Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Abstract

Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.

Introduction

A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar 5 y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tipos que murieron 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa de la respuesta de la regeneración, los núcleos de las células de Müller y sus células progenitoras neuronales derivadas se someten a un patrón migratorio repetitivo en fase con el ciclo celular (interkinetic migración Nuclear, INM) 6 > 7. Los núcleos posicionado en la INL basal replicar su ADN antes de migrar a la capa exterior Nuclear (ONL) donde se dividen antes de que surjan los núcleos vuelven basalmente a la INL. Este proceso fue descrito por primera vez durante el desarrollo neuroepitelial utilizando métodos histológicos, mientras que los enfoques de formación de imágenes de células vivas después confirmaron la interpretación por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambos enfoques de imagen histoquímicos y de células vivas se han utilizado para determinar los mecanismos INM y su función en el desarrollo de la retina incluyendo neuroepithelia 9, 11, 12, 13 subyacentes. Sin embargo, los mecanismos que regulan INM en el adulto regeneración de retina no han sido estudiados en mayor detallexref "> 6, 7. Células vivas imágenes será una forma muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que controlan el INM en la retina adulta regeneración.

Hasta hace poco tiempo, imágenes de células vivas del INM en la retina se limita a cualquiera de embriones de pez cebra en vivo o embriones de pollo o postnatal ratón explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mientras que los explantes de retina de animales adultos de una variedad de especies, incluyendo ratones, ratas y pez cebra han sido utilizados para diferentes enfoques biológicos celular 17, 18, 19, 20, experimentos de imágenes de células vivas utilizando explantes de retina jahan estado restringidos a breves períodos de tiempo y no han sido ejecutados de forma continua durante varias horas 21, 22. A continuación, describimos un protocolo detallado para la cultura retinas de pez cebra adultos de luz dañadas para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas monitoreo INM usando microscopía multifotónica 6. Enfoques imágenes de células vivas son ventajosas respecto a los métodos inmunohistoquímicos en la investigación de los mecanismos que controlan el INM, como la dinámica del INM, por ejemplo, las velocidades pueden verse afectados en lugar de la ubicación de la mitosis, lo que potencialmente no ser detectado mediante inmunocitoquímica.

En el futuro, este método tiene también el potencial de ser modificado para estudiar otros procesos dinámicos durante la regeneración de la retina, tales como fagocitosis de morir fotorreceptores por las células de Müller o el comportamiento de microglia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: El pez cebra fueron criados y mantenidos en las instalaciones de Notre Dame de pez cebra en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito son aprobados por la Universidad de Notre Dame Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están en conformidad con la declaración para el uso de animales en investigación de la visión por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología.

1. Soluciones

  1. Preparar 70% de etanol para esterilizar la campana de cultivo de tejido y cualquier equipo / reactivos que se transfieren en la campana de cultivo de tejido.
  2. Añadir 2 ml de 2-fenoxietanol a 1 L de agua del sistema (1: 500 2-fenoxietanol).
  3. Preparar 0,1 mM de NaHCO3, pH 8,0. Utilice una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de tamaño de poro 0,2 micras para esterilizar la solución en una campana de cultivo de tejidos esterilizada.
    NOTA: NaHCO 3 se usa para difundir de manera eficiente el adhesivo de células y tejidos a través de la superficie de cubreobjetos de fluorodishes (verpaso 3.2).
  4. Preparar 1,0 M CaCl 2 y 1,0 M MgCl 2. Esterilizar con una jeringa de 10 ml y filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,2 micras en una campana de cultivo de tejidos esterilizada.
  5. Para preparar la Solución de sal de Hank equilibrada (HBSS), añadir estéril CaCl 2 y estéril MgCl 2 en 1X HBSS sin Ca 2 + / Mg2 +, sin rojo fenol a una concentración final de 1 mM cada uno. Trabajar en un ambiente estéril.
  6. Para preparar el medio de cultivo, se mezcla 50% 1x medio esencial mínimo (MEM) sin rojo de fenol, 25% HBSS que contiene CaCl 2 y MgCl 2 (ver sección 1.4), 25% suero de caballo (HS), 10 unidades / ml de penicilina, y 10 g de estreptomicina / ml. Trabajar en un ambiente estéril.
    NOTA: Evitar el medio que contiene rojo fenol, ya que autofluoresces, lo que afecta la señal a ruido. 23
  7. Preparar 10 ml de 1% agarosa de bajo punto de fusión en 1x MEM sin rojo fenol. Derretir agarosa / 1x MEM usando un microWCra. Preparar pequeños volúmenes de agarosa (por ejemplo, 10 ml) como recalentamiento repetitivo va a cambiar las concentraciones de iones debido a la evaporación de líquidos.
  8. Antes del cultivo, esterilizar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en autoclave.

Paradigma 2. Luz-daños

  1. Dark-adaptación
    1. Colocar 2 - 3 Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 (u otro pez cebra transgénico de interés) a los 6 - 14 meses de edad en un ambiente desprovisto de luz por 14 días. Para más detalles, véase la referencia 2, 6, 24, 25.
  2. Coloque el tanque que contiene 2 - 3 pez cebra transgénico adaptada a la oscuridad en el agua del sistema entre dos lámparas fluorescentes que emiten luz de 2.800 lux 2, 6, 24, 25. Exponer el pez cebra a una luz intensa constante durante 35 h. Durante la exposición a la luz, asegurar que se mantiene la temperatura del agua entre el 31 - 33 ° C.

3. Preparación para el cultivo (En el Día de aislamiento de la retina)

  1. El uso de 70% de etanol, esterilizar la campana de cultivo de tejido y los componentes / herramientas que se transfieren en la campana de cultivo de tejido (por ejemplo, matraces que contenían MEM y HBSS, pipetas, puntas de pipeta estériles, etc.).
  2. Preparación de fluorodishes
    1. Cubra un fluorodish para cada retina con células y adhesivo tisular (véase la Tabla de Materiales).
    2. Diluir el adhesivo de células y tejidos en 0,1 mM NaHCO 3 a una concentración final de 70 mg / ml, se añaden 50 l a cada fluorodish y extender la solución en el centro de la fluorodish con una punta de pipeta 200 l (aproximadamente 1 - diámetro 1,2 cm ).
    3. Se incuban las fluorodishes recubiertas por 1 - 3 horas a RT; (Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C).
    4. Retire la solución y enjuagar 3 veces con 500 l de 1x MEM para cada lavado. Para evitar los fluorodishes recubiertos se sequen, mantenerlas en MEM hasta explantes de retina están montados.
  3. Preparar medio de cultivo como se describe en el paso 1.6. El medio de cultivo se puede almacenar durante un máximo de 1 semana a 4 ° C.

4. Aislamiento y cultivo de explantes de retina

NOTA: El protocolo descrito a continuación es para el aislamiento de la retina dorsal, que es la región de la retina que es predominantemente lesionada por el paradigma-daño de la luz descrito. Por lo tanto, la proliferación inducida por el daño y el evento asociado de la migración nuclear interkinetic se producen en la retina dorsal. Sin embargo, el procedimiento de aislamiento se puede ajustar para producir regiones de la retina de acuerdo con los requisitos específicos de la pregunta investigador / investigación.

  1. La eutanasia a una sola luz dañado transgénico pez cebra unatiempo de ta en 1: 500 2-fenoxietanol.
  2. Retire MEM de una fluorodish con una pipeta 1.000 l de modo que sólo una fina capa de líquido permanece.
  3. Transferir el pez cebra en una toalla de papel seca, retire el ojo con un par de fórceps curvado Dumont (fórceps nº 5, ángulo de 45 °) y transferirlo a la fluorodish.
  4. El uso de un microscopio estereoscópico, orientar el ojo con la pupila en la hoja de la cubierta de la fluorodish de modo que la parte posterior del ojo con el nervio óptico es visible (Figura 1D).
  5. Con un par de tijeras McPherson-Vannas eliminar el nervio óptico, el corte cerca de la parte posterior del ojo. Además, eliminar el tejido conjuntivo que recubre el exterior del ojo.
  6. Mantenga el ojo entre su nasal y el lado temporal con un par de # 5 fórceps mientras que hacer una incisión en el tallo óptico por la perforación con una hoja de tijera a través de la lámina cribosa y corte a lo largo tanto de la nasal y los lados temporales del ojo (véase la Figura 1E , li segmentadonordeste).
  7. El uso de dos pares de pinzas # 5, uno para la celebración de la cara dorsal de la retina y el otro par para separar la ventral de la retina dorsal, tire del tejido.
    NOTA: Es recomendable orientar la retina dorsal para que la lente y la capa de células ganglionares de la cara del cubreobjetos, mientras que la esclerótica se enfrenta hacia arriba.
  8. Eliminar la esclerótica de la retina dorsal con un par de fórceps # 5, mientras se mantiene la lente que está conectado a la retina con un segundo par de pinzas # 5 (Figura 1H, I).
  9. Para extraer el objetivo, utilizar tijeras McPherson-Vannas y corte detrás de la lente sin dañar la retina (Figura 1I, J). A veces, la lente se separa en el paso 4.7. En este caso, retire la esclerótica cuidadosamente con unas pinzas mediante la celebración de la retina en un borde cortado con un segundo par de fórceps # 5.
  10. Retire el vítreo mientras se quita la lente sin dañar la retina. Aplanar la retina con la capa de células ganglionares frente a la hoja de la cubiertade la fluorodish (Figura 1L, M).
  11. Rodear la retina con 10 l de 1% de agarosa de bajo punto de fusión y dejar que la agarosa solidifique.
  12. Ver que la agarosa líquido no levanta la retina ya que incluso una ligera elevación podría afectar a la capacidad de concentrarse profundamente en el tejido. Si se observa elevación, utilizar una pipeta para eliminar de agarosa. Deje conjunto de agarosa residual antes de intentar añadir más.
  13. Repita el paso 4.12 varias veces antes de la adición de 1% de agarosa de bajo punto de fusión para cubrir toda la fluorodish. Una vez que la agarosa se ha solidificado, añadir 1,5 ml de medio de cultivo.
  14. Mantener el cultivo de explantes de retina en un ambiente de aire / 5% de CO 2 fijado en 32 ° C durante aproximadamente 12 h para permitir la retina para alejarse de los problemas que haya incurrido el procedimiento de aislamiento. Ajuste la temperatura a 32 ° C para mantener las retinas a la misma temperatura que el pez cebra-ligero tratado (véase el paso 2.3).

5. Multifotónica Microscopía

Tabla de Materiales), un 40X Apo larga distancia objetivo de inmersión en agua (NA 1,15), un escáner de galvanómetro y una cámara ambiental que contiene una inserción para cuatro 35 mm placas de Petri. Las imágenes fueron adquiridas con un detector no descanned (R-NDD).

  1. Antes de la formación de imágenes, equilibrar la cámara ambiental para lograr una atmósfera de aire / 5% de CO 2. Asegúrese de que los platos vacíos de Petri se insertan en el soporte para evitar las fugas de gas en la habitación.
  2. Encienda el sistema de microscopía.
  3. Una vez que se equilibra la cámara ambiental, añadir líquido de índice de refracción en la larga distancia objetivo de inmersión en agua 40X Apo (NA 1.15).
    NOTA: El líquido de índice de refracción con propiedades ópticas similares al agua se utiliza para evitar la evaporación de agua durante la formación de imágenes a largo plazo.
  4. Coloque la gripeorodishes con explantes de retina en la cámara. Usando la luz de campo claro, la posición de la muestra en el camino de la luz y traer la región media de la retina dorsal en el plano de enfoque.
  5. Utilice la luz de epifluorescencia GFP para centrarse en GFA: nGFP -positivo Müller glia núcleos (Figura 2 A, C).
    NOTA: Si explantes no están montados plana o agarosa acumulado bajo el explante, será difícil de enfocar sobre la GFAP: nGFP núcleos -positivos o que será fluorescente débilmente.
    1. Compruebe si se mueve a una región diferente dentro del mismo explante retina va a superar el problema de enfoque. De lo contrario pasar a un explante de la retina diferente.
  6. En el software de adquisición de imágenes, abra el 'A1 MP interfaz gráfica de usuario ", el" TiPad ", el" A1 compacto GUI' 'y las ventanas de adquisición de ND. Para imágenes multifotónica, asegúrese de que la opción "IR DDN 'se elige en el' A1 compacto GUI '.
  7. En el 'Ajustescampo de g ', seleccionar IR-DM para el espejo dicroico 1ª y elegir el filtro de paso de banda de 525/50 para la adquisición de fluorescencia de GFP.
  8. Encienda el láser de IR en la ventana con la etiqueta 'A1MP interfaz gráfica de usuario'. Tomará unos minutos para que el láser esté listo. Establecer la longitud de onda de 910 nm para excitar la fluorescencia de GFP y alinear el láser haciendo clic en el botón de 'alineamiento automático' en la ventana 'A1 MP interfaz gráfica de usuario'.
  9. Asegúrese de que salas y equipos luces se apagan o cubiertos antes de abrir el obturador en el 'A1 MP GUI' para evitar la sobreexposición del tubo fotomultiplicador. Para reducir los niveles de ruido, albergará el microscopio en un ambiente oscuro.
  10. Adquirir imágenes de un campo de visión de 300 x 300 píxeles, en un zoom de dos, y un tiempo de permanencia de píxel de 4,8 mu s / pixel. Aproximadamente configurar la potencia del láser, cambiando la «zona de adquisición" en el "A1MP interfaz gráfica de usuario" y la ganancia en la ventana 'A1 compacto GUI'.
  11. Configuración de la z-stack
    1. Se centran en la capa de células ganglionares para definir el plano focal de la parte superior de la pila Z en el 'Z' subventana dentro de la "ventana de adquisición ND '. Algunos GFAP: células positivas nGFP se encuentran normalmente en la capa de células ganglionares, lo que ayuda a identificar el límite basal de la retina (Figura 2A, D).
    2. Mover el plano focal a través del nivel de la ONL (Figura 2A, B), que se caracteriza por la presencia de GFAP débilmente marcado: células positivas nGFP que están alrededor y ampliada con relación a sus homólogos de la INL (Figura 2A, C) .
    3. Ajuste este plano que la parte inferior de la pila Z. Asegúrese de que toda la ONL serán fotografiadas (Figura 2A, B).
    4. Al experimentar los cambios de plano focal que requieren re-ajuste durante el período de formación de imágenes, haga doble clic en la posición media en la subventana 'z' para asignarlo como la posición de "casa". Cambiar a 'modo simétrico definido'y haga clic en "relativo".
    5. Establecer el tamaño z paso entre 0,7 a la 1 micra.
  12. corrección Z-intensidad:
    1. Aplicar correcciones z intensidad para compensar la pérdida de intensidad de los píxeles debido a la dispersión de la luz cuando se generan imágenes en capas profundas de los tejidos.
    2. Para configurar la corrección, abra la ventana de "corrección z intensidad". Para establecer el 'rango z-stack', seleccione 'De Dakota del Norte'.
    3. Haga clic en el plano focal de fondo en la ventana 'z intensidad de corrección' (en este caso, corresponde a la capa de células ganglionares) y ajustar la intensidad del láser ( "área de adquisición" en el "A1MP GUI ') y la ganancia (GUI compacto A1 ).
    4. Haga clic en la flecha al lado de los "valores z 'en la ventana' corrección z intensidad" para confirmar los ajustes que se muestran posteriormente en virtud de la configuración del dispositivo '' en la ventana 'corrección z intensidad "para el plano focal elegida.
    5. Repita el proceso para la media de unaplanos superiores nd, aumentando la potencia del láser y la ganancia. planos focales adicionales se pueden añadir en caso necesario. Véase la Tabla 1 para los ajustes de ganancia de láser y específicos para los experimentos de las figuras 2 - 4.
    6. Establecer la "zona de adquisición 'en la ventana' A1 MP interfaz gráfica de usuario '. Evitar la selección de un área de adquisición mayor que 15 y una ganancia mayor que 126 en el inicio de formación de imágenes para eludir photobleaching y el aumento de los niveles de ruido.
      NOTA: Como el láser y tubos fotomultiplicadores difieren entre los sistemas de microscopía láser, pruebas y ajustes de ganancia para obtener condiciones óptimas de imagen para el microscopio configurar evitando al mismo tiempo photobleaching.
    7. Elija 'corrección de intensidad relativa' en la ventana 'corrección z intensidad ".
  13. En la subventana '' series de tiempo en la ventana de 'adquisición ND', establecer la duración de 8 horas y el intervalo de 'sin demora'. A continuación, asegúrese de hacer clic en el 'Ejecutar z-corrección' en tél ventana secundaria 'z-stack' en el botón de la ventana 'adquisición ND' para adquirir las series de tiempo de 3-D.
  14. Mantener explantes de retina a una temperatura de 27-29 ° C durante toda la duración de adquisición de imágenes.
  15. Durante todo el período de adquisición de imágenes, si es necesario, vuelva a ajustar el nivel de potencia y la ganancia con el fin de mantener la calidad de la imagen para el análisis post-imágenes. Para los ajustes de realizar los pasos 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Si los cambios de plano focal, pausar o detener la ejecución y realizar el paso 5.11 de nuevo.
    NOTA: Si se eligió 'relativa z-corrección' en el paso 5.12.7 y 5.11.4 se llevó a cabo el paso no debería ser necesario volver a ajustar los niveles de potencia y ganancia, a menos que se produjo extensa photobleaching.

6. Análisis de la velocidad

  1. Extraer el tiempo, el establecimiento de una región de interés en la imagen. Utilice la herramienta de 'tiempo de medición' y exportar los valores de tiempo a una hoja de cálculo.
  2. Recortar una región que contiene un diViding GFA: nGFP núcleo -positivo.
  3. Elige la región recortada de manera que contiene al menos un núcleo que no experimentan INM con el fin de establecer un punto de referencia para medir posteriormente las distancias que el núcleo divisoria emigraron en relación con la INL basal. NOTA: Para seleccionar un núcleo que permanece en el INL basal, que ayuda a preparar una reconstrucción en 3-D de las series de tiempo.
  4. Alternativamente, si un GFAP: se observa celular -positivo nGFP en el ONL durante todo el período de adquisición, utilice una línea vertical de longitud fija que abarca desde el núcleo ONL a la INL basal con el fin de identificar un punto de referencia.
  5. Uso de la función "Mostrar divisiones vista ', generar proyecciones ortogonales. Posteriormente, cambiar el modo de "rebanada" a la "proyección de intensidad máxima".
  6. Desactivar la vista de 'xy' de la máxima proyección ortogonal. Dependiendo de la orientación en la que la migración / núcleo dividiendo es mejor visible, unalso apagar bien el 'xz'- o la "visión yz'.
  7. Haga clic en la imagen restante con el botón derecho del ratón y extraer el "serie yz'-imagen con el '' xz 'o la función Crear nuevo documento desde este punto de vista'. Si es necesario, gire la imagen.
  8. Uso de la función "medición manual ', dibujar una línea horizontal a través de la imagen en el nivel inferior del núcleo que permanece en el INL basal y no sufre INM (= punto de referencia; Figura 4A - E, rojo línea horizontal).
  9. Medir la distancia entre la línea de referencia y el punto del núcleo de migración de las series de tiempo utilizando la herramienta de 'medición de línea "en el software de análisis (ver Figura 4A - E) basal.
  10. Una vez que la envoltura nuclear se rompe, medir la posición basal del soma si es identificable a raíz de la difusión de GFP en la célula entera.
  11. El uso de un software de hoja de cálculo, trazar la distancia de un nucleus migró contra el paso del tiempo (Figura 4F).
    1. Para determinar la velocidad de migración apical (a v), gráfico de las distancias recorridas por el período antes de rotura de la envuelta nuclear se produce (Figura 4G).
    2. Seleccione la serie de datos en el gráfico, haga clic con el ratón e insertar una curva de regresión lineal que incluye "y = mx + c 'la función correspondiente. La pendiente "m" en la función representa la velocidad, v un (Figura 4G).
    3. Repita los pasos 6.11.1 y 6.11.2 para la primera fase de la migración basal rápida para determinar la velocidad de migración basal, v b (Figura 4H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El aislamiento de la retina de acuerdo con el procedimiento descrito en el esquema de la Figura 1 permite que el cultivo de una retina dorsal aplanado de adulto-luz dañado Tg [GFAP: nGFP] mi2004 pez cebra durante un período de al menos 24 h en un 5% de CO 2 / ambiente de aire. Estos explantes de retina montados en plano-se pueden utilizar para planos focales de imagen a nivel de tejidos profundos. Un ejemplo es las células de Müller / núcleos neuronales de células progenitoras marcadas con GFP a partir del promotor GFAP (proteína ácida glial fibrilar)-glía específica Müller que se encuentran en las ONL durante la mitosis en la retina la luz dañada (Figuras 2A - D, 3). Para confirmar aún más que este enfoque es aplicable a la imagen de las diversas capas de células de la retina, los explantes de retina agudamente aisladas se prepararon a partir daños Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] ojos de pez cebra nt19 que expresan EGFP en fotorreceptores de los bastones bajoel promotor de la rodopsina. Figura 2E - H muestra que es posible adquirir imágenes de los fotorreceptores de varilla GFP-positivas y sus segmentos interiores. Como segmentos interiores de la barra se extienden entre los conos hacia el epitelio pigmentario de la retina, estos datos implicaría que también es posible fotorreceptores imagen de cono. Este fue sin embargo no investigarse más a fondo.

Tener núcleos observados células de Müller / neuronales de células progenitoras en la ONL en la retina dañada-luz, que caracteriza su comportamiento migratorio en detalle (Figura 3 y Película 1). Las células de Müller núcleos de las células progenitoras neuronales / etiquetados por GFP migran bidireccionalmente entre la posición basal de la INL donde normalmente residen y la ONL, el sitio de la pérdida de fotorreceptores. Por lo general, GFA: nGFP núcleos -positivos emigró a poca distancia de la INL (Figura 3A - C) antes de que se sometieronrotura de la envuelta nuclear, mientras que todavía posicionado en la INL, basado en la redistribución de la GFP en el citoplasma de la / célula progenitora neuronal toda células de Müller (Figura 3D). Después de la división celular en la ONL, dos GFAP: nGFP núcleos -positivas se hizo visible en el ONL (Figura 3F, G) que volvió a la INL basal (Figura 3H - J). Tras la división celular, los núcleos recién derivados fueron inicialmente muy tenue y por lo tanto difíciles de identificar (Figura 3G). Sin embargo, en uno o dos marcos de tiempo después de la mitosis, la fluorescencia de GFP nuclear se convirtió en brillante, lo que permitió la visualización de la migración nuclear (Figura 3H - J). Imágenes de células vivas también permitió la visualización del plano de división (Figura 3F, G), que se produjo en horizontal a la superficie apical de la retina para la celda mostrada en la Figura 3. También es factible el uso de otras líneas de pez cebra transgénico talescomo la Tg [GFAP: EGFP] pez cebra NT11 que expresan GFP en el citoplasma (datos no mostrados). Aunque es posible determinar de forma fiable el movimiento apical y divisiones celulares horizontales, a menudo es difícil de identificar exactamente la posición de los núcleos hijos basalmente que migran y divisiones celulares verticales en la Tg [GFAP: EGFP] NT11 pez cebra retina (datos no mostrados).

Para determinar la velocidad, un GFAP: nGFP núcleo -positivo que no migran a lo largo del período de registro fue elegida como punto de referencia (estrella, la Figura 4A - E). La distancia del núcleo de migración (línea roja vertical, Figura 4A - E) se determinó en relación con el GFAP referencia: nGFP núcleo -positivo (línea roja horizontal, Figura 4A - E) en cada punto de tiempo de la serie de imágenes de máxima o xz YZ-proyecciones (dependiendo en la que los núcleos ángulo podrían ser visualizeta más eficiente). La distancia que migra el núcleo se representó gráficamente frente al tiempo en una hoja de cálculo (Figura 4F - H). ruptura de la membrana nuclear se observa a menudo en la gráfica como un movimiento inicial basalward debido a la re-distribución de GFP en la célula entera (basal mayor parte del cuerpo de la célula en este caso). La velocidad apical se determinó antes de rotura de la envuelta nuclear, ajustando una curva de regresión lineal (línea gris de puntos, figura 4G) a la distancia representada frente al tiempo para el período anterior a la envoltura nuclear desglose (diamante rojo, Figura 4G). La pendiente "m" de la curva de regresión lineal (y = mx + c) representa la velocidad 'dx / dt'. La velocidad apical de la célula presenta en la Figura 4 fue 10,89 m / h. Se aplicó el mismo método para calcular la velocidad del movimiento basal inicial rápida (v b) de los núcleos hija recién formado (Figura 4F, H). La migración basal velocidades v b de -67,71 y 33,51 micras / h de células hijas que D1 y D2, respectivamente, eran comparativamente más rápido que la velocidad apical. Desgraciadamente, no fue posible determinar la velocidad apical después de rotura de la envuelta nuclear como la GFP difusa a través de toda la célula. En cambio, la velocidad instantánea se calcula en función del tiempo y la posición del núcleo antes de rotura de la envuelta nuclear y la primera visualización de los núcleos hijos recién formadas. La velocidad instantánea de 7,9 m / h para la celda mostrada en la Figura 4 es probable una subestimación como el de la cromatina alcanza la ONL antes de la telofase de la mitosis, cuando los núcleos hijos se hacen visibles.

En resumen, el cultivo de los explantes de retina permite imágenes de células vivas del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra y la determinación de la migración y la división celular paparáme- de núcleos individuales.

Figura 1
Figura 1: Procedimiento de aislamiento de la retina. A) Esquema que ilustra una cabeza de pez cebra con su ojo. B) El ojo se retira del pez cebra y orientado para mostrar la parte frontal del ojo con la pupila. C) Girar el ojo 180 °, de modo que la parte posterior del ojo con el tallo óptico (lleno círculo negro) se hace visible en (D) y la pupila esté orientada hacia abajo. El color gris indica la presencia de la esclerótica del ojo. E) Una hoja de un par de tijeras McPherson-Vannas se inserta en el tallo óptico del ojo (lleno círculo negro) para cortarlo en su dorsal y ventral que se indica por la línea segmentada blanco. F) media dorsal del ojo después se retiró el medio ventral. El medio círculo negro indica tque parte residual del tallo óptico. G) Girar el ojo 90 ° hacia atrás para revelar (H) en el interior del ojo con la retina (marrón), vítreo (no se muestra) y la lente (L, círculo gris claro) que todavía está encerrado por la esclerótica (línea gris ). I) La esclerótica se separó (nota, línea gris que falta) y J) de la lente y el vítreo eliminó, para dar lugar a solamente la retina (marrón). K) Retina volvió 90 ° dando hacia delante lugar a una vista plana de montaje de la retina dorsal (L). M) dorsal explante retina-montado de plano sobre una fluorodish con fondo de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: 3-D Reconstrucción deRetina Multifotónica Z-pilas. A) reconstrucción en 3-D de una pila Z serie de imágenes multifotónica de GFA: nGFP- células positivas en la retina culturas de todo el montaje de pez cebra después de 48 horas de luz-daño. Células positivas nGFP que aparecen en la reconstrucción 3D en (A) en el nivel de la ONL (B), la INL (C), que corresponde a la capa que contiene Müller: D) multiphoton individual xy imágenes de GFAP - B soma glía y la CGT (D). Flecha en (B) indica una ronda ampliada células de Müller en el ONL después de rotura de la envuelta nuclear. E) la reconstrucción 3-D de un z-stack serie imagen multifotónica de un explante de la retina de un buen estado Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] pez cebra nt19. F - H) multifotónica individual xy imágenes a nivel de los segmentos de varilla interior (RIS, F), barra de capa nuclear (G) Y en el nivel de la retina interior (H). GCL, Ganglio capa de células; INL, Inner capa nuclear; ONL, la capa externa nuclear; RIS, Segmento de barra interior. La barra de escala en A, D, E y H, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Timelapse imágenes Series del INM. A - J) Serie de la imagen de la reconstrucción 3D de la serie Timelapse z-pila se presentan Tg [GFA: nGFP] mi2004 núcleos -positivos que se someten INM dividir en las ONL en explantes de retina (fila superior). La posición de un núcleo apicalmente migración y su basalmente migración de núcleos hija se indica mediante flechas rojas. estrella roja indica rotura de la envuelta nuclear durante la mitosis. A - J, fila inferior) Lamisma serie de imágenes como en la fila superior era sobresaturado y se recorta para centrarse en las células que se dividen en las ONL. INL, Inner capa nuclear; IPL, plexiforme interna de la capa; ONL, la capa externa nuclear. La barra de escala en A, 10 micras y es el mismo para B - J. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Análisis de apical y basal velocidades de migración. A - E) yz máxima proyección de una serie de imágenes z-pila de Tg [GFA: nGFP] mi2004 explantes de retina en diferentes puntos de tiempo de la grabación Timelapse adquirida por microscopía multifotónica. Usando la herramienta de línea bajo la función "medición manual ', una línea horizontal se coloca a la altura de la celda de referencia, indicado por una estrella. A mí verticalesasurement línea se posicionó empezando en la línea horizontal y se extiende hasta la posición basal de la GFA migración: nGFP núcleo -positivo. La longitud de la línea de medición se da en las cajas blancas en las imágenes y para facilitar la lectura bajo las imágenes. L1 = longitud que célula hija 1 migra; L2 = longitud de esa célula hija de 2 a migrar. F) Distancia que la célula (F0) medida en (A - E) migra apicalmente y que las células hijas resultantes D1 y D2 migraron basalmente en la grabación multifotónica timelapse. La línea roja indica las mediciones de los cuales se calculó la velocidad de migración apical (v a), mientras que las líneas negras y grises indican las medidas utilizadas para calcular las velocidades de migración basal (v b) para D1 y D2, respectivamente. G, H) La distancia se representó gráficamente frente al tiempo en Excel para la migración apical antes de rotura de la envuelta nuclear (G) y la fase de rápida basalla migración de las células hijas D1 (H). curvas de regresión lineal fueron equipados y las funciones se dan a continuación los gráficos con la pendiente representa la velocidad. INL, Inner capa nuclear; IPL, capa plexiforme interna; ONL, la capa externa nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tg [GFA: EGFP] NT11 Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19
potencia del láser ganancia potencia del láser ganancia
Top (fotorreceptores de varilla) 13 126 3.5 118 Medio (las células de Müller) 10 126 2.8 118
Parte inferior (GCL) 8 126 2.1 118

Tabla 1: Niveles láser y la ganancia utilizada para Z-Intensidad correcciones en los diferentes planos para experimentos mostrados en las figuras 2 - 4.

Figura 2
Película 1: Células vivas imágenes de la retina explantes por microscopía multifotónica. (Haga clic derecho para descargar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los estudios que investigan los mecanismos que regulan la regeneración de la retina del pez cebra adulto dañado fundamentalmente métodos usados inmuno 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El establecimiento de las condiciones de cultivo de explantes de retina a y para realizar imágenes de células vivas en los fenómenos, tales como el INM, nos proporciona una técnica para obtener en profundidad espacial y la información temporal. Esta técnica permite determinar las velocidades de migración, el tiempo y la posición de la rotura de la envuelta nuclear durante la profase de la mitosis y la longitud y la posición de la división celular. Además, es posible establecer el plano de división y el destino de las células hijas que se plantean en cuanto a su ubicación posterior. En última instancia, este enfoque poderoso determinará si M2; glia ller y células progenitoras neuronales se comportan de manera diferente en lo que respecta a INM durante la regeneración de la retina. El uso de líneas de pez cebra transgénico que identifican las células que proliferan en la retina en la regeneración de las distintas etapas de la respuesta regeneración ayudará a descifrar comportamiento diferencial 6. En el caso del microscopio multifotónica se utiliza aquí, GFP reportero líneas de pez cebra se prefieren como excitación de proteína roja fluorescente (RFP) no es muy eficiente; Sin embargo, otros sistemas de excitación multifotónica pueden permitir eficiente de RFP o fluoróforos equivalentes.

Uno de los pasos más críticos en el proceso de aislamiento de la retina una creciente de la retina. Retinas tienen que ser montado lo más plana posible para que la luz multifotónica para poder pasar a los más profundos niveles Z de la ONL. Curvatura de la retina sobre todo en la región marginal, vítreo residual, y / o acumulación de agarosa bajo la cultura de la retina, que se utiliza para inmovilizar eltejido, introducir más comúnmente espacio adicional entre la hoja de la cubierta y la cultura de la retina. Además, el aumento de la potencia del láser y la ganancia tienen que ser utilizados para adquirir imágenes si la retina no es plano y en consecuencia, esto hará que el aumento de photobleaching y reducción de la viabilidad del cultivo de la retina. Incorrecta de montaje menudo también se traduce en una menor calidad de imagen debido a la penetración de la luz reducida y afectará a la capacidad de medir las distancias que los núcleos habían emigrado y por lo tanto el cálculo de las velocidades de migración.

Las velocidades de migración apical antes de rotura de la envuelta nuclear y de la migración basal se pueden determinar de forma fiable en una serie de imágenes de Tg [GFAP: nGFP] mi2004 explantes de retina de pez cebra. Sin embargo, en este momento no es posible determinar la velocidad de la migración apical de la cromatina después de rotura de la envuelta nuclear en esta línea pez cebra transgénico como las GFP re-distribuye a través de todo el citoplasma. Labeling de explantes de retina con el colorante nuclear Hoechst dio como resultado la captación de dim en núcleos de células de Müller que requerían el cambio en la longitud de onda a 830 nm (Lahne & Hyde, datos no publicados), lo que afectó a la viabilidad del tejido y causó estancamiento del ciclo celular ( Lahne & Hyde, datos no publicados). Durante el desarrollo de la retina, Tg [h2afva: h2afva-GFP] pez cebra kca6 que expresan GFP fusionado a la histona 2 se han utilizado con éxito para controlar INM y determinar velocidades de migración en las diferentes etapas del ciclo celular 12, 31. En el futuro, los explantes de retina de Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 pez cebra también permitirán la visualización de la cromatina a través del ciclo celular y permiten el análisis de la velocidad de migración apical después de ruptura de la membrana nuclear en el adulto regeneración de retina de pez cebra.

Después de haber establecido las condiciones para monitorear por el INMimágenes de células vivas en explantes de retina del pez cebra adulto-luz dañado y el correspondiente análisis de las velocidades será la base para investigar los mecanismos que rigen el INM. Algunos estudios comenzaron a examinar los mecanismos de INM en el adulto regeneración de retina utilizando inmunocitoquímica para determinar la posición de mitótico fosfo-histona núcleos 3-positivas 6, 7. Sin embargo, lo que interfiere con las vías de señalización no puede hacer que la posición de la mitosis, pero puede afectar a otros parámetros tales como la velocidad, el momento de la mitosis y la división que no sería posible / muy difícil discernir por inmunocitoquímica. Anteriormente, se ha demostrado que los núcleos mitóticos fosfo-histona 3-positivos mislocalized a posiciones más basales en la retina en desarrollo en los mutantes dynactin y morphants 11. Sin embargo, imágenes de células vivas posterior reveló que la migración nuclear antes de la división celular se retrasó en la celda dynactin-comprometidoss, mientras que un aumento de la velocidad de migración apical activar núcleos de alcanzar y para someterse a la división celular en la superficie apical 11, 12. Este ejemplo ilustra el poder de imágenes de células vivas. Del mismo modo, cuando desentrañar los mecanismos que facilitan el INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra, los estudios de imágenes de células vivas se complementan, y en varios casos será ventajoso con respecto a los enfoques de inmuno.

Como se discutió anteriormente, imágenes de células vivas ofrece muchas ventajas sobre los métodos inmunohistoquímicos / estáticas; sin embargo, se tiene que tener en cuenta que los explantes de retina son un modelo ex vivo. Como tal, el daño incurrido durante el procedimiento de aislamiento y / o condiciones de cultivo pueden afectar los procesos celulares. Además, el procedimiento de imágenes en sí puede ejercer efectos tóxicos que pueden influir en el comportamiento celular 23, 32. Si bien hay disadvantages a vivir de células de imagen de las culturas de la retina, que es actualmente nuestro mejor método para obtener información dinámica del INM. Es importante destacar que el procedimiento de formación de imágenes en vivo de células de explantes de retina será aplicable a otras cuestiones biológicas durante la regeneración de la retina. Con base en los datos inmunocitoquímicos, se sugirió previamente que fagocitan las células de Müller morir fotorreceptores / escombros después del daño inducido por la luz de los fotorreceptores-33. Ajuste de parámetros a la imagen este proceso vivo verificará si la fagocitosis de los fotorreceptores que mueren se produce en la retina del pez cebra de regeneración y se puede utilizar para estudiar los mecanismos subyacentes. Habiendo demostrado que las imágenes pueden ser adquiridas en el nivel de los núcleos de varilla y los segmentos internos de la barra en Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] pez cebra nt19, debería ser posible ajustar las condiciones a la fagocitosis imagen fotorreceptor. Del mismo modo, el conocimiento es limitada en relación con el comportamiento dinámico de la microglía y los mecanismos que regulan sufunción en la degeneración y la regeneración de la retina 34, 35. Explotación de pez cebra transgénico-microglia específico en combinación con imágenes de células vivas también aumentará la comprensión de la función de la microglia en el adulto regeneración retina de pez cebra 36, 37. En resumen, imágenes de células vivas de explantes de retina es una poderosa herramienta para obtener información dinámica de procesos celulares y para determinar el comportamiento y la función de los diferentes tipos de células en la retina regeneración.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos el apoyo proporcionado por William Archer y el Servicio Integrado de Notre Dame de imagen. Gracias especiales se dirigen a los técnicos Freimann Ciencias de la Vida por su continua ayuda y su cuidado y la cría del pez cebra. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de los NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) y el Centro de Investigación de pez cebra, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).

Tags

Biología del Desarrollo No. 120 de explantes de retina la microscopía multifotónica imágenes de células vivas el pez cebra la migración nuclear interkinetic la cultura la regeneración las células de Müller la mitosis la velocidad
Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter