Summary
제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.
Abstract
내인성 재생 프로그램은 신경 손상과 죽음 다음 (다니오 레 리오) 망막 성인 제브라 피쉬에서 뮐러 아교 세포에 의해 시작된다. 뮐러 아교 세포의 세포주기를 재 입력하고 세포 분열의 다음 라운드를 받아야하고 손실 된 신경 세포 유형으로 분화 신경 전구 세포를 생성합니다. 두 뮐러 아교 세포 및 신경 전구 세포의 핵은 DNA 복제 및 Interkinetic으로 설명한 프로세스의 망막, 즉 그들이 각각 기부 내부 핵 층 (INL) 및 (ONL)에는 외부 핵 층 사이에 이전의 별개의 위치에 유사 분열 핵 마이그레이션 (INM). INM은 주로 개발 망막에서 연구되고있다. 자세히 zebrafish의 망막을 재생 성인의 INM의 역학을 조사하기 위해 형광 표지 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 라이브 세포 이미징이 필요합니다. 여기, 우리는 분리하는 조건 및 문화 지느러미 망막을 제공의 Tg에서 [GFAP : nGFP] 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 노출 된 mi2004의 제브라 피쉬. 우리는 이러한 망막 문화가 지속적으로 GFAP의 철새 동작을 모니터링하는 광자 현미경을 사용하여 최대 8 시간 동안 망막 절편의 두께에 걸쳐 Z - 스택 이미지를 획득, 라이브 세포 이미징 실험을 수행하는 실행 가능한 것을 보여 nGFP 양성 세포를 . 또, 정점 및 기저 INM의 속도를 결정하는 사후 영상 분석을 수행하는 내용을 설명한다. 요약하면, 우리는 신경 재생의 성인 모델에서 INM의 역학을 공부하는 조건을 설립했다. 이것은이 중요한 세포 과정에 대한 우리의 이해를 발전 우리가 INM을 제어하는 메커니즘을 확인 할 수 있습니다.
Introduction
인간과 달리, 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 전시회 망막 뉴런 1, 2, 3, 4의 세포 사멸시 강력한 재생 응답. 종양 괴사 인자 α, 망막 신경 세포가 죽음으로부터 방출 된 시그널링 분자는 신경 세포로 분화하기 전에 증식 계속 신경 전구 세포를 5 증식 및 생산할 수있는 기저 내부 핵 층 망막 (INL)에 상주 뮐러 아교 세포를 유도 이 사망 종류 3,4-. 재생 응답의 증식기 동안 뮐러 아교 세포의 핵 및 유래 신경 전구 세포는 세포주기 (Interkinetic 핵 마이그레이션 INM) (6) 상에 반복적 이동성 패턴을 겪는다 > 7. 기초 INL에 위치 핵이 발생하는 핵이 INL에 basally 반환하기 전에 그들이 나누는 외부 핵 계층 (ONL)에 이주하기 전에 자신의 DNA를 복제합니다. 라이브 세포 이미징 방식 나중에 사우어 8, 9, 10, 11, 12에 의해 해석을 확인하면서 처리는 먼저, 조직 학적 방법을 사용 neuroepithelial 개발 중에 기재 하였다. 두 조직 화학적 및 라이브 셀 촬상 접근법 INM 망막 9, 11, 12, 13을 포함 neuroepithelia 개발에 그 기능을 기본 메커니즘을 결정하는데 사용되어왔다. 그러나 망막을 재생 성인의 INM을 지배하는 메커니즘은 자세히 연구되지 않았다외부 참조 "> 6, 7. 라이브 셀 이미징은 성인 재생 망막에 INM을 제어하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 향상 할 수있는 매우 중요한 방법이 될 것입니다.
최근까지, 망막 INM의 라이브 세포 이미징 라이브 제브라 배아 하나 또는 병아리 배아 또는 출생 후의 마우스 망막 이식편 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16에 한정되었다. 마우스, 래트 및 지브라 피쉬 포함한 다양한 종의 동물 성체의 망막 이식편은 다른 세포 생물학적 접근 17, 18, 19, 20을 위해 이용되었지만, 라이브 세포 이미징 실험 망막 하 이식편을 사용하여적이 시간의 기간을 브리핑하기 위해 제한된 몇 시간 (21, 22)를 통해 지속적으로 실행되지 않았다. 여기서 우리는 다 광자 현미경 (6)을 사용하여 라이브 세포 이미징 실험을 모니터링 INM을 수행하기 위해 문화 가벼운 손상 성인 zebrafish의 망막에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. INM 역학으로, 예를 들면 속도가 오히려 잠재적 면역 세포 화학을 이용하여 검출되지 않을 분열의 위치보다 더 영향을받을 수도 INM 제어 메커니즘을 조사 할 때 라이브 셀 촬상 방법은 면역 조직 화학적 방법에 비해 유리하다.
향후,이 방법은 또한 가능성이있다하는 등의 뮐러 아교 세포 또는 미세 아교 세포의 행동에 의해 광 수용체를 죽음의 식균 작용으로 망막 재생하는 동안 다른 동적 프로세스를 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 제브라 피쉬가 발생하고 Freimann 생명 과학 센터의 노트르담 Zebrafish의 시설에서 유지 하였다. 이 논문에 기술 된 방법은 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 및 비전 및 안과 연구 협회에 의해 비전 연구에 동물의 사용을 위해 문을 준수하고 있습니다.
1. 솔루션
- 조직 문화 후드 및 장비 / 조직 문화 후드로 전송되는 시약을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 준비합니다.
- (500 2- 페녹시 에탄올 1) 시스템의 물 1 L에 2- 페녹시 에탄올 2 mL를 넣고.
- 0.1 밀리미터의 NaHCO3, pH가 8.0을 준비합니다. 멸균 조직 문화 후드에서 솔루션을 소독하기 위해 10 ML의 주사기와 0.2 μm의 기공 크기의 주사기 필터를 사용합니다.
참고 : NaHCO3을 효율적으로 fluorodishes의 커버 슬립 표면을 가로 질러 세포와 조직 접착제를 확산시키는 데 사용된다 () 3.2 단계. - 준비 1.0 M CaCl2를 1.0 M의 MgCl 2. 멸균 조직 배양 후드에서 10 ㎖ 시린지 및 0.2 ㎛의 세공 크기의 주사기 필터로 멸균.
- Hank's 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 준비하려면, 1 mM의 각각의 최종 농도에서 페놀 레드없이 칼슘 / 마그네슘 2+없이 1 배 HBSS에의 MgCl 2 CaCl2를 살균 및 멸균을 추가합니다. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다.
- 50 % 페놀 레드없이 1 배 최소 필수 중간 (MEM), 25 % 염화칼슘 2의 MgCl 2를 포함하는 HBSS는 (섹션 1.4 참조), 25 % 말 혈청 (HS), 10 단위 / mL의 페니실린, 10를 혼합 배지를 준비하려면 μg의 / ML의 스트렙토 마이신. 무균 환경에서 작업 할 수 있습니다.
참고 :함으로써 노이즈 비율로 신호에 영향을 미치는, autofluoresces으로 페놀 레드를 포함하는 매체를 피하십시오. (23) - 페놀 레드없이 1 배 MEM 1 % 저 융점 아가로 오스의 10 ㎖를 준비합니다. 아가로 오스 / 1 배 MEM은 전자 레인지,를 사용하여 용융AVE. 유체의 증발에 의한 이온 농도를 변경됩니다 반복 재가열로 아가로 오스 (예를 들어, 10 ㎖)의 작은 볼륨을 준비합니다.
- 배양에 앞서, 오토 클레이브를 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브 살균.
2. 라이트 피해 패러다임
- 어두운 적응
- 이 장소 - 3의 Tg [GFAP를 : nGFP] 6에서 mi2004의 제브라 피쉬 (또는 관심의 다른 형질 전환 제브라 피쉬) - 14 일에 대한 빛의없는 환경으로 시대의 14개월. 더욱 상세 내용은 참고 2, 6, 24, 25을 참조하십시오.
- 2,800 룩스 2, 6, 24, 25의 광을 방출이 형광 램프 사이의 시스템 물에 3 어두운 적응 형질 전환 제브라 피쉬 - 2를 포함하는 탱크를 배치합니다. 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 제브라 피쉬를 노출. 33 °의 C - 광 노광시, 수온 (31) 사이에 유지되는 것을 보장.
배양 3. 준비 (망막 분리의 날)
- 70 % 에탄올을 사용하여, 조직 배양 후드 성분 살균 / 조직 배양 후드로 옮기고되는 도구 (예를 들어, MEM 및 HBSS, 피펫, 멸균 피펫 팁 등을 포함하는 플라스.).
- fluorodishes의 준비
- 세포 및 조직 접착제와 각각의 망막을위한 코트 하나 fluorodish는 (재료의 표 참조).
- 70 μg / ML의 최종 농도 0.1 mM의 NaHCO3을의 세포 및 조직 접착제를 희석 각 fluorodish 50 μL를 추가하고, 200 μL 피펫 팁으로 fluorodish의 중심을 가로 질러 용액을 확산 (약 1-1.2 cm 직경 ).
- RT에서 3 시간 - 1 코팅 fluorodishes을 품어(또는, 4 ° C에서 O / N을 품어).
- 솔루션을 제거하고 각 세척을위한 1 배 MEM 500 μL와 배를 씻어. 망막 외식가 장착 될 때까지 건조에서 코팅 fluorodishes을 방지하기 위해, MEM에서 그들을 유지합니다.
- 단계 1.6에 설명 된대로 배지를 준비합니다. 배양액을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
망막의 Explants 4. 분리 및 배양
참고 : 아래에 설명 된 프로토콜은 주로 설명 광 손상 패러다임에 의해 병변 된 망막 영역이다 지느러미 망막의 분리입니다. 따라서, 손상에 의한 증식과 interkinetic 핵 마이그레이션 관련 이벤트는 지느러미 망막에 발생합니다. 그러나 상기 분리 방법은 연구 / 조사 질문의 특정 요구 사항에 따른 망막 영역을 생성하도록 조정될 수있다.
- 하나의 광 손상 형질 전환 제브라 피쉬 a를 안락사1 타 시간 : 500 2- 페녹시 에탄올.
- 1,000 μL 피펫으로 한 fluorodish에서 MEM을 제거 유체 유적의 박막 있도록.
- 마른 종이 타월에 제브라 피쉬 이동 뒤몽 포셉 (핀셋 # 5, 45 ° 각도)의 곡선 쌍의 눈을 제거하고 fluorodish에 그것을 전송할 수 있습니다.
- 시신경과 눈 뒤쪽 표시되도록 입체 현미경을 사용하여, (도 1D)에 fluorodish의 커버 슬립 상에 동공과 눈의 방향.
- 맥퍼슨 - Vannas 가위 한 쌍의 눈 뒤쪽에 가까운 절단, 시신경을 제거합니다. 또한, 안구의 외측에 감 결합 조직을 제거한다.
- 사상 판을 통해 하나의 가위 블레이드 피어싱과 코와 눈의 시간적 양쪽을 따라 절단하여 광학 줄기에서 절개를하는 동안 # 5 포셉 한 쌍의 비강 및 시간 측면 사이의 눈을 잡고 (그림 1E 참조 , 분할 리네브라스카).
- 망막의 등 쪽과, 지느러미 망막에서 복부를 별도의 조직을 당겨 다른 쌍을 유지 # 5 포셉 두 쌍을 사용.
참고 : 공막이 위를 향하면서 렌즈와 신경절 세포 층이 coverslip에 직면 있도록 지느러미 망막의 방향을하는 것이 좋습니다. - # 5 포셉 (그림 1H, I)의 두 번째 쌍의 망막에 연결되어있는 렌즈를 누른 상태에서, # 5 포셉 한 쌍의 지느러미 망막에서 공막을 제거합니다.
- 렌즈를 제거하려면, 맥퍼슨 - Vannas 가위를 사용하여 망막 (그림 1I, J)을 손상시키지 않고 렌즈 뒤에 잘라. 경우에 따라 렌즈는 단계 4.7에서 분리합니다. 이 경우, # 5 포셉의 두 번째 쌍의 절단 가장자리에있는 망막을 잡고 집게로 조심스럽게 공막를 제거합니다.
- 망막에 손상을주지 않고 렌즈를 제거하는 동안 유리체를 제거합니다. 커버 슬립 대향 신경절 세포 층 망막 평평fluorodish의 (그림 1L, M).
- 1 % 저 융점 아가로 오스 10 μL와 망막 둘러싸고 아가로 오스가 고형화하자.
- 심지어 약간의 상승이 조직에 깊이 집중하는 능력에 영향을 미칠 수있는 액체 아가로 오스가 망막을 들어 올리지 않는 것을보십시오. 리프팅이 관찰되는 경우, 아가로 오스를 제거하는 피펫을 사용합니다. 더 추가하기 전에 잔류 아가로 오스 세트를 보자.
- 전체 fluorodish을 충당하기 위해 1 % 저 융점 아가로 오스를 추가하기 전에 여러 번 단계를 반복 4.12. 아가로 오스가 확정되면, 1.5 mL의 배지를 추가합니다.
- 망막 분리 조작에 의해 발생하는 응력을 회복 할 수 있도록 약 12 시간 동안 32 ° C로 설정 5 % CO 2 / 공기 환경에서 망막 이식편 배양을 유지한다. 빛 처리 제브라 같은 온도에서 망막을 유지하도록 32 ° C의 온도를 설정한다 (단계 2.3 참조).
5. 다중 광자 현미경
(재료의 표 참조)하는 40X 아포 장거리 침수 목표 (1.15 NA)가 장착 된 광자 현미경, 검류계 스캐너와에 최적화 된 네 35mm 배양 접시에 대한 삽입을 포함 환경 챔버. 이미지는 비 descanned 검출기 (R-NDD)을 획득 하였다.
- 촬상에 앞서, 5 % CO 2 / 공기 분위기를 달성하는 환경 챔버를 평형. 빈 배양 접시가 방으로 가스의 누출을 방지하기 위해 홀더에 삽입되어 있는지 확인합니다.
- 현미경 시스템을 켭니다.
- 환경 챔버가 평형되면, 40X 아포 장거리 침수 목적 (NA 1.15)에 굴절률 액체를 추가 할 수 있습니다.
주 : 물과 유사한 광학 특성을 갖는 굴절률 액체 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 사용된다. - 장소 독감챔버에 망막 외식과 orodishes. 브라이트 라이트를 사용하여 빛의 경로로 시료를 놓고 초점면에 지느러미 망막의 midregion을 가지고.
- GFAP에 초점을 GFP의 epifluorescent 빛을 사용 nGFP는 뮐러 아교 세포의 핵 (그림 2A, C)를 양성.
참고 : nGFP 양성 핵하거나 희미 형광됩니다 외식 평면 또는 아가로 오스 이식편에서 축적 장착하지 않는 경우가 GFAP에 집중하기 어려울 것이다.- 같은 망막 이식편 내에서 다른 지역으로 이동하는 초점 문제를 극복 여부를 확인합니다. 그렇지 않으면 다른 망막 이식편로 이동합니다.
- 이미지 수집 소프트웨어에서 'A1 MP GUI'는 'TiPad'에서 'A1 컴팩트 GUI'와 'ND 취득'창을 엽니 다. 광자 이미징의 경우, 'IR NDD'옵션이 'A1 컴팩트 GUI'에서 선택되어 있는지 확인합니다.
- 'settin에서g '필드는, 1 차 다이크로 익 미러 IR-DM을 선택하고 GFP의 형광을 취득 50분의 525 대역 통과 필터를 선택합니다.
- 'A1MP GUI'라고 표시된 창에서 IR 레이저에 전환합니다. 레이저가 준비하는 것은 몇 분 정도 소요됩니다. GFP의 형광을 자극하고 'A1 MP GUI'창에서 '자동 정렬'버튼을 클릭하여 레이저를 정렬 910 nm의 파장을 설정합니다.
- 객실 및 장비 등은 광전자 증 배관의 과다 노출을 방지하기 위해 'A1 MP GUI'에 셔터를 열기 전에 꺼 또는 포함되어 있는지 확인합니다. 소음을 줄이기 위해, 어두운 환경에서 현미경 집.
- 두개의 줌, 4.8 μS / 화소의 화소 보압 시간 300 X 300 픽셀의 시야의 이미지를 획득. 대략 'A1MP GUI'와 'A1 컴팩트 GUI'창에서 이득에서 '수집 영역'을 변경하여 레이저 출력을 설정합니다.
- 는 z 스택 설정
- ND 획득 '창'을 내 Z '서브 윈도우'는의 Z - 스택의 상단에 초점면을 설정 신경절 세포 층에 초점을 맞 춥니 다. 일부 GFAP : nGFP 양성 세포는 일반적으로 망막 (도 2A, D)의 기부 제한을 식별하는 데 도움 신경절 세포 층에 위치한다.
- ONL의 수준을 통해 초점면을 이동 (그림 2A, B), 희미하게 표시 GFAP의 존재에 의해 특징되는 다음 INL (그림 2A, C)에서의 대응에 라운드 및 확대 상대적 nGFP 양성 세포를 .
- 는 z-스택의 하위로이 비행기를 설정합니다. 전체 ONL (그림 2A, B) 이미징 될 것입니다 있는지 확인합니다.
- 이미징 기간 동안 다시 조정 필요 초점면의 변화를 경험하는 경우 '홈'위치로 지정하는 'Z'서브 윈도우의 중간 위치를 두 번 클릭합니다. 로 변경 '대칭 모드 정의'와 '상대'을 클릭합니다.
- 1 ㎛ 0.7 사이의 Z-단계의 크기를 설정합니다.
- Z 강도 보정 :
- 때문에 빛의 산란에 픽셀 강도의 손실을 보상하기 위해 Z-강도 보정을 적용 할 때 조직의 깊은 층에있는 영상.
- 보정을 설정하려면 'Z-강도 보정'창을 엽니 다. 'Z-스택 범위', 'ND에서'선택을 설정합니다.
- 게인 (A1 컴팩트 GUI합니다 ( 'A1MP GUI'에서 '수집 영역') 레이저 강도를 (이 경우, 신경절 세포 층에 해당)가 'Z-강도 보정'창 하단의 초점면을 클릭하고 설정 ).
- 이후 선택한 초점면의 'Z-강도 보정'창에서 '장치 설정'아래에 표시되는 설정을 확인하는 'Z-강도 보정'창에서 'Z 값'옆에있는 화살표를 클릭합니다.
- 중간 A의 과정을 반복레이저 전력 이득을 증가시키는 ND 상부면. 필요할 경우 추가의 초점 평면을 첨가 할 수있다. 4 - 그림 2에 실험에 대한 구체적인 레이저 및 게인 설정은 표 1을 참조하십시오.
- 'A1 MP GUI'창에서 '인수 영역'을 설정합니다. (15)보다 큰 인수 영역과 photobleaching에 우회하는 영상의 시작에 이득보다 높은 126을 선택 피하고 소음 증가했다.
참고 : 레이저 및 광전자 증 배관 튜브 광표백을 피하면서 설정 한 현미경 최적의 촬영 조건을 얻기 위해 현미경 시스템, 테스트 레이저 및 게인 설정 사이에 차이가있다. - 'Z-강도 보정'창에서 '상대 강도 보정'을 선택합니다.
- 'ND 인수'창에서 '시계열'서브 윈도우에서 8 시간에 시간과 '지체없이'로 간격을 설정합니다. 그런 다음, t에서 '실행 Z-수정'을 클릭해야합니다'ND 획득'창 버튼에서 그는 'Z-스택'하위 창은 3-D의 시계열을 획득한다.
- 이미지 수집의 기간에 걸쳐 29 °의 C - (27)의 온도에서 망막 외식을 유지한다.
- 화상 획득 기간 동안, 필요할 경우, 포스트 영상 분석을위한 이미지 품질을 유지하기 위해 전력 레벨 이득을 재조정. 5.11.4 - 조정에 대한 단계 5.11.2를 수행합니다.
- 초점면 이동하는 경우, 일시 중지하거나 실행을 중지하고 단계를 다시 5.11를 수행합니다.
참고 : '상대 Z-보정'단계 5.12.7에서 선택되었다 단계 5.11.4이 수행 된 경우 광범위한 광표백가 발생하지 않는 한, 전력 및 이득 수준을 재조정 할 필요는 없습니다.
속도 6. 분석
- 이미지에 '관심 지역'을 설정, 시간의 압축을 풉니 다. '시간 측정'도구를 사용하여 스프레드 시트에 시간 값을 내보낼 수 있습니다.
- 디를 포함하는 영역을 자르기이용하므로의 GFAP : nGFP 양성 핵.
- 그 다음에 분할 핵 기저 INL 관련하여 이전의 거리를 측정하기 위해 기준 포인트를 설정하기 위해 INM을받지 않은 적어도 하나의 핵을 포함되도록 자른 영역을 선택한다. 참고 : 기초 INL에 남아 핵를 선택하려면,이 시계열의 3 차원 재구성을 준비하는 데 도움이됩니다.
- GFAP 경우 대안 : nGFP 양성 세포의 획득주기에 걸쳐 ONL 관찰되어 기준점을 식별하기 위해 기저 INL에 ONL 핵에서 스패닝 고정 길이의 수직 라인을 사용한다.
- '쇼 조각보기'기능을 사용하여 직교 돌기를 생성합니다. 그 후, '최대 강도 투사'에서 '조각'의 모드를 변경합니다.
- 직교 최대 투사의 'XY'보기를 끄십시오. 이주중인 / 분할 핵, 가장 볼 수있는 방향에 따라LSO는 'xz'- 또는'yz'보기 중 하나를 끕니다.
- 마우스 오른쪽 버튼으로 남아있는 이미지를 클릭이보기에서 새 문서 만들기 '함수'XZ '또는'를 함께 yz' 이미지 시리즈 '를 추출합니다. 필요한 경우, 이미지를 회전.
- '수동 측정'기능을 사용하여, 기초의 INL 유지 및 INM받지 않는 핵의 하부 레벨에서는 이미지의 수평 라인을 그릴 (= 기준점,도 4a를 - E 적색 가로줄).
- 기준선 및 분석 소프트웨어의 '선 측정'도구 (- E도 4a 참조)를 사용하여 시계열에 대한 이주 핵의 기점 사이의 거리를 측정한다.
- 핵막가 고장 나면 그것은 전체 셀에 GFP의 확산 다음으로 식별되면, 소마의 기초 위치를 측정한다.
- 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하면, 거리에게 플레이 플롯cleus (그림 4 층) 전달 된 시간에 대해 마이그레이션.
- 발생 (V a)는, 그래프의 거리가 핵 봉투 고장 전의 기간 동안 여행 혀끝의 이동 속도 (그림 4 세대)를 결정합니다.
- 차트에서 데이터 계열을 선택, 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 해당 기능 'Y = MX + C'를 포함하는 선형 회귀 곡선을 삽입합니다. 함수의 기울기 'm'은 속도를 나타내고, V A (도 4G).
- 반복 기저 이동 속도, V의 B (그림 4H)을 결정하기 위해 빠른 기초 마이그레이션의 첫 단계에 대한 6.11.1과 6.11.2 단계를 반복합니다.
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Representative Results
그림 1의 회로도에 설명 된 절차에 따라 망막의 분리는 가벼운 손상 성인의 Tg에서 평평 지느러미 망막의 배양을 할 수 있습니다 [GFAP : nGFP] 5 % CO 적어도 24 시간에 걸쳐 mi2004 제브라 피쉬 2 / 공기 환경을 제공합니다. 이러한 평면 장착 망막 이식편 깊은 조직 레벨에서의 이미지의 초점 평면에 사용될 수있다. 예는 뮐러 아교 세포 / 광 손상 망막에서 유사 분열하는 동안 ONL에 위치한 뮐러 아교 세포 - 특이 적 프로모터의 GFAP (아교 섬유 성 산성 단백질)에서 GFP로 표지 된 신경 전구 세포의 핵 (도 2a - D, 3). 아래의 막대 광 수용체에 EGFP을 표현 nt19 제브라 피쉬의 눈 : 더이 방법은 다양한 망막 세포 층을 이미지에 적용 할 수 있는지 확인하기 위해, 급성 고립 된 망막 외식은 손상되지 않은 Tg는 [Eco.NfsB-EGFP 피페에서 제조 하였다로돕신의 프로모터. 도 2E는 - H는 GFP 양성로드 감광체 및 내측 세그먼트의 이미지를 획득 할 수 있음을 보여준다. 로드 내측 세그먼트 망막 색소 상피 향해 원뿔 감광체 사이에서 연장 된 바와 같이, 이러한 데이터는 화상 콘 감광체에도 가능하다는 것을 의미한다. 그러나 이것은 더 조사하지 않았다.
광 손상 망막에서 ONL에서 관찰 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 핵을 갖는, 우리는 세부 사항 (그림 3과 영화 1) 자신의 철새 행동을 특징으로한다. GFP로 표지 된 뮐러 신경교 / 신경 전구 세포의 핵은 일반적으로 상주 INL 및 ONL, 감광체 손실 부위의 기초 위치 사이에서 양방향으로 이동한다. 일반적으로, GFAP은 - 그들이 시행 전에 nGFP 양성 핵은 INL에서 짧은 거리 (C도 3a를) 마이그레이션핵막 고장 여전히 전체 뮐러 신경교 / 신경 전구 세포 (도 3d)의 세포질에 GFP의 재분배에 기초하여, INL에 위치하고있다. ONL에서 세포 분열에 이어 두 GFAP는 : nGFP 양성 핵은 기저 INL (- J 그림 3H)에 반환 ONL (그림 3 층, G)에 표시되었다. 세포 분열시, 새로 발생하는 핵는 처음에 매우 희미하고 (그림 3G)를 식별하는 것이 어려웠다. 그러나, 유사 분열 후 한 두 시간 프레임 내에서, 핵 GFP의 형광 핵 이전의 시각화 (- J 그림 3H)를 사용하는 밝은되었다. 라이브 세포 이미징은도 3에 도시 한 셀에 대한 망막의 선 단면에 발생한 수평 분할면 (도 3f, G)의 시각화를 허용했다. 다른 형질 전환 지브라 피쉬 선 등을 사용하는 것도 가능하다Tg가 [GFAP : EGFP]로 세포질에 GFP를 발현 NT11 제브라 피쉬 (데이터는 보이지 않음). 신뢰성있게 정점 이동 및 수평 세포 분열을 판정 할 수 있지만, 정확하게의 Tg의 basally 마이그레이션 딸 핵 수직 세포 분열의 위치를 식별하는 것이 어렵다 [GFAP : EGFP] NT11 제브라 망막 (데이터 미도시).
속도를 확인하려면 GFAP : nGFP 양성 핵 녹음 기간 동안 마이그레이션하지 않은 기준점 (- E 스타,도 4a)로 선정되었다. 최대 XZ 또는의 이미지 시리즈의 각 평가시기에 - nGFP 양성 핵 (E 가로 레드 라인,도 4a) : - 이주중인 핵 (수직 레드 라인,도 4a E)의 거리를 기준 GFAP와 관련하여 결정 하였다 YZ-돌기 (따라 어느 각도에서 핵이 될 수 visuali) 가장 효율적으로 평탄화. 핵 이주 거리가 스프레드 시트 (- H 그림 4 층)의 시간에 대해 도시 하였다. 핵막 고장으로 인해 종종 전체 셀 내의 GFP의 재 분포 (이 경우에 전지 본체의 기부 대부분)에 초기 basalward 운동으로서 그래프로 관찰되었다. 혀끝의 속도는 핵 봉투 고장 전의 기간 (붉은 다이아몬드, 그림 4G)의 시간에 대해 도시의 거리에 선형 회귀 곡선 (회색 점선, 그림 4G)를 피팅, 핵 봉투 고장 전에 결정되었다. 선형 회귀 곡선 (MX = Y + C)의 기울기 m은 속도 'DX / DT'를 나타낸다. 그림 4에 제시 셀의 혀끝의 속도는 10.89 μm의 / 시간이었다. 동일한 방법은 초기 급 기부 이동 속도 (V B) 새로 형성된 보조 핵 (도 4F를 계산하도록인가 H). 딸 세포 D1과 D2의 -67.71 및 33.51 μm의 / 시간의 기초 마이그레이션 속도의 V B는 각각 빠르게 혀끝의 속도보다 비교적이었다. 불행히도, 전체 셀에 걸쳐 확산 GFP 등 핵막 고장 후의 근단 속도를 결정하는 것은 불가능했다. 대신, 순간 속도는 핵막 고장 및 새로 형성된 보조 핵의 제 시각화 전에 핵의 타이밍 및 위치에 기초하여 산출 하였다. 딸의 핵이 표시 될 때 염색질이, 유사 분열의 telophase에 ONL 전에 도달 그림 4 셀 7.9 μm의 / 시간의 순간 속도 가능성이 과소 평가입니다.
요약하면, 망막 외식의 문화는 제브라 피쉬 망막 및 마이그레이션 및 세포 분열 파의 결정을 재생 성인의 INM의 라이브 세포 이미징을 할 수 있습니다개별 핵의 rameters.
그림 1 : 망막 분리 절차. A) 도식은 눈을 가진 제브라 피쉬의 머리를 설명. B) 눈은 제브라 제거 동공과 눈의 전방 표시하도록 배향된다. 광학 스토킹 (채워진 검은 원)와 눈의 뒷면 (D에 표시된다) 및 동공이 아래로 향하도록 C) 눈 180도 돌립니다. 회색 색상은 눈의 공막의 존재를 나타낸다. E) 맥퍼슨 - Vannas 위의 쌍 중 하나 블레이드는 흰색 분할 선으로 표시되어 그 지느러미와 복부 측면에 그것을 잘라 눈의 광학 스토킹 (채워진 검은 색 원)에 삽입된다. F) 복부 절반은 제거 후 눈의 등쪽 반. 검은 반 원은 t을 나타냅니다그는 광학 줄기의 나머지 부분. G)은 여전히 공막 (회색 선으로 쌌다 망막 (갈색), 유리체 (도시하지 않음) 및 렌즈 (L, 밝은 회색 원)으로 90 ° 뒤로 공개하는 눈 (H) 눈의 내부를 돌려 ). I) 공막은 (주는 회색 선)이없는 분리하고 J) 렌즈와 유리체는 망막 (갈색)으로 상승을 부여 제거. K) 망막은 지느러미 망막 (L)의 평면 마운트 뷰 90 ° 앞으로 제공 상승을 돌렸다. M) 지느러미 망막 절편은 유리 바닥 fluorodish에 평평하게 장착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 3-D 재건망막 다중 광자 Z-스택입니다. GFAP의 광자 Z 스택 이미지 시리즈의 A) 3 차원 재구성 : 가벼운 손상의 48 시간 후 제브라 피쉬에서 망막 전체 마운트 문화 nGFP- 양성 세포. B - D) GFAP 단일 광자 XY-이미지 : 뮐러를 포함하는 층에 해당 ONL (B)의 INL (C)의 레벨) A (3D-에서 재구성 표시 nGFP 양성 세포 아교 세포의 소마와 GCL (D). 핵 봉투 고장 후 ONL의 확대 라운드 뮐러 아교 세포를 나타냅니다 (B)에 화살표. E) 손상되지 않은 Tg가에서 망막 이식편의 광자 Z 스택 이미지 시리즈의 3 차원 재구성 피페 : Eco.NfsB-EGFP] nt19 제브라 피쉬. F - H)로드 내부 세그먼트 (RIS, F),로드 핵 층의 수준에서 단일 광자 XY-이미지 (G)과 내부 망막 (H)의 수준에서. GCL, 신경절 세포 계층; INL, 내부 핵 계층; ONL, 바깥 핵 층; RIS,로드 내부 세그먼트. A, D, E와 H, 10 μm의 규모 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : INM 사의 Timelapse 이미지 시리즈. A - Tg를 표시하는 Z-스택 timelapse에 시리즈의 3D 재건의 J) 이미지 시리즈 [GFAP를 : nGFP] mi2004 망막 외식에 ONL (맨 윗줄)에서 분할 INM를 받아야 양성 핵을. 한 치근단 마이그레이션 핵 및 basally 마이그레이션 딸 핵의 위치는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 레드 스타는 유사 분열시 핵 봉투 고장을 나타냅니다. A - J, 아래 줄)을맨 윗줄에서와 같은 이미지 시리즈는 과포화이고 ONL에서 분열하는 세포에 초점을 잘립니다. INL, 내부 핵 계층; IPL, 내부 얼기 층; ONL, 바깥 핵 계층. A의 스케일 바, 10 μm의 및 B에 대해 동일합니다 - J.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 혀끝과 기저 마이그레이션 속도의 분석. A - E)의 Tg의 Z 스택 이미지 시리즈의 최대 YZ 프로젝션 [GFAP : nGFP] 다 광자 현미경에 의해 취득 인터벌 레코딩의 다른 시점들에서 mi2004 망막 외식. '수동 측정'기능 아래 줄 도구를 사용하여, 수평 라인은 별표로 나타내는 레퍼런스 셀의 레벨에 배치 하였다. 세로 나asurement 선은 수평 라인에서 시작하여 이주의 GFAP의 기초 위치로 연장되어 위치했다 : nGFP 양성 핵. 측정 라인의 길이는 이미지에와 이미지에서 가독성을위한 흰색 상자에 나와있다. L1 딸 전지 (1) 마이그레이션 = 길이; L2 딸 셀 (2) 마이그레이션 = 길이. F)의 거리 셀 (A 측정 (F0) 있음 - E)은 치근단 마이그레이션 및 발생하는 딸 세포 D1과 D2는 광자 timelapse에 기록에 basally 마이그레이션있다. 빨간색 선은 검은 색과 회색 선이 각각 (V b)는 D1과 D2의 기초 마이그레이션 속도를 계산하는 데 사용되는 측정을 나타냅니다 동안 혀끝의 이동 속도 (V A는) 계산되는 측정을 나타냅니다. G, H)의 거리가 핵 봉투 고장 (G 전에 혀끝의 마이그레이션을위한 Excel에서 시간에 대해 도시되었다) 및 신속한 기초의 위상딸 셀 D1 (H)에 대한 이주. 선형 회귀 곡선을 장착하고, 기능들은 속도를 나타내는 경사 그래프 아래에 주어진다. INL, 내부 핵 계층; IPL, 내부 얼기 층; ONL, 바깥 핵 계층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| TG [GFAP : EGFP] NT11 | TG 피페 : Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| 레이저 파워 | 이득 | 레이저 파워 | 이득 | ||||||
| 최고 (로드 광 수용체) | (13) | (126) | 3.5 | (118) | 중동 (뮐러 아교 세포) | (10) | (126) | 2.8 | (118) |
| 하단 (GCL) | 8 | (126) | 2.1 | (118) | |||||
표 1 : 레이저 및 그림 2에 표시 실험에 대한 다른 비행기에서 Z-강도 수정에 사용 게인 레벨 - 4.
영화 1 : 다중 광자 현미경에 의한 망막의 Explants의 라이브 셀 이미징. (오른쪽 다운로드 클릭).
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Discussion
손상된 성인 제브라 망막 주로 사용한 면역 세포 화학 방법을 5, 25, 26, 27, 28, 29, (30)의 재생을 관리하는 메커니즘을 조사 연구. 배양 망막 이식편에 조건을 설정하고, 이러한 INM 같은 현상 라이브 세포 이미징을 수행 우리 깊이 공간 및 시간 정보를 얻을 수있는 기술을 제공한다. 이 기술은 이동 속도, 유사 분열 및 길이 및 세포 분열의 위치 의향 동안 타이밍 및 핵막 고장의 위치를 결정할 수있다. 또한, 그 이후의 위치에 관해서 분할면 및 발생 딸 세포의 운명을 확립 할 수있다. 궁극적으로,이 강력한 접근 방식이 결정됩니다 M 여부2, 크 로스 아교 세포 및 신경 전구 세포는 망막 재생하는 동안 INM에 관하여 다르게 동작합니다. 재생 응답 별개 단계에서 재생 망막 세포 증식을 식별 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 사용은 차동 동작 6 해독 도울 것이다. 여기에 사용 된 다 광자 현미경의 경우, GFP 리포터 제브라 라인들은 매우 효율적이지 적색 형광 단백질 (RFP)의 여기로서 바람직하다; 그러나, 다른 광자 시스템은 RFP 또는 이에 상응하는 형광 물질을 효율적으로 여기를 허용 할 수있다.
망막 분리 과정에서 가장 중요한 단계 중 하나는 망막의 장착된다. 망막은 광자 빛이 ONL의 깊은 Z-수준으로 통과 할 수 있도록하기위한 가능한 평면 장착해야합니다. 를 고정하기 위해 사용되는 배양 망막 하의 특히 가장자리 영역 망막 잔류 유리질 및 / 또는 아가로 오스의 축적 커브의조직은, 가장 일반적으로 커버 슬립 망막 배양 사이의 추가 공간을 소개한다. 망막은 평평하지 이것은 결과적으로 증가 광표백 망막 문화의 감소 가능성을 일으킬 경우뿐만 아니라, 증가 된 레이저 전력 및 이득 이미지를 획득하기 위해 사용되어야한다. 잘못된 장착은 종종 인해 감소 된 빛의 침투에 가난한 이미지 품질 결과 및 핵 따라서 이동 속도의 계산을 마이그레이션하고 있던 거리를 측정 할 수있는 능력에 영향을 미칠 것입니다.
mi2004 제브라 피쉬 망막 외식 : 핵 봉투 고장 전 기초 이전의 정점 마이그레이션의 속도는 안정적으로 Tg는 [nGFP GFAP]에서 이미지의 시리즈에서 결정될 수있다. 그러나, 전체 세포질 걸쳐 GFP 재에 분배 등이 형질 전환 지브라 피쉬 라인 핵막 고장 후 염색질의 정점 이동의 속도를 결정하기 위해 현재 불가능하다. Labeli핵 염색 훽스트 망막 이식편의 NG가 조직의 생존 영향 세포주기의 스톨을 야기 830 나노 미터 (Lahne 및 하이드 미발표 데이타)에 파장 변화를 요구 뮐러 아교 세포 핵에 희미 흡수 결과 ( Lahne & 하이드, 게시되지 않은 데이터). 망막 개발 과정에서의 Tg [h2afva : h2afva-GFP] 히스톤이 융합 GFP를 발현 kca6 제브라 피쉬 성공적 INM을 모니터링하고 세포주기 (12), (31)의 다른 단계에서 이동 속도를 결정하는 데 사용되었다. 앞으로의 Tg [h2afva : h2afva-GFP]에서 망막 외식 kca6 제브라 피쉬는 세포주기에 걸쳐 염색질의 시각화를 가능하게하고 zebrafish의 망막을 재생 성인의 핵 막 붕괴 후 혀끝의 마이그레이션 속도의 분석을 수 있습니다.
하여 INM을 모니터링 조건이 확립가벼운 손상 성인 제브라 피쉬와 속도의 해당 분석에서 망막 외식 라이브 세포 이미징은 INM을 지배하는 메커니즘을 조사 할 수있는 기초를 형성합니다. 일부 연구 분열 포스 포 히스톤 3 양성 핵 (6, 7)의 위치를 결정하기 위해 면역 세포를 사용하여 망막 재생 성인에 INM의 메커니즘을 조사했다. 그러나, 신호 전달 경로를 방해하는 것은 유사 분열의 위치를 렌더링 할 수 있지만, 이러한 / 가능한 면역 세포에 의해 분별하기가 매우 어렵되지 않을 것 속도, 유사 분열과 분열의 타이밍과 같은 다른 변수에 영향을 줄 수 있습니다. 이전에는 dynactin 돌연변이와 morphants (11)에서 개발 망막에 더 많은 기초 위치에 mislocalized 그 포스 포 히스톤 3 양성 유사 분열 핵를 줬습니다. 그러나, 다음 라이브 세포 이미징은 핵 이주가 세포 분열하기 전에 dynactin - 손상된 세포 지연 한 것으로 나타났다의, 증가 혀끝의 이동 속도에 도달하고 혀끝의 표면 (11), (12)에서 세포 분열을 받아야하는 핵을 사용할 수있다. 이 예는 살아있는 세포의 이미징 능력을 예시한다. zebrafish의 망막을 재생 성인에 INM을 촉진하는 메커니즘을 탈피 할 때 마찬가지로, 라이브 세포 이미징 연구는 보완, 다양한 경우에, 면역 세포 화학적 방법을 통해 유익 할 것입니다.
상술 한 바와 같이, 라이브 세포 이미징 면역 / 정적 방법에 비해 많은 장점을 제공한다; 그러나, 망막 외식은 생체 모델 있음을 명심해야합니다. 이러한 손상은 분리 절차를 수행하는 동안 발생 및 / 또는 배양 조건은 세포 과정에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 촬상 과정 자체는 셀룰러 동작 (23), (32)에 영향을 미칠 수있는 독성을 발휘할 수있다. disadv이 있지만antages이-살 세포 망막 문화의 이미징하기 위해서는 INM의 동적 정보를 얻기 위해 우리의 가장 좋은 방법은 현재이다. 중요한 것은, 망막 이식편의 라이브 세포 이미징 절차 망막 재생 중에 다른 생물학적 문제에 적용된다. 면역 세포 화학적 데이타에 기초하여, 이전 뮐러 신경교 광 - 유도 손상 감광체 (33) 다음 감광체 / 파편 죽어 탐식 것을 제안 하였다. 죽어가는 광 수용체의 식균 작용이 재생 zebrafish의 망막에 발생하고 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 경우이 과정이 이미지에 매개 변수를 라이브 조정 확인합니다. 이미지 피페 : Eco.NfsB-EGFP]의 Tg에로드 핵과 내측로드 세그먼트의 레벨에서 획득 할 수 있음을 나타내는 데 nt19 제브라 피쉬, 이미지 식세포 감광체의 조건을 조절하는 것이 가능해야한다. 마찬가지로, 지식은 미세 아교 세포의 동적 행동과 자신을 지배하는 메커니즘에 대한 제한퇴화의 기능과 재생 망막 34, 35. 라이브 세포 이미징과 함께 미세 아교 세포 고유의 형질 전환 제브라 피쉬를 이용하면 제브라 피쉬의 망막 (36), (37)의 재생 성인에서 미세 아교 세포의 기능에 대한 우리의 이해를 증가 할 것이다. 요약하면, 망막 이식편의 라이브 세포 이미징 세포 프로세스의 동적 정보를 획득하고 재생 망막에서 다른 세포 유형의 동작과 기능을 결정하기위한 강력한 도구이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 윌리엄 아처와 노트르담 통합 이미징 시설에서 제공하는 지원을 주셔서 감사합니다. 특별 감사는 지속적인 도움과 자신의 관심과 제브라 피쉬의 축산에 대한 Freimann 생명 과학 기술자로 보내집니다. 본 연구는 DRH에 NIH 국립 안과 연구소 (R01-EY018417, R01-EY024519)과 Zebrafish의 연구 센터, 노트르담 대학교, 노트르담, IN에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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