluorocromo usado, guardar la configuración. Para un experimento rutinario de una sola célula de la esperma de Solea senegalensis se utilizaron los siguientes (estos parámetros pueden cambiar en cada experimento): agujero de alfiler de la 1 y la ganancia de tensión de 750 V.
6. adquisición de imágenes
- Seleccione las condiciones de calidad deseada para la adquisición de la imagen. Definir parámetros de adquisición como profundidad de bits, formato de imagen, grueso de la hoja ligera y escoge la iluminación cara sola. Para un experimento rutinario para un solo espermatozoides Solea senegalensis se utilizaron los siguientes (estos parámetros pueden cambiar en cada experimento): tamaños de 1024 px; bits por píxel de 16; velocidad de escaneo de 2-4).
- Abierto y centro de la zona de exploración para iniciar y tomar una imagen del campo.
- Usando la herramienta Recortar, seleccione la región de interés y pulse vivo.
- Con la ayuda de la herramienta del indicador de rango, ajustar el offset digital para reducir el fondo. Hacer esto para cada canal y la imagen.
- Compruebe la calidad de los canales individuales para cada fluorocromo y sus combinaciones.
7. crear un imagen 3D Video
- Configuración de la adquisición de Z-stack.
- Elija la opción Z-stack en el software.
- Seleccione la celda individual, grupo de células o región de interés y enfocar.
- Delimitar la Z-pila con las opciones 'Primera rodaja' y 'Última rodaja' y establecer el paso de z a intervalo de 0.2 μm con la ayuda del foco fino. Elegir el canal DAPI concentrarse porque este fluorocromo puede reportar la intensidad más alta y se puede seleccionar fácilmente la cabeza entera de espermatozoides. Elija los parámetros de adquisición óptimos para cada canal y ejecutar el experimento.
- Ejecutar el experimento de Z-stack. Dividir los canales y observar la localización de cada señal dentro de las células.
- Proceso Z-stack.
- Volumen de procesamiento: una vez finalizado el experimento, seleccione las opciones del software de procesamiento de Z-stack y elegir el volumen hacer opción. Seleccione el número de pasos y los grados de rotación (360°). Guarde el archivo con una extensión de vídeo.
- Anaglifo estéreo: seleccione estéreo anaglifo en las opciones de ventana de proceso. Esta herramienta permite para crear una imagen 3D video con canales de split.
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Representative Results
La microscopia confocal es un método ideal para evaluación de ROS intracelular en teleósteos de la esperma. La combinación de tres fluorocromos (DAPI, una mancha de mitocondrias y DCFH-DA) presentada en este estudio (figura 1) proporcionan mucha información útil que puede ser aplicado en la investigación básica y puede tener aplicaciones en la mejora de procedimientos utilizados en plantas de acuicultura industrial, tales como protocolos de criopreservación. Diferentes tipos de análisis pueden llevarse a cabo con el fin de correlacionar la presencia intracelular de ROS y otros parámetros: motilidad, viabilidad, diferentes patrones entre buenos y malos criadores, la activación de la motilidad o variaciones estacionales de la esperma entre muchos otros. En el presente trabajo, se muestran dos patrones diferentes de intracelular H2O2 distribución dentro de los espermatozoides: colocado con mitocondria o propagación en el núcleo (figuras 2, 3). Los espermatozoides que muestran baja daño potencial producido por ROS demostraron DCFH-DA etiquetado sólo en la mitocondria, mientras que aquellos que sufren el daño de la DNA demostraron DCFH-DA etiquetado también en los núcleos. La microscopia confocal permite crear vídeos útiles y proporcionar gráficos de colocalización fácil y rápida.
Figura 1 . Visión general del Protocolo de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ejemplo de adquisición de la imagen confocal. Esquema de A. de la muestra B. Canal DAPI (etiquetado dsDNA). C. las mitocondrias tiñen de canal (etiquetado mitocondria). D. De mitocondrias la mancha canal se fusionó con el canal DAPI. E. canal de DCFA-DH (etiquetado intracelular H2O2). F. canal de DCFA-DH se fusionó con el canal DAPI. G. combinación de los tres canales. Abreviaturas: n: núcleos, mt: mitocondrias, f: flagelo y mb: membrana. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Diferentes patrones de intracelular H2O2 en Solea senegalensis espermatozoides (renderizado de volumen). Canales resultantes de espermatozoides mostrando ROS intracelular en la fosa nuclear y mitocondria (A, C, E). Canales resultantes de espermatozoides mostrando intracelular H2O2 también dentro de los núcleos (B, D, F). A y B: DAPI. C y D: DCFH-DA. E y F: las mitocondrias de la mancha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es bien sabido que las mitocondrias son orgánulos claves para la motilidad del esperma y la función. Estos orgánulos están implicados simultáneamente directamente en la producción de ROS. Curiosamente, controlados los niveles de ROS son necesarios para el esperma adecuado función1. Relaciones positivas entre la fertilidad y el estrés oxidativo se ha demostrado en mamíferos11 pero niveles excesivos afectan esperma calidad12. Un factor crucial que podría ser decisivo hacia un efecto positivo o negativo es no sólo de los niveles ROS, sino también de localización intracelular de ROS. Uno de los efectos nocivos de ROS está produciendo daños de ADN9 y por lo tanto la presencia nuclear de ROS podría ser un indicador de daños en el núcleo mientras que los niveles ROS pueden ser normales en las mitocondrias. Es necesario complementar los métodos cuantitativos (p. ej., citometría de flujo) con técnicas como la microscopía confocal que podría proporcionar información sobre la localización intracelular de ROS.
Microscopía confocal es una opción óptima para visualizar la localización intracelular de ROS. El uso de fluorocromos específicos como una mancha en mitocondrias y DAPI permite la visualización de las mitocondrias y núcleo respectivamente y la combinación de estas moléculas con DCFH-DA la localización intracelular de peróxido.
Los pasos críticos en el protocolo son fluorocromo incubación y configuración confocal. Ambos pasos deben ser optimizados y realizados cuidadosamente para obtener resultados consistentes y reproducibles. Metodología modificaciones deben realizarse en estos dos niveles dependiendo del plasma seminal utilizado. Por lo tanto, incubación de fluorocromo deben adaptarse. Temperaturas y condiciones de almacenamiento significativamente diferencian entre las muestras de esperma, y la mayoría de los protocolos está optimizada para los mamíferos.
Aquí, se describe un protocolo para las muestras de esperma de teleósteos, particularmente para Solea senegalensis espermatozoides, (figura 1). Etiquetado éxito de núcleos y las mitocondrias se han realizado utilizando el protocolo descrito y la presencia ROS ha sido revelar usando DCFH-DA (figura 2). Los resultados indican que la localización de H2O2 se han encontrado en los núcleos o las mitocondrias según la muestra de semen (figura 3). Como se explica anteriormente, las muestras con un alto porcentaje de espermatozoides con altos niveles de ROS dentro del núcleo sería propensas a daños en el ADN. Este protocolo tiene una única limitación, el requisito de costosos aparatos (microscopio confocal), pero podría tener futuro utilidad en la selección de las muestras de esperma con baja presencia de ROS dentro del núcleo para los propósitos de la criopreservación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Este trabajo fue apoyado por el proyecto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce fue financiado por la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) y el Fondo Social Europeo. Los autores reconocen Dr. Ana Riaza y Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero y José Ramón Guiérrez. También agradecemos a Paula Fernández Colado por videografía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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