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Developmental Biology

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Abstract

Um programa de regeneração endógena é iniciada por Müller glia no peixe-zebra adulto (Danio rerio) retina seguintes danos e morte neuronal. As Müller glia re-entrar no ciclo celular e produzir células progenitoras neuronais que são submetidos a ciclos subsequentes de divisões celulares e diferenciar em tipos de células neuronais perdidas. Ambos Müller glia e células progenitoras neuronais núcleos replicar o seu ADN e sofrem mitose em locais distintos da retina, ou seja, elas migram entre o basal camada interna Nuclear (INL) e a camada exterior Nuclear (ONL), respectivamente, em um processo descrito como Interkinetic Migração nuclear (INM). INM foi predominantemente estudados na retina em desenvolvimento. Para examinar a dinâmica do INM no adulto regenerar retina zebrafish em detalhe, processamento de imagem de células vivas de células fluorescentes marcado Müller glia / neuronais progenitoras é necessária. Aqui, nós fornecemos as condições para isolar e retinas cultura dorsaisde Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra que foram expostos à luz intensa constante por 35 h. Também mostram que estas culturas de retina são viáveis para efectuar experiências de imagiologia ao vivo de células, a aquisição de imagens continuamente Z-pilha, através da espessura do explante da retina por até 8 h, usando microscopia multifotônica para monitorar o comportamento migratório das GFAP: células -positivas nGFP . Além disso, descrevemos os detalhes para realizar a análise pós-imagem para determinar a velocidade do INM apical e basal. Para resumir, nós estabelecemos condições para o estudo da dinâmica do INM em um modelo adulto da regeneração neuronal. Isto irá avançar nossa compreensão deste processo celular crucial e nos permitem determinar os mecanismos que controlam INM.

Introduction

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar 5 e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram 2, 3, 4. Durante a fase proliferativa da resposta de regeneração, os núcleos de células da glia Müller e suas células progenitoras neuronais provenientes passam por um padrão repetitivo migratório em fase com o ciclo celular (migração nuclear Interkinetic, INM) 6 >, 7. Núcleos posicionado no INL basal replicar o seu DNA antes de migrar para a camada exterior Nuclear (ONL), onde se dividem antes de retornar os núcleos resultantes basalmente para o INL. Este processo foi descrito pela primeira vez durante o desenvolvimento neuroepithelial usando métodos histológicos, enquanto abordagens de imagens ao vivo de células mais tarde confirmado a interpretação por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambas as abordagens de imagem histoquímicos e em células vivas, foram usadas para determinar os mecanismos subjacentes INM e a sua função no desenvolvimento neuroepithelia incluindo a retina 9, 11, 12, 13. No entanto, os mecanismos que regem INM no adulto regenerar retina não foram estudadas em grande detalhexref "> 6, 7. imagens ao vivo de células será uma abordagem de valor inestimável para avançar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização que controlam o INM na retina regenerar adulto.

Até recentemente, a criação de imagens de células vivas de INM na retina foi limitada a qualquer embriões de peixe-zebra ao vivo ou para pinto embrionário ou o rato pós-natal explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Enquanto explantes de retina de animais adultos de uma variedade de espécies, incluindo ratinhos, ratos e peixes-zebra foram utilizadas para diferentes células abordagens biológicas 17, 18, 19, 20, experimentos com imagens em células vivas a partir de explantes de retina have sido restrita a breves períodos de tempo e não foram executadas de forma contínua ao longo de várias horas 21, 22. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura adultos retinas de peixe-zebra danificado de luz para realizar experimentos com imagens em células vivas, monitoramento INM usando microscopia multi-fotão 6. Abordagens de imagem de células vivas são vantajosos em relação aos métodos de imuno-histoquímica ao investigar os mecanismos que controlam INM, como a dinâmica do INM, por exemplo, as velocidades podem ser afetadas em vez de a localização da mitose, o que não seria potencialmente ser detectada usando imunocitoquímica.

No futuro, este método tem também o potencial de ser modificado para estudar outros processos dinâmicos durante a regeneração da retina, tais como fagocitose de morrer fotorreceptores por Muller glia ou o comportamento da microglia.

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Protocol

Nota: Os peixes-zebra foram criados e mantidos na instalação de Notre Dame Zebrafish na Freimann Life Sciences Center. Os métodos descritos neste manuscrito são aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e estão em conformidade com a instrução para o uso de animais em pesquisa visão pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia.

1. Soluções

  1. Preparar 70% de etanol para esterilizar o capuz de cultura de tecidos e qualquer equipamento / reagentes que são transferidos para o capuz de cultura de tecidos.
  2. Adicionar 2 ml de 2-fenoxietanol para 1 L de água do sistema (1: 500 2-fenoxietanol).
  3. Prepare 0,1 mM de NaHCO3, pH 8,0. Usar uma seringa de 10 ml e um filtro de tamanho de poro de seringa de 0,2 uM para esterilizar a solução em um capuz de cultura de tecidos esterilizadas.
    NOTA: NaHCO 3 é usado para espalhar o adesivo de forma eficiente as células e tecidos através da superfície da lamela de fluorodishes (verpasso 3.2).
  4. Prepare a 1,0 M de CaCl2 e 1,0 M de MgCl2. Esterilizar com uma seringa de 10 mL e filtro de seringa de tamanho de poro de 0,2 um em um capuz de cultura de tecidos esterilizadas.
  5. Para preparar Hank's-solução salina equilibrada (HBSS), adicionar estéril de CaCl2 estéril e MgCl2 a 1X HBSS sem Ca2 + / Mg2 +, sem vermelho de fenol a uma concentração final de 1 mM cada. Trabalhar em um ambiente estéril.
  6. Para preparar o meio de cultura, misturar 50% 1x Meio Essencial Mínimo (MEM) sem vermelho de fenol, 25% HBSS contendo CaCl 2 e MgCl 2 (ver secção 1.4), 25% Soro de Cavalo (HS), 10 unidades / ml de penicilina e 10 ug / ml de estreptomicina. Trabalhar em um ambiente estéril.
    NOTA: Evite meio contendo vermelho de fenol como autofluoresces, afetando sinal para relações de ruído. 23
  7. Prepare 10 mL de 1% agarose de baixo ponto de fusão em 1x MEM sem vermelho de fenol. Derreter de agarose / 1x MEM usando um micav. Prepare pequenos volumes de agarose (por exemplo, 10 ml) como reaquecimento repetitivo irá alterar as concentrações de iões devido a evaporação de fluido.
  8. Antes da cultura, esterilizar 1,5 mL tubos de microcentrífuga por autoclavagem.

Paradigm 2. Light-danos

  1. Dark-adaptação
    1. Colocar 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra (ou outro peixe-zebra transgénico de interesse) em 6 - 14 meses de idade num ambiente isento de luz, durante 14 d. Para mais detalhes veja referência 2, 6, 24, 25.
  2. Posicione o tanque contendo 2-3 peixes-zebra transgénicos de adaptação ao escuro na água do sistema entre duas lâmpadas fluorescentes que emitem luz de 2.800 lux 2, 6, 24, 25. Expor zebrafish à luz intensa constante por 35 h. Durante a exposição à luz, assegurar que a temperatura da água é mantida entre 31-33 ° C.

3. Preparação para a cultura (no dia do isolamento da retina)

  1. Utilizando 70% de etanol, esterilizar o capuz de cultura de tecidos e os componentes / ferramentas que são transferidos para o capuz de cultura de tecidos (por exemplo, frascos contendo MEM e HBSS, pipetas, pontas de pipeta estéreis, etc.).
  2. Preparação de fluorodishes
    1. Brasão um fluorodish para cada retina com células e tecido adesivo (ver Tabela de Materiais).
    2. Dilui-se o adesivo de células e tecidos em mM NaHCO3 0,1 a uma concentração final de 70 ug / ml, adicionar 50 ul de cada fluorodish e espalhar a solução através do centro do fluorodish com uma ponta de pipeta de 200 uL (cerca de 1 - diâmetro 1,2 centímetros ).
    3. Incubar as fluorodishes revestidos por 1-3 h à TA; (Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C).
    4. Remover a solução e lavar 3x com 500 mL de 1x MEM para cada lavagem. Para evitar os fluorodishes revestidos de secar, mantê-los em MEM até explantes de retina são montados.
  3. Prepare meio de cultura tal como descrito no passo 1.6. O meio de cultura pode ser armazenado durante até 1 semana a 4 ° C.

4. O isolamento e cultura de explantes de retina

NOTA: O protocolo delineado abaixo é para o isolamento da retina dorsal, que é a região da retina que é predominantemente lesionada pelo paradigma de luz danos descrito. Portanto, a proliferação induzida por danos e o evento associado de migração nuclear interkinetic ocorrer na retina dorsal. No entanto, o procedimento de isolamento pode ser ajustado para se obter regiões da retina de acordo com os requisitos específicos da questão investigador / pesquisa.

  1. Euthanize um light-danificado transgênicos zebrafish umtempo ta em 1: 500 2-fenoxietanol.
  2. Remov de um fluorodish com uma pipeta de 1000 uL de modo a que apenas uma fina película de restos de fluidos.
  3. Transfira o peixe-zebra em uma toalha de papel seco, remover o olho com um par de fórceps curvado Dumont (fórceps Nº 5, ângulo de 45 °) e transferi-lo para o fluorodish.
  4. Usando um estereomicroscópio, orientar o olho com a pupila para o deslizamento da tampa do fluorodish de modo que a parte posterior do olho, com o nervo óptico é visível (Figura 1D).
  5. Com um par de tesouras McPherson-Vannas remover o nervo óptico, de corte perto da parte posterior do olho. Em adição, remover o tecido conjuntivo que revestem o exterior do olho.
  6. Mantenha o olho entre o seu lado nasal e temporal com um par de # 5 fórceps ao fazer uma incisão na haste óptica por perfuração com uma lâmina de tesoura através da lâmina cribrosa e corte ao longo tanto do lado nasal e temporal do olho (ver Figura 1E , Li segmentadane).
  7. O uso de dois pares de pinças # 5, para a realização de um lado dorsal da retina e o outro par de separar o ventral a partir da retina dorsal, puxar o tecido.
    NOTA: É aconselhável para orientar a retina dorsal de modo que a lente e a camada de células ganglionares enfrentar a lamela enquanto a esclera está virada para cima.
  8. Remover a esclerótica da retina dorsal com um par de fórceps # 5, enquanto mantém a lente que está ligado à retina com um segundo par de fórceps # 5 (Figura 1H, I).
  9. Para remover a lente, utilizar tesouras McPherson-Vannas e cortar atrás da lente sem danificar a retina (Figura 1I, J). Por vezes, a lente separa no passo 4.7. Neste caso, remover a esclera cuidadosamente com uma pinça, mantendo a retina a uma orla de corte com um segundo par de fórceps # 5.
  10. Remover o vítreo durante a remoção da lente sem danificar a retina. Achatar a retina com a camada de células ganglionares de frente para a lamelado fluorodish (Figura 1 L, M).
  11. Cercam a retina com 10 mL de 1% agarose de baixo ponto de fusão e deixar a agarose solidificar.
  12. Assista que a agarose líquido não levantar a retina como até mesmo uma ligeira elevação pode afetar a capacidade de se concentrar profundamente no tecido. Se elevação é observada, utilizar uma pipeta para remover agarose. Vamos conjunto de agarose residual antes de tentar adicionar mais.
  13. Repita o passo 4,12 várias vezes antes de adicionar 1% agarose de baixo ponto de fusão para cobrir toda a fluorodish. Uma vez que a agarose solidificou, adicione 1,5 mL de meio de cultura.
  14. Manter a cultura de explantes de retina num ambiente de ar / 5% de CO 2 fixada em 32 ° C durante aproximadamente 12 horas para permitir que a retina para recuperar do stress efectuadas pelo processo de isolamento. Ajustar a temperatura para 32 ° C para manter a retina à mesma temperatura como peixe-zebra luz-tratados (ver passo 2.3).

5. Multiphoton Microscopia

Tabela de Materiais), uma longa distância objetiva de imersão em água 40X Apo (NA 1.15), um scanner galvanômetro e um câmara ambiental que contém uma inserção de quatro 35 milímetros placas de Petri. As imagens foram adquiridas com um detector não-descanned (R-NDD).

  1. Antes da imagiologia, equilibrar a câmara de condicionamento para atingir uma atmosfera de CO 2 / ar 5%. Certifique-se de que os pratos de Petri vazias são inseridos no suporte para evitar fugas de gás para dentro da sala.
  2. Ligue o sistema de microscopia.
  3. Uma vez que a câmara ambiental é equilibrado, adicione líquido de índice de refração para o 40X Apo longa distância objetiva de imersão em água (NA 1.15).
    NOTA: O índice de refracção de líquido com propriedades ópticas semelhantes a água é usada para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo.
  4. gripe lugarorodishes com explantes de retina para a câmara. Usando a luz brightfield, posicione a amostra para o caminho da luz e trazer a região intermediária da retina dorsal para o plano de foco.
  5. Use luz epifluorescência GFP para se concentrar em GFAP: nGFP -positivo Müller núcleos da glia (Figura 2A, C).
    NOTA: Se explantes não são montados plana ou agarose acumulada sob o explante, será difícil para se concentrar na GFAP: nGFP núcleos -positivas ou eles vão fluorescência vagamente.
    1. Verifique se movendo para uma região diferente dentro do mesmo explante de retina irá superar o problema de foco. Caso contrário, passar para um explante de retina diferente.
  6. No software de aquisição de imagem, abra o 'A1 MP GUI ", o" TiPad', o 'A1 Compact GUI "e as janelas' nd de aquisição». Para geração de imagens multiphoton, verifique se a opção 'IR NDD' é escolhido no 'A1 Compact GUI'.
  7. No 'Definiçõescampo de g ', selecione IR-DM para o espelho dicróico 1º e escolher o filtro passa banda de 525/50 para adquirir GFP fluorescência.
  8. Ligue o laser IR na janela chamada 'A1MP GUI'. Vai demorar alguns minutos para que o laser estar pronto. Defina o comprimento de onda de 910 nm para excitar GFP fluorescência e alinhar o laser, clicando no botão 'alinhamento Auto' na janela de 'A1 MP GUI'.
  9. Assegurar que a sala e equipamentos luzes são desligadas ou cobertas antes de abrir o obturador no 'A1 MP GUI ", para evitar a exposição excessiva do tubo fotomultiplicador. Para reduzir os níveis de ruído, abrigar o microscópio em um ambiente escuro.
  10. Adquirir imagens de um campo de visão de 300 x 300 pixels, com um zoom de dois, e um tempo de pixel habitação de 4,8 uS / pixel. Cerca de configurar a potência do laser, alterando a 'área de aquisição' no 'A1MP GUI "e o ganho na janela de' A1 Compact GUI '.
  11. Configurando o z-stack
    1. Concentre-se na camada de células ganglionares para definir o plano focal topo do z-stack no "-subwindow Z 'dentro da" janela de aquisição ND'. Alguns GFAP: células -positivas nGFP estão normalmente localizados na camada de células ganglionares, que ajuda a identificar o limite basal da retina (Figura 2A, D).
    2. Mover o plano focal através do nível da ONL (Figura 2A, B), que é caracterizada pela presença de GFAP mal etiquetado: células -positivas nGFP que sejam redondos e alargada em relação às suas contrapartidas na INL (Figura 2A, C) .
    3. Manter esta plano que a parte inferior da z-pilha. Assegure-se que toda a ONL vai ser trabalhada (Figura 2A, B).
    4. Ao experimentar mudanças de plano focal que exigem re-ajustamento durante o período de imagem, clique duas vezes sobre a posição central na subwindow 'z' para atribuí-lo como a posição de 'casa'. Alterar para 'modo simétrico definida'e clique "relativa".
    5. Defina o tamanho do z-passo entre 0,7-1 m.
  12. Z correcção de intensidade:
    1. Aplicar correções z intensidade para compensar a perda de intensidade de pixel, devido à dispersão da luz quando imagens em camadas profundas do tecido.
    2. Para configurar a correção, abra a janela "correção z-intensidade". Para definir o 'gama z-stack', escolha 'From ND'.
    3. Clique no plano focal inferior da janela "Z-intensidade correcção '(neste caso, corresponde à camada de células ganglionares) e definir a intensidade do laser (" área de aquisição' no 'A1MP GUI ") e de ganho (GUI compacto A1 ).
    4. Clique na seta ao lado do 'z-valores "na janela" correção z-intensidade "para confirmar as configurações que são posteriormente mostrado em' configurações do dispositivo" na janela "correção z-intensidade" para o plano focal escolhido.
    5. Repetir o processo para a um meioaviões top nd, aumentando a potência do laser e do ganho. planos focais adicionais podem ser adicionados se necessário. Ver Tabela 1 para configurações específicas de laser e de ganho para experimentos nas figuras 2 - 4.
    6. Defina a "área de aquisição 'na janela de' A1 MP GUI '. Evitar a selecção de uma zona de aquisição superior a 15 e um ganho superior a 126 no início de imagem para contornar a fotodegradação e o aumento dos níveis de ruído.
      NOTA: Como lasers e tubos fotomultiplicadores diferir entre sistemas de microscopia, do laser de teste e ajustes de ganho para obter condições de imagem óptimas para o microscópio configurar evitando fotodegradação.
    7. Escolha 'correção intensidade relativa' na janela 'correção z-intensidade ".
  13. No subwindow 'timeseries' na janela de 'ND aquisição', defina a duração de 8 horas e o intervalo para 'sem atraso'. Então, certifique-se de clicar no botão "Run z-correção 'em tele 'z-stack' sub janela no botão da janela 'ND aquisição "para adquirir os timeseries 3-D.
  14. Manter explantes de retina, a uma temperatura de 27-29 ° C durante toda a duração de aquisição de imagem.
  15. Durante todo o período de aquisição de imagem, se necessário, reajustar o nível de potência e de ganho, a fim de manter uma qualidade de imagem para análise pós-imagiologia. Para ajustes executar etapas 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Se as mudanças de plano focal, pausar ou parar a corrida e executar a etapa 5.11 novamente.
    NOTA: Se 'z-correção relativa "foi escolhida na etapa 5.12.7 e 5.11.4 etapa foi realizada não deve ser necessário reajustar os níveis de poder e lucro, a menos extensa fotodegradação ocorreu.

6. Análise de Velocidade

  1. Extrai-se a tempo, definindo uma «região de interesse» na imagem. Use a 'medição do tempo' ferramenta e exportar os valores de tempo para uma planilha.
  2. Cortar uma região que contém uma diGFAP necer: nGFP núcleo -positivo.
  3. Escolha da região recortada para que ele contenha pelo menos um núcleo que não sofram INM, a fim de definir um ponto de referência para medir, posteriormente, as distâncias que o núcleo divisória migraram em relação ao basal INL. NOTA: Para escolher um núcleo que permanece no INL basal, que ajuda a preparar uma reconstrução 3-D dos timeseries.
  4. Em alternativa, se um GFAP: célula -positivo nGFP é observado na ONL durante todo o período de aquisição, utilizar uma linha vertical de comprimento fixo que mede a partir do núcleo para o ONL INL basal, a fim de identificar um ponto de referência.
  5. Usando a função de "mostrar fatias view ', gerar projeções ortogonais. Posteriormente, alterar o modo de 'fatia' para 'maximum intensity projection ".
  6. Desligue o ponto de vista 'xy' da projeção máxima ortogonal. Dependendo da orientação em que o Migração / núcleo dividindo é melhor visível, umalso desligar tanto o 'xz'- ou o "-view yz'.
  7. Clique na imagem permanecendo com o botão direito do mouse e extrair o 'série yz'-imagem com o' 'xz' ou função Criar novo documento a partir dessa visão '. Se necessário, gire a imagem.
  8. Usando a função "Manual de Medição ', desenhe uma linha horizontal através da imagem no nível inferior do núcleo que permanece no INL basal e não sofre INM (= ponto de referência; Figura 4A - E, linha horizontal vermelha).
  9. Medir a distância entre a linha de referência e o ponto basal do núcleo migrando para os timeseries utilizando a ferramenta 'linha medida "no software de análise (ver Figura 4A - E).
  10. Uma vez que o envelope nuclear se rompe, medir a posição basal da soma se for identificável após a difusão da GFP em toda a célula.
  11. Usando um software de planilha, traçar a distância de um nuCleus migraram contra o tempo passou (Figura 4F).
    1. Para determinar a velocidade apical de migração (v a), do gráfico as distâncias percorridas para o período antes desagregação envelope nuclear ocorre (Figura 4G).
    2. Seleccione a série de dados no gráfico, clique com o botão direito do mouse e inserir uma curva de regressão linear incluindo a função correspondente 'y = mx + c'. A inclinação 'm' na função representa a velocidade, v a (Figura 4G).
    3. Repita os passos 6.11.1 e 6.11.2 para a primeira fase da migração basal rápida para determinar a velocidade de migração basal, v b (Figura 4H).

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Representative Results

O isolamento da retina de acordo com o procedimento delineado no esquema na Figura 1 permite a cultura de uma retina dorsal achatada de luz-danificado adulto Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra ao longo de um período de pelo menos 24 horas numa atmosfera de 5% de CO 2 ambiente / ar. Estes explantes de retina montados plana pode ser usado para planos focais imagem em níveis tecidos profundos. Um exemplo é Müller glia / núcleos neuronais de células progenitoras marcadas com GFP a partir do promotor GFAP (proteína glial fibrilar ácida) específicos para as células da glia Müller que estão localizados na ONL durante a mitose na retina luz-danificado (Figuras 2A - D, 3). Para confirmar ainda mais que esta abordagem é aplicável a imagem das várias camadas de células da retina, explantes de retina agudamente isolados foram preparados a partir danificado Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] olhos de peixe-zebra nt19 que expressam EGFP em bastonetes sobo promotor da rodopsina. Figura 2E - H mostra que é possível obter imagens de fotorreceptores haste GFP-positivas e os seus segmentos interiores. Como haste segmentos interiores estendem-se entre os fotorreceptores cone em relação ao epitélio pigmentar da retina, estes dados implicaria que também é possível a imagem fotorreceptores cone. O que não era investigado.

Tendo em núcleos / células progenitoras da glia Müller observados neuronais no ONL na retina luz-danificado, caracterizamos o seu comportamento migratório em detalhe (Figura 3 e um filme). Müller / núcleos de células da glia progenitoras neuronais marcados por GFP migrar bidireccionalmente entre a posição basal do INL onde eles normalmente residem e ONL, o local de perda de fotorreceptores. Normalmente, GFAP: nGFP núcleos -positivas migrado uma distância curta no INL (Figura 3A - C) antes que eles foram submetidos anuclear repartição do envelope, enquanto ainda está posicionado no INL, com base na redistribuição de GFP para o citoplasma da / célula progenitora neuronal toda glia Müller (Figura 3D). Após a divisão celular na ONL, dois GFAP: nGFP núcleos -positivas tornou-se visível na ONL (Figura 3F, L) que voltou para o basal INL (Figura 3H - J). Após a divisão celular, os núcleos recém resultantes foram inicialmente muito fraca e, portanto, difíceis de identificar (Figura 3G). No entanto, dentro de um a dois intervalos de tempo após a mitose, fluorescência da GFP nuclear tornou-se brilhante, o que permitiu a visualização da migração nuclear (Figura 3H - J). Processamento de imagem de células vivas, também permitiu a visualização do plano de divisão (Figura 3F, G), o que ocorreu na horizontal para a superfície apical da retina para a célula mostrada na Figura 3. Também é possível utilizar outras linhas de peixes-zebra transgénicos taiscomo a Tg [GFAP: EGFP] NT11 peixe-zebra que expressam GFP no citoplasma (dados não apresentados). Embora seja possível determinar com fiabilidade o movimento apical e divisões celulares horizontais, é muitas vezes difícil identificar exactamente a posição dos núcleos filha basalmente migram e divisões celulares verticais na Tg [GFAP: EGFP] NT11 peixe-zebra retina (dados não mostrados).

Para determinar a velocidade, um GFAP: nGFP núcleo -positivo que não migram ao longo do período de registo foi escolhida como ponto de referência (estrela, Figura 4A - E). A distância do núcleo de migração (linha vermelha vertical, Figura 4A - E) foi determinada em relação ao GFAP referência: nGFP núcleo -positivo (linha vermelha horizontal, Figura 4A - E) em cada ponto temporal da série de imagem no máximo xz ou YZ-projecções (dependendo do ângulo em que os núcleos podem ser visualized mais eficiente). A distância que o núcleo migraram foi em função do tempo em uma planilha (Figura 4F - H). colapso da membrana nuclear foi frequentemente observado no gráfico como um movimento inicial basalward devido à re-distribuição de GFP dentro de toda a célula (basal maior parte do corpo da célula, neste caso). A velocidade apical foi determinada antes da ruptura do envelope nuclear, ajustando uma curva de regressão linear (linha pontilhada cinza, Figura 4G) para a distância em função do tempo para o período antes do colapso envelope nuclear (diamante vermelho, Figura 4G). O declive 'm' da curva de regressão linear (y = mx + c) representa a velocidade 'dx / dt'. A velocidade apical para a célula apresentada na figura 4 foi de 10,89 pM / h. A mesma abordagem foi aplicada para calcular a velocidade do movimento da base inicial rápida (v b) do núcleos filha recém-formado (Figura 4F, H). A migração basal velocidades v b de -67,71 e 33,51 um / h de células filhas D1 e D2, respectivamente, foram comparativamente mais rápido do que a velocidade apical. Infelizmente, não foi possível determinar a velocidade apical após o colapso do envelope nuclear, tal como a GFP difundida por toda a célula. Em vez disso, a velocidade instantânea foi calculada com base no tempo e a posição do núcleo antes da desagregação invólucro nuclear e a primeira visualização dos núcleos filhos recém-formados. A velocidade instantânea de 7,9 pM / h para a célula mostrada na Figura 4 é provavelmente uma subestimativa, uma como a cromatina atinge o ONL antes telofase da mitose, quando os núcleos filha se tornam visíveis.

Para resumir, a cultura de explantes de retina permite imagens ao vivo de células de INM no adulto regenerar retina zebrafish ea determinação da migração e divisão celular patros de núcleos individuais.

figura 1
Figura 1: Processo de isolamento da retina. A) esquemático que ilustra uma cabeça de peixe-zebra com seu olho. B) O olho é removido do peixe-zebra e orientada para mostrar a parte frontal do olho com a pupila. C) Rodar o olho 180 °, de modo que a parte posterior do olho com a haste óptica (preenchido círculo preto) torna-se visível em (D) e a pupila estiver virada para baixo. A cor cinza indica a presença da esclerótica do olho. E) Uma lâmina de uma par de tesouras McPherson-Vannas é inserido na haste óptica do olho (preenchido círculo preto) cortá-la em sua lados dorsal e ventral, que está indicado pela linha segmentada branco. F) a metade dorsal do olho após a metade ventral foi removido. O meio círculo preto indica tele parte residual da haste óptica. G) Rodar o olho 90 ° para trás para revelar (H) no interior do olho com a retina (castanho), vítreo (não mostrado) e a lente (L, luz círculo cinzento) que ainda é envolto pela esclera (linha cinzenta ). I) A esclera foi destacado (note, linha cinza está ausente) e J) da lente e vítreo removido dando origem a única a retina (marrom). K) Retina virou 90 ° para a frente dando origem a uma vista plana de montagem da retina dorsal (L). M) Dorsal explante de retina flat-montado em um fluorodish com fundo de vidro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: 3-D de ReconstruçãoRetinal Multiphoton Z-pilhas. A) a reconstrução 3-D de uma série de imagens z-stack multiphoton de GFAP: nGFP- células positivas na retina culturas inteiras de montagem de peixe-zebra após 48 h de luz-danos. Células -positivas nGFP indicadas na reconstrução 3D-em (A) ao nível da ONL (B), o INL (C), que corresponde à camada que contém Müller: D) Um único multifotônica xy imagens de GFAP - B soma glia eo GCL (D). Arrow in (B) indica uma glia Müller redonda alargada na ONL após a avaria envelope nuclear. E) 3-D reconstrução de uma série de imagens z-stack multiphoton de um explante de retina de uma intacta Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] zebrafish nt19. F - H) Single multifotônica xy imagens ao nível dos segmentos de haste interna (RIS, F), camada nuclear haste (G) E ao nível da retina interna (H). GCL, Ganglion celular Camada; INL, Inner Camada Nuclear; ONL, Camada exterior Nuclear; RIS, Segmento haste interna. A barra de escala em A, D, E e H, 10 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Timelapse Series Imagem do INM. A - J) Série da imagem de 3D-reconstrução da série timelapse z-stack exibindo Tg [GFAP: nGFP] mi2004 núcleos -positivas que sofrem INM para dividir na ONL em explantes de retina (linha superior). A posição de migração de um núcleo apical e a sua migração basalmente núcleos filha é indicada por setas vermelhas. estrela vermelha indica quebra envelope nuclear durante a mitose. A - J, linha inferior) Amesma série de imagens como na linha superior foi saturado e cortada para centrar-se nas células em divisão na ONL. INL, Inner Camada Nuclear; IPL, Inner Plexiform Camada; ONL, camada nuclear externa. Barra de escala em A, 10 mm e é o mesmo para B - J. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Análise das velocidades de migração apical e basal. A - E) Máxima YZ-projeção de uma série de imagens z-stack da Tg [GFAP: nGFP] mi2004 explantes de retina em momentos diferentes da gravação timelapse adquirida por microscopia multi-fotão. Usando a ferramenta de linha sob a função 'Manual de Medição', uma linha horizontal foi colocada ao nível da célula de referência, indicada por uma estrela. A me verticaislinha asurement foi posicionado começando na linha horizontal e estendendo-se para a posição basal da GFAP migração: nGFP núcleo -positivo. O comprimento da linha de medição é fornecida nas caixas brancas nas imagens e para facilitar a leitura sob as imagens. L1 = comprimento que uma célula filha migraram; L2 = comprimento dessa célula filha 2 migrado. F) Distância que a célula (F0) medida em (A - E) migrou apicalmente e que as células filhas resultantes D1 e D2 migrado basalmente na gravação multifotônica Timelapse. A linha vermelha indica as medidas para as quais foi calculada a velocidade de migração apical (v a), enquanto as linhas pretas e cinza indicam as medições utilizadas para calcular as velocidades de migração basais (v b) para D1 e D2, respectivamente. G, H) A distância foi em função do tempo no Excel para a migração apical antes da quebra envelope nuclear (G) ea fase de basal rápidamigração para a célula filha D1 (H). As curvas de regressão linear foram montados e as funções são dadas abaixo dos gráficos com o declive representa a velocidade. INL, Inner Camada Nuclear; IPL, Inner camada plexiforme; ONL, camada nuclear externa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tg [GFAP: EGFP] NT11 Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
potência do laser ganho potência do laser ganho
Top (fotorreceptores da haste) 13 126 3,5 118 Médio (Müller glia) 10 126 2.8 118
Inferior (GCL) 8 126 2.1 118

Tabela 1: Laser e níveis de ganho usados para Z-Intensidade correções nos diferentes planos de Experimentação apresentados nas Figuras 2 - 4.

Figura 2
Filme 1: Imagens Live-célula de explantes de retina por Multiphoton Microscopia. (Clique direito a download).

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Discussion

Estudos investigando os mecanismos que regem a regeneração do adulto danificado retina zebrafish métodos utilizados predominantemente imunocitoquímicos 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Estabelecer condições para a cultura de explantes de retina e para realizar processamento de imagem de células vivas em fenômenos, como INM, fornecer-nos uma técnica para obter em profundidade espacial e informação temporal. Esta técnica permite determinar as velocidades de migração, o momento ea posição de avaria envelope nuclear durante a prófase da mitose e o comprimento ea posição da divisão celular. Além disso, é possível estabelecer o plano de divisão e o destino das células filhas resultantes no que respeita à sua localização posterior. Em última análise, esta abordagem poderosa irá determinar se H2; glia ller e células progenitoras neurais se comportam de maneira diferente em relação ao INM durante a regeneração da retina. A utilização de linhas de peixes-zebra transgénicos que identificar as células que proliferam na retina regeneração em fases distintas da resposta regeneração irá ajudar decifrar comportamento diferencial 6. No caso do microscópio multifotônica usado aqui, GFP repórter linhas de peixes-zebra são preferidos como excitação de Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) não é muito eficiente; no entanto, outros sistemas multifotônica pode permitir excitação eficiente da RFP ou fluoróforos equivalentes.

Um dos passos mais críticos no processo de isolamento da retina é a montagem da retina. Retinas tem que ser montado o mais plano possível para a luz multiphoton para ser capaz de passar para as mais profundas z-níveis da ONL. Encurvamento da retina, especialmente na região marginal, vítreo residual, e / ou acumulação de agarose sob a cultura da retina, o qual é usado para o imobilizartecido, mais comumente introduzir espaço extra entre a lâmina de cobertura e a cultura da retina. Além disso, o aumento da potência do laser e o ganho de ter de ser utilizado para obter imagens da retina, se não é plana e consequentemente isto irá provocar um aumento da fotodegradação e diminuição da viabilidade da cultura da retina. Incorreto de montagem muitas vezes também resulta em menor qualidade de imagem devido a penetração de luz reduzida e vai afetar a capacidade de medir as distâncias que os núcleos tinham migrado e, portanto, o cálculo das velocidades de migração.

As velocidades de migração apical antes da quebra envelope nuclear e de migração basal pode ser determinada de forma confiável em uma série de imagens de Tg [GFAP: nGFP] mi2004 explantes de retina zebrafish. No entanto, não é actualmente possível determinar a velocidade de migração apical da cromatina após a ruptura do envelope nuclear nesta linha de peixes-zebra transgénicos como os GFP redistribui em todo o citoplasma. Labeling de explantes de retina com o corante nuclear Hoechst resultou na absorção fraca em núcleos glia Müller que exigiam a mudança no comprimento de onda de 830 nm (Lahne & Hyde, dados não publicados), o que afectou a viabilidade do tecido e causou bloqueio do ciclo celular ( Lahne & Hyde, dados não publicados). Durante o desenvolvimento da retina, Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 peixe-zebra que expressam GFP fundida a histona 2 foram usados com sucesso para monitorar o INM e determinar velocidades de migração nas diferentes fases do ciclo celular 12, 31. No futuro, os explantes de retina de Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 peixe-zebra também irá permitir a visualização da cromatina ao longo do ciclo celular e vai permitir a análise da velocidade de migração apical após o colapso da membrana nuclear no adulto regenerar retina de peixe-zebra.

Tendo estabelecido as condições para monitorar INM porprocessamento de imagem de células vivas em explantes de retina do peixe-zebra adulto light-danificado e a análise correspondente de velocidades formarão a base para investigar os mecanismos que regem INM. Alguns estudos começaram a examinar os mecanismos de INM no adulto regenerar retina usando imunocitoquímica para determinar a posição de mitótico fosfo-histona núcleos positivos 3-6, 7. No entanto, interferir com vias de sinalização não pode tornar a posição da mitose, mas pode afectar outros parâmetros tais como a velocidade, o momento da mitose e divisão que não seria possível / muito difícil de discernir por imunocitoquímica. Anteriormente, demonstrou-se que os núcleos de mitose fosfo-histona 3-positivos mislocalized para posições mais basais na retina em mutantes dinactina e morphants 11 desenvolvimento. No entanto, processamento de imagem de células vivas subsequente revelou que a migração nuclear antes da divisão celular foi atrasado em células comprometidas-dinactinas, enquanto que um aumento da velocidade de migração apical activado núcleos para alcançar e submeter-se a divisão celular na superfície apical 11, 12. Este exemplo exemplifica o poder de processamento de imagem de células vivas. Da mesma forma, quando desvendar os mecanismos que facilitem INM no adulto regenerar retina zebrafish, estudos de imagem em células vivas irá complementar, e em vários casos será vantajoso em relação, abordagens imunocitoquímicos.

Como discutido acima, processamento de imagem de células vivas oferece muitas vantagens sobre imuno-histoquímica métodos / estáticos; No entanto, tem que ser mantido em mente que explantes de retina é um modelo ex vivo. Como tal, os danos incorridos durante o processo de isolamento e / ou condições de cultura pode afetar processos celulares. Além disso, o próprio procedimento de imagiologia podem exercer efeitos tóxicos que podem influenciar o comportamento celular 23, 32. Embora existam disadvantages a viver de células de imagem de culturas da retina, é atualmente o nosso melhor método para obter informação dinâmica de INM. Mais importante, o procedimento de processamento de imagem de células vivas de explantes de retina será aplicável a outras perguntas biológicas durante a regeneração da retina. Com base em dados imunocitoquímicos, foi sugerido anteriormente que a glia Müller fagocitam morrendo fotorreceptores / detritos seguintes danos fotorreceptor induzida pela luz 33. Ajustando os parâmetros de imagem este processo ao vivo vai verificar se a fagocitose de fotorreceptores morrem ocorre na retina de peixe-zebra e regeneração podem ser usadas para estudar os mecanismos subjacentes. Tendo mostrado que as imagens podem ser adquiridos ao nível dos núcleos da haste e haste segmentos internos em Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] zebrafish nt19, deve ser viável para ajustar as condições para a fagocitose imagem de fotorreceptores. Da mesma forma, o conhecimento é limitado sobre o comportamento dinâmico da microglia e os mecanismos que regem a suafunção na degeneração e regeneração retina 34, 35. Explorando peixes-zebra transgénicos específicos da microglia, em conjunto com imagiologia de células vivo também vai aumentar a nossa compreensão da função da microglia no adulto regeneração retina de peixe-zebra 36, 37. Para resumir, processamento de imagem de células vivas de explantes de retina é uma ferramenta poderosa para ganhar informação dinâmica de processos celulares e para determinar o comportamento e função dos diferentes tipos de células na retina regeneração.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos o apoio fornecido por William Archer e do Mecanismo de Notre Dame Integrado Imaging. Agradecimentos especiais são direcionados para os técnicos Freimann Ciências Biológicas por sua ajuda contínua e seus cuidados e criação de peixe-zebra. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Eye Institute dos NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) eo Centro de Zebrafish Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

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References

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Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

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