Summary
ゼブラフィッシュ網膜再生は、主に固定した網膜を用いて研究されています。しかしながら、このようなinterkinetic核移行などの動的プロセスは、再生反応時に発生し、根底にあるメカニズムを調べるために生細胞イメージングを必要とします。ここでは、多光子顕微鏡を用いてリアルタイムにInterkinetic原子力移行（INM）を監視するために文化や撮影条件を説明します。
Abstract
内因性の再生プログラムは、神経損傷と死を、次の網膜大人のゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ ）にミュラーグリアによって開始されます。ミュラーグリア細胞周期を再入力して、細胞分裂のその後のラウンドを受け、失われた神経細胞型に分化神経前駆細胞を産生します。両方のミュラーグリアと神経前駆細胞核は、それらのDNAを複製し、Interkineticとして記載された方法で、網膜、 すなわち、それらは、それぞれ、基礎内顆粒層（INL）及び（ONL）外顆粒層との間の移行の別個の位置で有糸分裂を受けます核移行（INM）。 INMは、主に発展途上の網膜に研究されてきました。詳細にゼブラフィッシュ網膜の再生成人にINMのダイナミクスを調べるために、蛍光標識されたミュラーグリア/神経前駆細胞の生細胞イメージングが必要です。ここでは、単離するための条件や文化の背側網膜を提供しますTgはから[GFAP：nGFP] 35時間一定の強い光にさらされたmi2004のゼブラフィッシュ。我々はまた、これらの網膜培養物を連続的にGFAPの遊走挙動を監視するために多光子顕微鏡を用いて、最大8時間の網膜外植片の厚さ全体にわたってzスタック画像を取得し、生細胞イメージング実験を行うために実行可能であることを示している。nGFP陽性細胞。また、我々は、頂端および基底INMの速度を決定するために、ポスト画像解析を実行するための詳細を説明します。要約すると、我々は、神経再生の成人モデルにINMのダイナミクスを研究するための条件を確立しました。これは、この重要な細胞プロセスの我々の理解を進め、私たちはINMを制御するメカニズムを決定することができます。
Introduction
ヒトとは異なり、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、網膜神経細胞1、2、3、4の細胞死の際に強固な再生応答を示します。腫瘍壊死因子α、網膜神経細胞が死ぬから放出されるシグナル伝達分子が網膜の基底内顆粒層（INL）に存在するミュラーグリア細胞を誘導し、5を増殖し、神経細胞に分化する前に増殖し続ける神経前駆細胞を産生します2死亡したタイプ、3、4。再生応答の増殖期の間に、ミュラーグリアの核とその派生神経前駆細胞は、細胞周期（Interkinetic原子力移行、INM）6と同位相の繰り返しの移動パターンを受けます >、7。基礎INL内に配置核が生じる核がINLに基底に戻る前に、彼らは分裂外顆粒層（ONL）に移行する前にそれらのDNAを複製します。生細胞イメージング手法後ザウアー8、9、10、11、12により解釈を確認しながら、このプロセスは、最初に、組織学的方法を用いて、神経上皮開発中に記載されました。両方の組織化学的および生細胞イメージングアプローチはINMと網膜9、11、12、13を含むneuroepithelia開発におけるその機能の根底にあるメカニズムを決定するために使用されています。しかし、網膜を再生する大人にINMを支配するメカニズムはあまり詳細に研究されていません外部参照"> 6、7。ライブセルイメージングは、網膜を再生する大人にINMを制御するシグナル伝達経路の知識を進めるために貴重なアプローチとなります。
最近まで、網膜のINMの生細胞イメージングライブゼブラフィッシュ胚のいずれかに、またはニワトリ胚または出生後のマウスの網膜外植片9、10、11、12、14、15、16に限定されていました。マウス、ラット、およびゼブラフィッシュを含む様々な種の成体動物からの網膜外植片は、異なる細胞生物学的手法17、18、19、20、網膜外植片を、HAを用いて、生細胞イメージング実験のために利用されてきたがVEのは時間の期間を短時間に制限され、数時間21、22にわたって連続的に実行されていません。ここでは、多光子顕微鏡6を用いて、生細胞イメージング実験の監視INMを実行するために培養光損傷を受けた大人のゼブラフィッシュ網膜に詳細なプロトコルを記述します。 INMのダイナミクスとして、 例えば、速度はむしろ、潜在的に免疫細胞化学を用いて検出されない有糸分裂の場所、より影響を受ける可能性がある、INMを制御するメカニズムを調査する際ライブセルイメージングアプローチは免疫組織化学的方法よりも有利です。
将来的には、この方法はまた、ミュラーグリアまたはミクログリアの行動によって、このような瀕死の光受容体の食作用などの網膜再生中に他の動的プロセスを研究するように変更される可能性があります。
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Protocol
注：ゼブラフィッシュが発生し、フライマンライフサイエンスセンターのノートルダムゼブラフィッシュ施設で維持しました。この原稿に記載されている方法は、ノートルダム動物実験委員会の大学によって承認され、ビジョンと眼科での研究のための協会ビジョン研究における動物の使用に関する声明に準拠しているされています。
1.ソリューション
- 組織培養フードに移し、組織培養フードおよび任意の機器/試薬を滅菌するために70％エタノールを準備します。
- （：500 2-フェノキシエタノール1）システム1Lの水に2-フェノキシエタノールの2 mLを加え。
- 0.1 mMの炭酸水素ナトリウム、pHが8.0を準備します。滅菌組織培養フード内の溶液を滅菌するために10 mLシリンジおよび0.2μmの細孔サイズのシリンジフィルターを使用してください。
注：NaHCO 3を効率的にfluorodishesのカバーガラスの表面を横切る細胞および組織接着剤を拡散するために使用されている（参照ステップ3.2）。 - 1.0 MのCaCl 2および1.0 MのMgCl 2を準備します。 10 mLシリンジ、滅菌組織培養フードで0.2μmの細孔サイズのシリンジフィルターで滅菌します。
- Hank'sバランスのとれた塩溶液（HBSS）を調製するために、1 mMの各の最終濃度で、フェノールレッドを含まない、2+ / MgのCa 2+をすることなく、1×HBSSに無菌のCaCl 2および滅菌のMgCl 2を追加します。無菌環境で動作します。
- 50％フェノールレッドなしの1×最小必須培地（MEM）、25％のCaCl 2およびMgCl 2を含有する HBSSは（セクション1.4を参照）、25％ウマ血清（HS）、10単位/ mLペニシリン、および10を混ぜ、培養液を調製するために、 / mlのストレプトマイシン。無菌環境で動作します。
注：これにより、信号対雑音比に影響を与え、それはautofluorescesとしてフェノールレッドを含む培地を避けてください。 23 - フェノールレッドを含まない1×MEM中の1％低融点アガロースの10ミリリットルを準備します。マイクロWを用いてアガロース/ 1×MEMを溶かしますAVE。流体蒸発によるイオン濃度を変更します繰り返し再加熱としてアガロース（ 例えば、10 mL）での小さなボリュームを準備します。
- 培養に先立ち、オートクレーブで1.5 mLのマイクロ遠心チューブを滅菌します。
2.ライト損傷パラダイム
- 暗順応
- 14日間光を欠く環境中に年齢の14ヶ月- 6でmi2004のゼブラフィッシュ（または関心のある他のトランスジェニックゼブラフィッシュ）：3のTg [nGFP GFAP] - 2を配置します。さらに詳細については、参照2、6、24、25を参照してください。
- 2800ルクス2、6、24、25の光を発する2の蛍光ランプ間のシステム水中の3暗順応トランスジェニックゼブラフィッシュ- 2を収容するタンクを配置します。 35時間、一定の強い光にゼブラフィッシュを公開します。 33℃ - 露光時に、水温が31との間に維持されることを保証します。
培養のため3.準備（網膜分離の日に）
- 70％エタノールを用いて、組織培養フード及び組織培養フード中に移すコンポーネント/ツール滅菌（ 例えば、MEMおよびHBSSを含有するフラスコを、ピペット、滅菌ピペットチップ、 等 。）。
- fluorodishesの調製
- 細胞および組織接着剤で各網膜のためのコート1 fluorodish（ 材料の表を参照してください）。
- 、70μgの/ mLの最終濃度0.1 mMの炭酸水素ナトリウムで細胞や組織接着剤を希釈し、各fluorodishに50μLを追加し、200μLのピペットチップでfluorodishのセンター全体のソリューションを広げる（約1〜1.2センチメートル直径）。
- 室温で3時間 - 1のためにコーティングされたfluorodishesをインキュベート;（あるいは、4℃でO / Nインキュベート）。
- 溶液を除去し、それぞれの洗浄のための1×MEMの500μLで3回すすいでください。網膜の外植片がマウントされるまで乾燥からコーティングされたfluorodishesを回避するために、MEMでそれらを維持します。
- ステップ1.6で説明したように、培養培地を準備します。培地は4℃で1週間まで保存することができます。
網膜外植片の4単離および培養
注：以下に概説するプロトコルは、主に説明し、光損傷のパラダイムによって病変れる網膜領域である背側網膜の単離のためです。したがって、損傷誘導性増殖およびinterkinetic核移行の関連イベントは、背側網膜に発生します。しかし、単離手順は、研究/調査質問の特定の要件に応じて、網膜の領域を生じるように調節することができます。
- 1つの光損傷を受けたトランスジェニックゼブラフィッシュaを安楽死させます500 2-フェノキシエタノール：1で時間ta。
- 流体遺跡の薄膜のみように千μLピペットで1 fluorodishからMEMを削除します。
- 乾いたペーパータオルの上にゼブラフィッシュを転送し、デュモン鉗子の湾曲した一対の目を削除する（鉗子＃5、45°の角度）とfluorodishにそれを転送します。
- 視神経と目の奥が見えるように実体顕微鏡を用いて、（ 図1D）fluorodishのカバースリップ上に瞳と目を向けます。
- マクファーソン・Vannasはさみのペアで、目の奥に近い切断、視神経を削除します。また、目の外側を裏打ちする結合組織を除去します。
- 篩板を通して1はさみの刃で突き刺しと鼻と目の一時的な両側に沿って切断することにより、眼茎で切開をしながら＃5ピンセットでその鼻と時間的側面との間に目を保持する（ 図1Eを参照してください。 、セグメント化された李ね）。
- ＃5鉗子、組織を引っ張って、背側網膜から腹側を分離するために、網膜および他のペアの背側を保持するための1の2ペアを使用。
注：それは強膜を上向きにしている間にレンズと神経節細胞層は、カバースリップを向くように背側網膜を配向することをお勧めします。 - ＃5鉗子（ 図1H、I）の第二の対と網膜に接続されているレンズを保持しながら、＃5鉗子の一組と背側網膜から強膜を削除します。
- レンズを削除するには、マクファーソン・Vannasはさみを使用して、網膜（ 図1I、J）を損傷することなく、レンズの後ろにカット。時には、レンズは、ステップ4.7で分離します。この場合、＃5鉗子の第二の対でカットエッジで網膜を保持することによって、ピンセットで慎重に強膜を削除します。
- 網膜に損傷を与えることなく、レンズを除去しながら硝子体を除去します。カバースリップが直面している神経節細胞層で網膜を平らfluorodishの（ 図1L、M）。
- 1％低融点アガロースの10μLで網膜を囲むアガロースを固化させます。
- わずかな上昇は組織に深く集中する能力に影響を与える可能性があるように、液体アガロースが網膜を持ち上げていないことを見ます。リフティングが観察される場合には、アガロースを除去するために、ピペットを使用しています。さらに追加しようとする前に、残留アガロースセットをしてみましょう。
- 全体fluorodishをカバーするために、1％低融点アガロースを添加する前に数回繰り返しステップ4.12。アガロースが固化した後、1.5 mLの培地を加えます。
- 網膜が単離手順により被ったストレスから回復できるようにするために約12時間32℃に設定し、5％CO 2 /空気環境における網膜移植片培養を維持します。 （ステップ2.3参照）、光処理されたゼブラフィッシュと同じ温度で網膜を維持するために、32℃に温度を設定します。
5.多光子顕微鏡
材料の表を参照）、40Xアポ長距離水浸対物レンズ（1.15 NA）を装備した多光子顕微鏡、ガルバノスキャナとのために最適化されました4 35ミリメートルペトリ皿のためのインサートを含んで環境室。画像は、非デスキャン検出器（R-NDD）で取得しました。
- 画像化の前に、5％CO 2 /空気の雰囲気を達成するために、環境チャンバを平衡化します。空のペトリ皿が部屋にガスの漏れを回避するために、ホルダーに挿入されていることを確認します。
- 顕微鏡システムの電源をオンにします。
- 環境室が平衡化されると、40Xアポ長距離水浸対物レンズ（NA 1.15）上に屈折率液体を追加します。
注：水と同様の光学特性を有する屈折率液体は、長期の撮像中の水の蒸発を回避するために使用されます。 - 場所インフルエンザ室内への網膜の外植片とorodishes。明視野光を用いて、光路内に試料を配置し、焦点面に背側網膜の中間領域をもたらします。
- GFAPに集中するGFP落射蛍光灯を使用します。nGFP陽性ミュラーグリア核（ 図2A、C）。
注：外植片がフラットマウントまたはアガロース植片の下に蓄積されていない場合、GFAPに集中することが困難になる。nGFP陽性核またはそれらがぼんやりと蛍光を発します。- 同じ網膜外植内の異なる領域に移動すると、フォーカスの問題を克服するかどうかを確認してください。そうでない場合は別の網膜外植片に移動します。
- 画像取得ソフトウェアでは、「A1 MP GUI '、' TiPad '、' A1コンパクトGUI」と「ND取得」ウィンドウを開きます。多光子イメージングのために、「IR NDD 'オプションが "A1コンパクトGUI」で選択されていることを確認してください。
- 「設でグラム'フィールドは、1 番目のダイクロイックミラーのためのIR-DMを選択し、GFP蛍光を取得するために50分の525バンドパスフィルタを選択します。
- 「A1MP GUI」というウィンドウのIRレーザーのスイッチをオンにします。レーザーは準備ができているのは数分かかります。 GFPの蛍光を励起し、「A1 MP GUI」ウィンドウで「自動整列」ボタンをクリックすることで、レーザーを整列させるために910 nmの波長を設定します。
- 部屋や設備のライトが光電子増倍管の露出オーバーを避けるために、「A1 MP GUI」でシャッターを開く前に、オフにするか又は覆われていることを確認してください。ノイズレベルを低減するために、暗くした環境で顕微鏡を収容します。
- 2のズーム、4.8マイクロ秒/ピクセルの時間を住居ピクセルで、300×300ピクセルの視野の画像を取得します。大体「A1MP GUI」の「取得領域」と「A1コンパクトGUI」ウィンドウでゲインを変更することにより、レーザパワーを設定します。
- zスタックの設定
- ND取得]ウィンドウ」内のZ 'サブウィンドウ」にzスタックの最上位焦点面を設定するには、神経節細胞層に焦点を当てています。いくつかのGFAP：nGFP陽性細胞は、典型的には、網膜（ 図2A、D）の基底限界を識別するのに役立ちます神経節細胞層、内に配置されています。
- ぼんやりとラベルされたGFAPが存在することを特徴とするONL（ 図2A、B）、のレベルを通って焦点面を移動：INL（ 図2A、C）における対応へのラウンドと拡大相対的なものでnGFP陽性細胞。
- zスタックの底として、この平面を設定します。全体のONLを撮影されていることを確認した （ 図2A、B）。
- 撮像期間中に再調整を必要とするフォーカルプレーンシフトを経験すると、「ホーム」ポジションとしてそれを割り当てるために「Z」サブウィンドウの中間位置をダブルクリックします。 「定義された対称モード」に変更そして、「相対」をクリックします。
- 0.7〜1ミクロンの間のzステップサイズを設定します。
- Z-強度補正：
- 組織の深い層に撮像する場合による光散乱にピクセル強度の損失を補償するためには、z-強度補正を適用します。
- 補正を設定するには、「Z-強度補正」ウィンドウを開きます。 「zスタックの範囲 'を設定するには、「NDから」を選択します。
- 「Z-強度補正」ウィンドウ（この場合には、神経節細胞層に相当）の一番下の焦点面をクリックして、レーザー強度（ 'A1MP GUI」の「取得領域'）とゲインを設定する（A1コンパクトGUI ）。
- その後、選択された焦点面のための「Z-強度補正」ウィンドウで「デバイスの設定」の下に表示され、設定を確認するために、「Z-強度補正」ウィンドウの「Z値」の横にある矢印をクリックします。
- 中央のAのプロセスを繰り返しND上部面、レーザパワーと利得を増加させます。必要に応じて追加の焦点面を追加することができます。 4 -図2における実験のための具体的なレーザーとゲイン設定については表1を参照してください。
- 「A1 MP GUI」ウィンドウの「取得領域」を設定します。 15より大きい取得領域と光退色と増加したノイズレベルを回避するための撮像開始時の126よりも高い利得を選択することは避けてください。
注：レーザーと光電子増倍管は、光退色を回避しながら、設定顕微鏡のための最適な撮影条件を得るために、顕微鏡システム、テストレーザーおよびゲイン設定間で異なるように。 - 「Z-強度補正」ウィンドウの「相対強度補正]を選択します。
- 「ND買収」ウィンドウの「時系列」サブウィンドウでは、8時間の期間と「遅延なし」に間隔を設定します。その後、トンで「ファイル名を指定して実行のz補正」をクリックしてください「ND取得]ウィンドウボタンで彼は 'zスタック」サブ・ウィンドウは3-Dの時系列を取得します。
- 画像取得の期間を通じて29°C - 27の温度で網膜外植片を維持します。
- 画像取得期間中、必要に応じて、後の画像解析のための画像品質を維持するために電力レベルとゲインを再調整します。 5.11.4 - 調整のための手順5.11.2を実行します。
- フォーカルプレーンシフトした場合、一時停止、または実行を停止し、再びステップ5.11を実行してください。
注：「相対的なz軸補正は「ステップ5.12.7に選ばれたとステップ5.11.4が実行された場合、それは大規模な光退色が発生しない限り、電力およびゲインレベルを再調整する必要はありません。
速度の6.分析
- 画像上に「関心領域」を設定し、時間を抽出します。 「時間測定」ツールを使用して、スプレッドシートに時間値をエクスポートします。
- ディを含む領域をトリミングvidingのGFAP：nGFP陽性核。
- それは、その後分割核は基底INLに関連して、移行距離を測定するための基準点を設定するためにINMを受けない少なくとも一つの核を含むように切り出された領域であることを選択してください。注：基礎INLに残る核を選択するには、それは時系列の3次元再構成を準備するのに役立ちます。
- GFAP場合は別の方法として、：nGFP陽性細胞は、取得期間を通じてONLで観察され、基準点を識別するために、基礎INLとONL核から及ぶ固定長の垂直線を使用しています。
- 「ショースライスビュー」機能を使用して、直交投影を生成します。続いて、「最大値投影 'から'スライス」からモードを変更します。
- 直交最大投影の「XY」ビューをオフにします。遊走/除核は、最高の見えるれる向きに応じて、LSO 'xz'-または' yz'-ビューのいずれかをオフにします。
- マウスの右ボタンで残りの画像をクリックして、このビューから新しいドキュメントを作成 '関数' XZ 'または'とyz'画像シリーズ」を抽出します。必要に応じて、画像を回転させます。
- 「手動測定」機能を使用して、基底INLのままで、INM受けない核の一番下のレベルで、画像の水平線を引く（=基準点を、 図4（a） - E、赤い水平線）。
- （ - E図4Aを参照）基準線と解析ソフトウェア'線測定」ツールを使用して、時系列のための移行核の基底点間の距離を測定します。
- 核膜が故障したら、それは全体の細胞内へのGFPの拡散、次の識別可能である場合、ソーマの基礎位置を測定します。
- 表計算ソフトを使用して、距離にNUをプロットcleusは時間経過した （ 図4F）に対して移動しました。
- 発生（V a）は 、グラフ距離が核膜崩壊までの期間のために旅し、頂端移動速度（ 図4G）を決定すること。
- グラフ内のデータ系列を選択し、マウスを右クリックして、該当する機能は「y = MX + C 'を含む線形回帰曲線を挿入します。関数内の傾き「m 'は速度を表し、V（ 図4G）。
- 繰り返しは、基礎移行速度を決定するための迅速な基礎移行の第一段階のための6.11.1と6.11.2ステップ、V Bは（ 図4H）。
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Representative Results
図1に概略的に概説した手順に従って、網膜の単離は、光損傷を受けた大人のTgから平らに背側網膜の培養を可能にする[GFAP：nGFP] 5％のCOで少なくとも24時間にわたってmi2004ゼブラフィッシュ2 /空気環境。これらのフラットマウントされた網膜外植片を深部組織レベルでの画像の焦点面に使用することができます。例は、ミュラーグリア/光損傷した網膜における有糸分裂の間ONLに位置しているミュラーグリア特異的プロモーターのGFAP（グリア線維性酸性タンパク質）からのGFPで標識された神経前駆細胞核（ 図2A - D、3）。下の桿体にEGFPを表現NT19ゼブラフィッシュの目：さらに、このアプローチは、様々な網膜細胞層の画像にも適用可能であることを確認するには、急性孤立した網膜の外植片が損傷を受けていないのTg [Eco.NfsB-EGFPρ]から調製しました。ロドプシンプロモーター 。 図2Eは- Hは 、GFP陽性の桿体及びそれらの内側セグメントの画像を取得することが可能であることを示しています。ロッドの内側セグメントは、網膜色素上皮に向かって錐体光受容体との間に延在するように、これらのデータは、画像の錐体視細胞にも可能であることを意味するであろう。しかし、これはさらに調査ではありませんでした。
光損傷を受けた網膜にONLにミュラーグリア/神経前駆細胞核を観察したが、我々は（ 図3 ムービー1）について詳細に彼らの回遊行動を特徴とします。 GFPによって標識ミュラーグリア/神経前駆細胞核は、彼らが一般的に存在するINLとONL、感光体損失のサイトの基底位置との間で双方向に移行します。一般的に、GFAP： -彼らは施行前にnGFP陽性核はINL（C図3A）に短い距離を移行しました核膜崩壊、まだ全体のミュラーグリア/神経前駆細胞（ 図3D）の細胞質へのGFPの再配分に基づいて、INL内に位置しています。 ONLにおける細胞分裂に続いて、2 GFAP：nGFP陽性核は基底INL（ - J図3H）に戻っONL（ 図3F、G）に見えるようになりました。細胞分裂の際に、新たに生じた核は最初は非常に暗いと（ 図3G）を識別することは困難でした。しかし、有糸分裂後1〜2時間枠内で、核GFP蛍光は、核移行の可視化（ - J図3H）を有効にする、明るくなりました。生細胞画像化はまた、図3に示したセルのための網膜の頂端面に水平に発生した分割面（ 図3F、G）の可視化を可能にしました。そのような他のトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用することも可能ですTgは[GFAP：EGFP]として細胞質でGFPを発現NT11ゼブラフィッシュ（データは示さず）。それは確実に、頂端移動および水平細胞分裂を決定することが可能であるが、それは正確にTgの基底に移行娘核と垂直細胞分裂の位置を特定することが困難な場合が多い[GFAP：EGFP] NT11ゼブラフィッシュ網膜（データは示さず）。
速度を決定するために、GFAP：nGFP陽性核記録期間を通じて移行していない基準点（ - Eスター、 図4A）として選ばれました。最大XZまたは上の画像シリーズの各時点で- nGFP陽性核（E水平赤線、 図4A）： -移行核（縦の赤線、 図4A E）の距離が基準GFAPに関連して決定しました。 YZ-の突起（依存する角度で核は可能性がありvisuali）最も効率的にZED。核が移行距離は、スプレッドシート（ - H図4F）での時間に対してプロットしました。核膜の破壊がしばしば全細胞内のGFPの再分配（この例では、セル本体の基底大部分）初期basalward運動としてグラフで観察されました。頂端速度は核エンベロープ崩壊（赤いダイヤモンド、 図4G）前の期間のための時間に対してプロットした距離に線形回帰曲線（灰色点線、 図4G）をフィッティング、核膜崩壊前に決定しました。線形回帰曲線の傾き 'M'（Y = MX + c）は、速度「DX / DT 'を表します。 図4に示す電池用の頂端速度は10.89マイクロメートル/ hでした。同じアプローチは、初期の急速な基礎運動の速度（V b）は 、新たに形成された娘核の（ 図4Fを計算するために適用されましたH）。娘細胞D1とD2の-67.71および33.51ミクロン/時間の基礎移動速度V bは 、それぞれ、高速尖端速度よりも同等でした。残念ながら、セル全体にわたって拡散GFPなど核膜破壊後の頂端速度を決定することはできませんでした。代わりに、瞬間速度は、核膜破壊および新たに形成された娘核の最初の可視化の前核のタイミングおよび位置に基づいて計算しました。娘核が見えるようになるときクロマチンは、有糸分裂の終期にONL前達すると、図4に示すセルのための7.9ミクロン/ hの瞬間速度は、おそらく過小評価です。
要約すると、網膜外植片の培養物は、ゼブラフィッシュ網膜および遊走および細胞分裂PAの決意を再生成人INMの生細胞のイメージングを可能にします個々の核のラメータ。
図1：網膜単離操作。 A）回路図は、その目でゼブラフィッシュヘッドを示します。 B）眼は、ゼブラフィッシュから除去し、瞳孔を有する眼の前部を示すように配向されます。眼茎（塗りつぶされた黒丸）と、目の奥が（Dで見えるようになる）と瞳孔が下を向くようにC）目を180°回します。グレー色は、眼の強膜の存在を示します。 E）マクファーソン-Vannasのはさみの一つのブレードは、白のセグメント化されたラインで示され、その背側と腹側の側面にそれをカットして、目の眼茎（塗りつぶされた黒丸）に挿入されています。 F）腹側半分を除去した後、眼の背側半分。黒い半円をtを示しています彼眼茎の残留部分。 G）（H）まだ強膜によって包まれる網膜（茶色）と、眼の内部には、硝子体（図示せず）とレンズ（L、ライトグレーの円）（灰色の線を明らかに90°後方に目を回し）。 I）強膜のみ網膜（茶色）を生じさせるレンズと硝子体を除去し（ノート、灰色の線が欠落している）およびJ）を剥離しました。 K）網膜は、背側網膜（L）のフラットマウントビューを生じる前方90度回転しました。フラットマウントされたガラスボトムfluorodishにM）背側網膜外植。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2の3次元再構成網膜多光子Z-スタック。光損傷の48時間後にnGFP-ゼブラフィッシュから網膜全体のマウント培養における陽性細胞：GFAPの多zスタック画像シリーズのA）3次元復元。 B - D）GFAPのシングル多XY-画像：ミュラーを含む層に相当するONL（B）のレベルで）A（で3D-復興に表示nGFP陽性細胞、INL（C）、グリア細胞体とGCL（D）。核膜崩壊後のONLの拡大ラウンドミュラーグリアを示し、（B）中の矢印。 E）損傷を受けていないのTgから網膜外植片の多zスタック画像シリーズの3次元復元[ρ：Eco.NfsB-EGFP] NT19ゼブラフィッシュ。 F - H）ロッド内部のセグメント（RIS、F）、ロッド核層のレベルでのシングル多XY-画像（G）と内側の網膜（H）のレベルで。 GCL、神経節細胞層; INL、内顆粒層; ONL、外顆粒層; RIS、ロッド内部セグメント。 A、D、EおよびH中のスケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：INMの微速度撮影映像シリーズ。 - Tgが表示zスタックのタイムラプスシリーズの3D再構成のJ）イメージシリーズ[GFAP：nGFP] INMは、網膜の外植片（一番上の行）にONLに分割するために受けるmi2004陽性核。 1頂端の移行核とその基底に移行娘核の位置は赤い矢印で示されています。レッドスターは、有糸分裂の間に核膜の内訳を示しています。 - J、一番下の行）一番上の行と同じ画像シリーズは、過飽和たとONLにおける分裂細胞に集中するクロップ。 INL、内顆粒層; IPL、内網状層。 ONL、外顆粒層。 Aにおけるスケールバーは10μmとは、Bについても同様である- J.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：アピカルと基礎の移行速度の解析。 - E） のTgのzスタック画像シリーズの最大のyz投影[GFAP：nGFP]多光子顕微鏡で取得したタイムラプス記録の異なる時点におけるmi2004網膜外植片。 「手動測定」機能アンダーラインツールを使用して、水平線は、星で示す基準セルのレベルに置きました。縦私nGFP陽性核：asurementラインが水平線で開始し、移行するGFAPの基底位置まで延びる配置しました。測定ラインの長さは、画像にし、画像の下に読みやすくするために白いボックスに記載されています。 L1娘細胞1が移行=長さ; L2娘細胞2は移行=長さ。 F）の距離セル（Aで測定した（F0）こと- E）は頂端側に移行し、生じた娘細胞D1、D2が多タイムラプス記録で基底に移行していること。赤い線は、黒、灰色の線は、それぞれ、（V B）D1およびD2のための基礎移動速度を計算するために使用される測定値を示し、一方、頂端移動速度（V A）を算出れた測定値を示しています。 G、H）距離は核膜崩壊（G）と急速な基礎の段階の前に、頂端の移行のために、Excelでの時間に対してプロットしました娘細胞D1（H）の移行。線形回帰曲線を適合させたとの機能は、速度を表す傾きでグラフの下に与えられています。 INL、内顆粒層; IPL、内網状層; ONL、外顆粒層。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| Tgは[GFAP：EGFP] NT11 | Tgは[ρ：Eco.NfsB-EGFP] NT19 | ||||||||
| レーザー出力 | 利得 | レーザー出力 | 利得 | ||||||
| トップ（桿体） | 13 | 126 | 3.5 | 118 | ミドル（ミュラーグリア） | 10 | 126 | 2.8 | 118 |
| ボトム（GCL） | 8 | 126 | 2.1 | 118 | |||||
表1：図2に表示された実験用の異なる平面でZ-強度の訂正のために使用されるレーザーとゲインレベル- 4。
映画1：多光子顕微鏡による網膜外植片のライブセルイメージング。 （右クリックしてダウンロード）。
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Discussion
損傷した成体ゼブラフィッシュ網膜主に使用される免疫細胞化学的方法5、25、26、27、28、29、30の再生を支配するメカニズムを調べる研究。文化網膜外植片に条件を確立し、そのようなINM等の現象、上のライブセルイメージングを行うために、私たちの深さで空間的、時間的な情報を得るための技術を提供します。この技術は、移動速度を決定する核エンベロープの有糸分裂の前期の間の破壊および細胞分裂の長さと位置のタイミングと位置を可能にします。また、それらの後続の位置に関して分割面と生じる娘細胞の運命を確立することが可能です。最終的に、この強力なアプローチがMかどうかを決定します2;充填剤のグリアと神経前駆細胞は網膜再生中にINMに関して異なる挙動を示します。再生応答の異なる段階で再生網膜に増殖する細胞を同定するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用することは、微分動作6を解読助けます。ここで使用される多光子顕微鏡の場合には、GFPレポーターゼブラフィッシュ系は、非常に効率的ではない赤色蛍光タンパク質（RFP）の励起として好ましいです。しかしながら、他の多システムは、RFP又は同等の蛍光体の効率的な励起を可能にすることができます。
網膜分離手順の中で最も重要なステップの一つは、網膜の搭載されています。網膜は、多光がONLの深いzレベルに渡すことができるようにするためにできるだけ平らにマウントする必要があります。特に固定化するために使用されるマージン領域、残留硝子体、および/または網膜文化の下でアガロースの蓄積、網膜のカービング組織は、最も一般的にカバースリップと網膜文化間の余分なスペースをご紹介します。また、増加したレーザパワーと利得は、網膜が平坦でないと、これが結果的に増加した光退色および網膜培養の生存度低下の原因となる場合、画像を取得するために使用されなければなりません。誤った取り付けは、しばしばも減少による光の浸透に劣った画像品質をもたらし、核が移行され、したがって、移行速度の計算した距離を測定する能力に影響を与えます。
mi2004ゼブラフィッシュ網膜の外植片：核膜崩壊前と基礎移行の頂端移動の速度は確実にTgは[nGFP GFAP]から画像シリーズで決定することができます。しかし、全体の細胞質全体にGFPの再配布など、このトランスジェニックゼブラフィッシュの行に核膜崩壊後のクロマチンの頂端移動の速度を決定することはできません。 Labeli核染料ヘキストと網膜の外植片のngのは、組織の生存能力に影響を与えたし、細胞周期の失速を引き起こしたの830nm（Lahne＆ハイド、未発表データ）に波長の変化を必要とミュラーグリア核への薄暗い取り込みをもたらしました（ Lahne＆ハイド、未発表データ）。網膜の発達中、Tgは[h2afva：h2afva-GFP]ヒストン2に融合したGFPを発現kca6ゼブラフィッシュが正常INMを監視し、細胞周期12、31の異なる段階での移行速度を決定するために使用されています。将来的には、Tgは[h2afva：h2afva-GFP]から網膜外植kca6ゼブラフィッシュは、細胞周期を通してクロマチンの可視化を可能にし、ゼブラフィッシュ網膜の再生成人における核膜崩壊後の頂端移動速度の解析が可能になります。
によってINMを監視するための条件を確立しました光損傷を受けた大人のゼブラフィッシュおよび速度の対応分析から網膜の外植片中の生細胞イメージングは、INMを支配するメカニズムを調査するための基礎を形成します。いくつかの研究は、有糸分裂ホスホ-ヒストン3陽性の核の6,7の位置を決定するために免疫細胞化学を用いて網膜を再生成人INMのメカニズムを検討し始めました。しかし、シグナル伝達経路に干渉することは有糸分裂の位置をレンダリングしないかもしれないが、免疫細胞化学によって識別することが非常に困難/不可能であるような速度、有糸分裂と分裂のタイミングなどの他のパラメータに影響を与える可能性があります。以前は、それはダイナクチンの突然変異体とモルファント11の途上網膜内に複数の基礎位置mislocalizedそのホスホ-ヒストン3陽性の有糸分裂核を示しました。しかし、その後の生細胞イメージングは、前の細胞分裂の核移行はダイナクチン無防備セルに遅れたことを明らかにしました増加頂端移動速度が到達すると、頂端面11,12に細胞分裂を受ける核を可能にします。この例では、生細胞イメージングの力を例示しています。ゼブラフィッシュ網膜再生成人INMを促進するメカニズムを解明するとき、同様に、生細胞イメージング研究を補完し、様々な例において、免疫細胞化学的アプローチよりも有利であろう。
上述したように、生細胞のイメージングは、免疫組織化学的/静的方法より多くの利点を提供します。しかし、それは網膜の外植片をex vivoでのモデルであることに留意する必要があります。このように、単離手順および/または培養条件の間に生じた損傷は、細胞プロセスに影響を与える可能性があります。また、撮像手順自体は、細胞挙動23、32に影響を及ぼし得る毒性効果を発揮することができます。 disadvありますが網膜の文化のイメージング細胞生きるantagesは、INMの動的な情報を取得するために、現在最善の方法です。重要なことは、網膜の外植片の生細胞イメージング手順は、網膜再生中に他の生物学的な質問にも適用されます。免疫細胞化学的データに基づいて、以前にミュラーグリア細胞は、光誘起感光体の損傷33次瀕死光受容体/残骸を貪食することを示唆しました。死にかけている光受容体の食作用は、再生ゼブラフィッシュ網膜に発生し、根底にあるメカニズムを研究するために使用することができる場合、画像パラメータを調整すると、このプロセスは、ライブ検証します。画像は[ρ：Eco.NfsB-EGFP]のTgにロッド核とロッド内部のセグメントのレベルで取得することができることが示されたがNT19ゼブラフィッシュ、画像感光体食作用への条件を調整することは可能であるべきです。同様に、知識はミクログリアとそのを支配するメカニズムの動的挙動に関する制限されています縮退関数と網膜34、35を再生します 。ライブセルイメージングと併せてミクログリア固有のトランスジェニックゼブラフィッシュを利用することはまた、ゼブラフィッシュ網膜36、37を再生成人におけるミクログリアの機能の理解を増加します。要約すると、網膜外植片の生細胞のイメージングは、細胞プロセスの動的情報を取得し、再生網膜における異なる細胞型の動作と機能を決定するための強力なツールです。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、ウィリアム・アーチャーとノートルダム統合イメージング施設によって提供されるサポートに感謝しています。特別な感謝は彼らの継続的な支援とそのケアやゼブラフィッシュの飼育のためにフライマンライフサイエンス技術者を対象としています。この研究は、DRHにNIHの国立眼研究所（R01-EY018417、R01-EY024519）とゼブラフィッシュ研究センター、ノートルダム大学、ノートルダム、INからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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