Summary
Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.
Abstract
Ein endogenes Regenerationsprogramm wird von Müller Glia im erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) Retina folgende neuronaler Schädigung und Tod eingeleitet. Die Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus und neuronale Vorläuferzellen erzeugen, die den folgenden Runden von Zellteilungen durchlaufen und in die verlorene neuronalen Zelltypen differenzieren. Sowohl Müller Glia und neuronaler Vorläuferzellkernen replizieren ihre DNA und durchlaufen die Mitose in bestimmten Orten der Netzhaut, also wandern sie zwischen dem basalen Inner Kernschicht (INL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) verbunden sind, in einem Verfahren , wie Interkinetic beschrieben Nuclear Migration (INM). INM hat überwiegend in der Entwicklung von Netzhaut untersucht worden. Um die Dynamik von INM im erwachsenen Regenerieren Zebrabärbling Retina im Detail, Live-Cell-Imaging von fluoreszenzmarkierten Müller Glia / neuronale Vorläuferzellen zu untersuchen ist nicht erforderlich. Hier stellen wir die Bedingungen zu isolieren und Kultur dorsalen Retinaevon Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling , die für 35 h konstant starkem Licht ausgesetzt waren. Wir zeigen auch , dass diese Netzhautkulturen sind tragfähige Lebendzell - Imaging - Experimente durchführen, kontinuierlich z-Stapel - Bildern über die Dicke der retinalen Explantation für bis zu 8 h unter Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie zu überwachen das Zugverhalten von GFAP Erwerb: nGFP -positiven Zellen . Darüber hinaus beschreiben wir die Details post-Bildanalyse auszuführen, um die Geschwindigkeit der apikalen und basalen INM zu bestimmen. Zusammengefasst haben wir Bedingungen, die Dynamik von INM in einem Erwachsenen-Modell der neuronalen Regeneration zu untersuchen. Das wird unser Verständnis dieser entscheidenden zellulären Prozess voranbringen und es uns ermöglichen, die Mechanismen zu bestimmen, die INM steuern.
Introduction
Im Gegensatz zu Menschen, Zebrabärbling (Danio rerio) zeigen eine robuste Regeneration Reaktion auf den Zelltod von retinalen Neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor - Nekrose - Faktor α, ein Signalmolekül , das aus sterbenden retinalen Neuronen freigesetzt wird , induziert Müller Glia in der Basalschicht Inner Nuclear Wohnsitz (INL) der Netzhaut 5 zu proliferieren und neuronaler Vorläuferzellen erzeugen , die vor Differenzierung in die neuronale Zelle zur Proliferation fortzusetzen Typen , die 2 starben, 3, 4. Während der Proliferationsphase der Regenerierungsreaktion, die Kerne von Müller Glia und deren abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen durchlaufen eine sich wiederholende Migrationsmuster in Phase mit dem Zellzyklus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 > 7. Nuclei positioniert in der basalen INL replizieren ihre DNA vor zu den Äußeren Kernschicht Migration (ONL), wo sie sich teilen, bevor die entstehenden Kerne basal zum INL zurückzukehren. Dieser Prozess wurde erstmals während neuroepithelial Entwicklung mit histologischen Methoden beschrieben, während Live-Cell - Imaging Ansätze bestätigt später die Interpretation von Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Beide histochemische und Live-Cell - Imaging Ansätze verwendet wurden Mechanismen zur Bestimmung zugrunde liegenden INM und seine Funktion bei der Entwicklung von Neuroepithels einschließlich der Netzhaut 9, 11, 12, 13. Jedoch haben die Mechanismen INM im erwachsenen Retina Regenerieren nicht sehr detailliert untersucht wordenxref "> 6, 7. Live-Cell - Imaging wird eine unschätzbare Ansatz sein , unsere Kenntnisse über die Signalwege zu fördern , die INM im erwachsenen regenerierende Retina steuern.
Bis vor kurzem wurde der Abbildung lebender Zellen von INM in der Retina beschränkt auf entweder live Genaktivität oder Hühnerembryonen oder postnatale Maus retinalen Explantate 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Während der Netzhaut Explantate von erwachsenen Tieren aus einer Vielzahl von Arten , einschließlich Maus, Ratte und Zebrabärbling haben für verschiedene zellbiologische Ansätze 17, 18, 19, 20, Live-Cell - Imaging Experimente mit retinalen Explantate ha genutzt wordenve beschränkt Zeiträume zu kurz und nicht kontinuierlich über mehrere Stunden 21 ausgeführt worden ist , 22. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch Retina Abbildung lebender Zellen Experimente Überwachung INM mit Multi-Photonen - Mikroskopie 6 durchzuführen. Live - Cell - Imaging-Ansätze sind vorteilhaft gegenüber immunhistochemischen Methoden , wenn die Mechanismen zu untersuchen INM Controlling, wie die Dynamik des INM, zum Beispiel Geschwindigkeiten betroffen sein könnten , anstatt die Lage der Mitose, die würde möglicherweise nicht mit Immunzytochemie nachgewiesen werden.
In der Zukunft hat dieses Verfahren auch das Potential geändert werden zu studieren andere dynamische Vorgänge bei Netzhautregeneration, wie Phagozytose von Photorezeptoren durch Müller Glia oder das Verhalten von Mikroglia sterben.
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Protocol
Hinweis: Zebrabärblinge wurden angehoben und in der Notre Dame Zebrabärbling Anlage im Freimann Life Sciences-Center erhalten. Die Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und sind in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Forschung Vision von der Association for Research in Vision and Ophthalmology genehmigt.
1. Lösungen
- Bereiten Sie 70% Ethanol, um die Gewebekultur Haube zu sterilisieren und alle Geräte / Reagenzien, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden.
- 2 mL 2-Phenoxyethanol auf 1 L des Systems Wasser (1: 500 2-Phenoxyethanol).
- Bereiten 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Verwenden einer 10 ml-Spritze und einer 0,2 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter die Lösung in eine sterilisierte Gewebekulturhaube zu sterilisieren.
HINWEIS: NaHCO 3 verwendet effizient die Zell- und Gewebeklebstoff auf der Deckfläche zu verteilen von fluorodishes (sieheSchritt 3.2). - Bereiten 1,0 M CaCl 2 und 1,0 M MgCl 2. Sterilisieren mit einer 10 ml-Spritze und 0,2 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter in einem sterilisierten Gewebekulturhaube.
- Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS), fügen Sie sterile CaCl 2 und sterile MgCl 2 bis 1x HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+, ohne Phenolrot bei einer Endkonzentration von 1 mM jeder vorzubereiten. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung.
- Um Kulturmedium herzustellen, mischen 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) ohne Phenolrot, 25% HBSS enthaltend CaCl 2 und MgCl 2 (siehe Abschnitt 1.4), 25% Pferdeserum (HS), 10 Einheiten / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung.
HINWEIS: Vermeiden Medium, das Phenol-Rot, wie es autofluoresces, wodurch Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinflussen. 23 - Bereiten Sie 10 ml 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x MEM ohne Phenolrot. Melt Agarose / 1x MEM mit einem microwave. Bereiten kleine Volumina von Agarose (zB 10 ml) als sich wiederholende Nacherwärmung wird lonenkonzentrationen aufgrund von Flüssigkeitsverdampfung verändern.
- Vor der Kultivierung sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im Autoklaven.
2. Licht-Schaden Paradigm
- Dark-Anpassung
- Legen Sie 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling (oder einer anderen transgenen Zebrafisch von Interesse) mit einem 6 - 14 Monate alt , in einer Umgebung frei von Licht für 14 d. Für weitere Detail Bezug nehmend auf 2, 6, 24, 25.
- Positionieren Sie den Tank mit 2 - 3 dunkeladaptierten transgenen Zebrafisch in System Wasser zwischen zwei Leuchtstofflampen , die Licht von 2.800 Lux emittieren 2, 6, 24, 25. Expose Zebrabärblingen konstant intensives Licht für 35 h. Während der Belichtung, sicherzustellen, daß die Wassertemperatur zwischen 31 aufrechterhalten wird - 33 ° C.
3. Vorbereitung für Anzucht (Am Tag der Retinal Isolation)
- Mit 70% Ethanol, sterilisieren die Gewebekultur Haube und die Komponenten / Werkzeuge, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden (zB Flaschen mit MEM und HBSS, Pipetten, sterile Pipettenspitzen, usw.).
- Herstellung von fluorodishes
- Mantel ein fluorodish für jede Netzhaut mit Zell- und Gewebekleber (siehe Tabelle der Materialien).
- Verdünne die Zell- und Gewebekleber in 0,1 mM NaHCO 3 zu einer Endkonzentration von 70 ug / ml, werden 50 & mgr; l zu jedem fluorodish und verteilt die Lösung in der Mitte der fluorodish mit einer 200 & mgr; l - Pipettenspitze (etwa 1-1,2 cm Durchmesser ).
- Inkubieren der beschichteten fluorodishes mit 1 - 3 h bei RT; (Alternativ O / N bei 4 ° C inkubieren).
- Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie 3x mit 500 ul 1x MEM für jede Wäsche. Um zu vermeiden, um die beschichteten fluorodishes vor dem Austrocknen, halten sie in MEM bis retinalen Explantate montiert sind.
- Bereiten Kulturmedium, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Das Kulturmedium kann für bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden.
4. Isolierung und Kultivierung von Retinal Explantate
HINWEIS: Das Protokoll ist unten beschrieben zur Isolierung der dorsalen Netzhaut, die das Netzhautregion, die überwiegend durch die beschriebene Licht-damage Paradigma läsionierten wird. Daher kann eine Beschädigung induzierte Proliferation und das zugehörige Ereignis von interkinetic Atommigration auftreten, in der dorsalen Retina. Netzhautregionen zu erhalten entsprechend den spezifischen Anforderungen der Forscher / Forschungsfrage kann jedoch die Isolierungsverfahren eingestellt werden.
- Euthanize ein lichtgeschädigter transgenen Zebrafisch einta Zeit in 1: 500 2-Phenoxyethanol.
- Entfernen von einem MEM fluorodish mit einer 1,000 & mgr; l-Pipette, so dass nur ein dünner Film von Flüssigkeit verbleibt.
- Übertragen Sie die Zebrabärbling auf ein trockenes Papiertuch, entfernen Sie das Auge mit einem gebogenen Paar Dumont Zange (Zange # 5, 45 ° Winkel) und übertragen sie auf den fluorodish.
- Mit Hilfe eines Stereomikroskops, richten das Auge mit der Pupille auf dem Deckglas des fluorodish so , dass die Rückseite des Auges mit dem Sehnerv sichtbar ist (Abbildung 1D).
- Mit einem Paar McPherson-Vannas Schere entfernen Sie den Sehnerv, Schneiden nahe an der Rückseite des Auges. Außerdem entfernen Bindegewebe die Außenseite des Auges auskleiden.
- Halten Sie das Auge zwischen den nasalen und temporalen Seite mit einem Paar # 5 Zange , während ein Schnitt an der Optik Stiel zu machen , indem sie mit einem Scherenblatt durch die Lamina cribrosa Lochen und Schneiden entlang sowohl der nasalen und temporalen Seiten des Auges (siehe Abbildung 1E , segmentierte line).
- Die Verwendung von zwei Paaren von # 5 Zange, eine für die dorsale Seite der Netzhaut hält und das andere Paar die ventral von der dorsalen Retina zu trennen, um das Gewebe zu ziehen.
HINWEIS: Es ist ratsam, die dorsal Netzhaut zu orientieren, so daß die Linse und die Ganglienzellschicht der Deck Gesicht während der Sklera nach oben zeigt. - Entfernen Sie die Sklera von der dorsalen Retina mit einem Paar von # 5 Zange, während die Linse hält , die mit einem zweiten Paar von # 5 Zange (Abbildung 1 H, I) an der Netzhaut verbunden ist.
- Um das Objektiv zu entfernen, verwenden McPherson-Vannas Schere und hinter der Linse schneiden , ohne die Netzhaut zu beschädigen (1I, J). Manchmal löst sich die Linse in Schritt 4.7. In diesem Fall entfernen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Pinzette durch die Netzhaut an einer Schnittkante mit einem zweiten Paar von # 5 Pinzette.
- Entfernen Sie den Glaskörper, während die Linse zu entfernen, ohne die Netzhaut schädigen. Flatten die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht mit Blick auf das Deckglasder fluorodish (Figur 1L, M).
- Surround die Netzhaut mit 10 & mgr; l von 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und lassen Sie die Agarose erstarren.
- Beobachten Sie, dass die flüssige Agarose nicht die Netzhaut abhebt als auch eine leichte Erhöhung der Fähigkeit beeinträchtigen könnten tief in das Gewebe zu fokussieren. Wenn Hebe beobachtet wird, verwenden Sie eine Pipette Agarose zu entfernen. Lassen Rest Agarose-Set, bevor Sie mehr hinzuzufügen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.12 mehrmals vor dem 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Zugabe des gesamten fluorodish zu decken. Nach Erstarren der Agarose, 1,5 mL Kulturmedium.
- Pflegen Sie die Netzhaut Explantation Kultur in einem 5% CO 2 / Umgebungsluft bei 32 ° C eingestellt für ca. 12 h die Netzhaut zu ermöglichen , von dem Stress , der durch die Isolationsverfahren entstanden zu erholen. Stellen Sie die Temperatur auf 32 ° C Netzhäuten bei der gleichen Temperatur wie Licht behandelt Zebrabärbling zu halten (siehe Schritt 2.3).
5. Multiphotonen-Mikroskopie
Tabelle der Materialien), ein 40X Apo Fernwasser - Tauchziel (NA 1.15), ein Galvanometer - Scanner und eine komplett ausgestattete optimiert Klimakammer, die einen Einsatz für vier 35-mm-Petrischalen enthält. Die Bilder wurden mit einem nichtdescannte Detektor (R-NDD) erworben.
- Vor der Bildgebung, ins Gleichgewicht der Umweltkammer , die eine 5% CO 2 / Luftatmosphäre zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass leere Petrischalen in die Halterung eingesetzt werden Austritt von Gas in den Raum zu vermeiden.
- Schalten Sie das Mikroskopiesystem.
- Sobald die Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht wird, fügen Brechungsindex Flüssigkeit auf die 40X Apo Fernwasser-Tauchziel (NA 1.15).
HINWEIS: Der Brechungsindex Flüssigkeit mit optischen Eigenschaften ähnlich wie Wasser verwendet wird während der Langzeitabbildungsverdampfung von Wasser zu vermeiden. - Platz Grippeorodishes mit Retina-Explantate in die Kammer. Mit Hellfeld Licht, positionieren Sie die Probe in den Lichtweg und bringen den Mittelbereich der dorsalen Retina in der Fokusebene.
- Verwenden GFP epifluoreszenten Licht auf GFAP zu konzentrieren: nGFP -Positive Müller Glia Kerne (2A, C).
HINWEIS: Wenn Explantate nicht montiert sind flach oder Agarose unter der Explantation angesammelt hat , wird es schwierig sein , auf die GFAP zu konzentrieren: nGFP -positiver Kerne oder sie werden schwach fluoreszieren.- Überprüfen Sie, ob innerhalb der gleichen Netzhaut Explantation zu einem anderen Bereich bewegt, wird die Fokussierung Problem überwinden. bewegen Andernfalls zu einem anderen Netzhaut Explantation.
- In der Bildaufnahme-Software, öffnen Sie die "A1 MP GUI ', die' TiPad ', die' A1 Compact GUI" und der "ND Erwerb 'Fenster. Für Multi Bildgebung, sicherzustellen, dass die "IR NDD 'Option im' A1 Compact GUI 'gewählt wird.
- In der "setting 'Feld wählen IR-DM für die 1 dichroitischen Spiegel st und wählen Sie das Bandpassfilter 525/50 GFP - Fluoreszenz zu erwerben.
- Schalten Sie den IR-Laser im Fenster mit der Bezeichnung "A1MP GUI". Es dauert ein paar Minuten dauern, bis der Laser bereit zu sein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 910 nm GFP-Fluoreszenz zu erregen und den Laser auszurichten, indem die 'Auto Ausrichtung "Taste in der" A1 MP GUI' Fenster klicken.
- Stellen Sie sicher, dass Raum und Ausrüstung Lichter ausgeschaltet sind oder abgedeckt, bevor Sie den Auslöser in der "A1 MP GUI 'Öffnen Überbelichtung des Photovervielfacherröhre zu vermeiden. Um den Lärmpegel, beherbergen das Mikroskop in abgedunkelter Umgebung zu reduzieren.
- Erwerben Bilder von einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixel, bei einem Zoom von zwei und einer Pixel Verweilzeit von 4,8 & mgr; s / Pixel. Etwa die Laserleistung Fenster durch Änderung der "Erwerb Bereich" in der "A1MP GUI" und die Verstärkung in der 'A1 Compact GUI' eingerichtet.
- Einrichten des Z-Stapel
- Konzentrieren Sie sich auf das Ganglion Zellschicht der oberen Brennebene des Z-Stapel zu setzen in der 'Z'-Subwindow innerhalb des "ND Erwerb' Fenster. Einige GFAP: nGFP -positiven Zellen werden typischerweise in der Ganglienzellschicht befindet, welche die basale Grenze der Netzhaut (2A, D) zu identifizieren hilft.
- Bewegen , um die Fokusebene durch die Ebene der ONL (2A, B), die durch die Gegenwart von schwach markierten GFAP gekennzeichnet ist: nGFP -positiven Zellen , die rund sind und vergrößert relativ zu ihren Gegenstücken in der INL (2A, C) .
- Setzen Sie diese Ebene wie die Unterseite des z-Stack. Sicherzustellen , dass der gesamte ONL wird abgebildet (2A, B).
- Wenn Fokusebene Verschiebungen auftreten, die erfordern, während der Abbildungsperiode neu eingestellt wird, doppelklicken Sie auf die mittlere Position in der 'z' Subwindow es als die "Heimat" Position zuzuweisen. Wechseln Sie in "symmetrischen Modus definiert 'und klicken Sie auf "relative".
- Stellen Sie die z-Schrittweite zwischen 0,7 bis 1 um.
- Z-Intensität Korrektur:
- Wenden Sie z-Intensität Korrekturen für den Verlust der Pixelintensität zu kompensieren aufgrund der Lichtstreuung bei der Abbildung in den tiefen Schichten des Gewebes.
- So stellen Sie die Korrektur nach oben, öffnen Sie die "z-Intensitätskorrektur 'Fenster. So stellen Sie die 'z-Stack-Bereich ", wählen Sie" Aus ND'.
- Klicken Sie auf den unteren Brennebene in der "z-Intensitätskorrektur 'Fenster (in diesem Fall entspricht der Ganglion-Zellschicht) und stellen Sie die Laserintensität (" Erwerb Bereich "in der" A1MP GUI) und die Verstärkung (A1 Compact GUI ).
- Klicken Sie auf den Pfeil neben den 'z-Werte "in der" z-Intensitätskorrektur' Fenster, um die Einstellungen zu bestätigen, die später unter dem Posten "Geräteeinstellungen" in der "z-Intensitätskorrektur" Fenster für die gewählte Brennebene sind.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die Mitte einnd oberen Ebenen, die Erhöhung der Laserleistung und der Verstärkung. Weitere Fokusebenen können bei Bedarf hinzugefügt werden. Siehe Tabelle 1 für bestimmte Laser und Verstärkungseinstellungen für Experimente in den Figuren 2 bis 4.
- Stellen Sie den "Erwerb Bereich" in der "A1 MP GUI 'Fenster. Vermeiden einen Erfassungsbereich größer als 15 und einen Verstärkungsfaktor höher als 126 zu Beginn der Bildgebungs Auswahl zu umgehen Photobleaching und eine erhöhte Geräuschentwicklung.
HINWEIS: Laser und Photomultiplier-Röhren unterscheiden zwischen Mikroskopiesysteme, Test Laser und Verstärkungseinstellungen optimale Abbildungsbedingungen für das Mikroskop, während Photobleichens Vermeidung einrichten zu erhalten. - Wählen Sie "relative Intensitätskorrektur" in der "z-Intensitätskorrektur 'Fenster.
- In der "Zeitreihen" Subwindow im Fenster "ND Erwerb", stellen Sie die Dauer bis 8 h und das Intervall auf "ohne Verzögerung". Dann stellen Sie sicher, dass die "Run z-Korrektur" in t zu klickener 'z-Stapel "Unterfenster im" ND Erwerb "Fenster, um die 3-D-Zeitreihen zu erwerben.
- Pflegen retinalen Explantate bei einer Temperatur von 27 - 29 ° C während der gesamten Dauer der Bildaufnahme.
- Während des gesamten Bildaufnahmeperiode, falls erforderlich, neu einzustellen, den Leistungspegel und Verstärkung, um die Bildqualität für die Post-Imaging-Analyse zu erhalten. Für Anpassungen führen Sie die Schritte 5.11.2 - 5.11.4.
- Wenn die Fokusebene verschiebt, Pause oder den Lauf zu stoppen und Schritt 5.11 erneut durchführen.
HINWEIS: Wenn "relative z-Korrektur" in 5.12.7 Schritt gewählt wurde und Schritt 5.11.4 war es nicht notwendig, durchgeführt sollte Macht und Gewinn Ebenen, es sei denn, umfangreiche Photobleichens aufgetreten neu zu justieren.
6. Analyse der Geschwindigkeit
- Extrahieren Sie die Zeit, eine "Region of Interest" auf der Bildeinstellung. Verwenden Sie die "Zeitmessung" Werkzeug und exportieren Sie die Zeitwerte in eine Tabelle.
- Crop eine Region, die eine di enthältViding GFAP: nGFP -positiver Kern.
- Wählen die beschnittene Bereich, so dass sie mindestens einen Kern enthält, der nicht INM erfährt, um einen Referenzpunkt zu setzen, um anschließend die Abstände zu messen, die die Trennkern in Bezug auf die basale INL migriert. HINWEIS: einen Kern zu wählen, die in der basalen INL bleibt, hilft es, ein 3-D-Rekonstruktion der Zeitreihe vorzubereiten.
- Alternativ kann , wenn ein GFAP: nGFP -positiver Zelle in der ONL im gesamten Erfassungszeitraum beobachtet wird, eine vertikale Linie mit fester Länge aus dem ONL Kern zu den basalen INL Spanning verwenden , um einen Bezugspunkt zu identifizieren.
- Mit der Funktion 'show Scheiben Ansicht', erzeugen orthogonalen Projektionen. Anschließend ändern Sie den Modus von "Scheibe" auf "Maximum Intensity Projection '.
- Drehen Sie den 'xy' Ansicht der orthogonalen maximalen Projektion. Je nach Ausrichtung, bei der die wandernde / Dividieren Kern ist am besten sichtbar ist, einelso ausschalten entweder die 'xz'- oder die "yz'-Ansicht.
- Klicken Sie auf das restliche Bild mit der rechten Maustaste und extrahieren Sie die 'xz' oder 'yz'-Bild-Serie mit dem "Neues Dokument erstellen aus dieser Sicht' Funktion. Falls erforderlich, wird das Bild gedreht.
- Mit Hilfe der "manuellen Messung" Funktion, ziehen Sie eine horizontale Linie quer über das Bild auf der untersten Ebene des Kerns , die in den basalen INL bleibt und unterliegen nicht INM (= Bezugspunkt; 4A - E, Linie rot horizontal).
- Messen Sie den Abstand zwischen der Bezugslinie und der basalen Punkt des migrierenden Nukleus für die Zeitreihen der "Line - Messung" Werkzeug in der Analyse - Software (siehe Abbildung 4A - E).
- Sobald die Kernhülle bricht, messen Sie die basale Stellung des Somas, wenn es nach der Diffusion von GFP in der gesamten Zelle identifizierbar ist.
- ein Tabellenkalkulations-Software verwenden, zeichnen den Abstand a nuCleus migriert gegen die Zeit vergangen (4F).
- Zur Bestimmung der apikal Wanderungsgeschwindigkeit (v a), Graph die Abstände für die Zeit vor der Kernhülle Zusammenbruch gereist auftritt (4G).
- Wählen Sie die Datenreihe im Diagramm mit der rechten Maustaste klicken und legen Sie eine lineare Regressionskurve einschließlich der 'y = mx + c' entsprechende Funktion. Die Steigung 'm' in der Funktion steht für die Geschwindigkeit v a (4G).
- Wiederholen Sie die Schritte 6.11.1 und 6.11.2 für die erste Phase der schnellen Migration basalen die basale Migrationsgeschwindigkeit, v b (4H) zu bestimmen.
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Representative Results
Die Isolierung der Netzhaut nach dem Verfahren in der schematischen Darstellung in Figur 1 skizziert ermöglicht die Kultivierung eines abgeflachten dorsal Retina von lichtgeschädigter adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling über einen Zeitraum von mindestens 24 h in einer 5% CO 2 / Luft - Umgebung. Diese flachen montierten retinalen Explantate können Bildbrennebenen bei tiefen Gewebespiegel verwendet werden. Ein Beispiel ist Müller Glia / Kerne neuronalen Progenitorzellen mit GFP von der Glia-spezifische Müller markierten Promotor GFAP (glial fibrillary acidic protein) , das in der ONL während der Mitose in der lichtgeschädigten Retina befinden (Figuren 2A - D, 3). Um weiter zu bestätigen , dass dieser Ansatz zur Abbildung der verschiedenen Netzhautzellschichten, akut isolierten retinalen Explantate anwendbar ist , wurden aus unbeschädigten Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] vorbereitet nt19 Zebrabärbling Augen , die EGFP in Stäbchen - Photorezeptoren exprimieren unterdie Rhodopsin - Promotor. Figur 2E - H zeigt , dass es möglich ist , Bilder von GFP-positive stabPhotoRezeptors zu erfassen und ihre inneren Segmente. Als Stabinnensegmente zwischen Zapfen-Photorezeptoren in Richtung des retinalen Pigmentepithel verlängern, würde bedeuten, diese Daten, dass es auch möglich ist, Bild Zapfen-Photorezeptoren. Dies war jedoch nicht weiter untersucht.
Beobachtet Müller Glia / neuronale Vorläuferzellkerne in der ONL im lichtgeschädigter Netzhaut zu haben, sind wir für ihr Migrationsverhalten im Detail (Abbildung 3 und Film 1). Müller Glia / neuronaler Vorläuferzellkerne von GFP markierten migrieren bidirektional zwischen der Basisposition des INL, wo sie in der Regel befinden und die ONL, der Stelle der Photorezeptorverlust. Typischerweise GFAP: nGFP -positiver Kerne gewandert eine kurze Strecke in der INL (3A - C) , bevor sie unterzogKernhülle Abbau, während sie noch in der INL positioniert ist , basierend auf der Verteilung der GFP in das Zytoplasma der gesamten Müller Glia / neuronale Vorläuferzelle (Abbildung 3D). Folgende Zellteilung in der ONL, zwei GFAP: nGFP -positiven Kerne sichtbar wurde in der ONL (3F, G), die auf die basale INL (3H - J) zurückgeführt . Bei der Zellteilung waren die neu entstehenden Kerne zunächst sehr schwach und daher schwer zu identifizieren (Abbildung 3G). Doch innerhalb von ein bis zwei Zeitrahmen nach der Mitose, Kern GFP - Fluoreszenz wurde hell, was die Visualisierung der Kernmigration (3H - J) aktiviert. Abbildung lebender Zellen erlaubt auch die Visualisierung der Teilungsebene (3F, G), die horizontal für die Zelle an die apikale Oberfläche der Netzhaut in 3 gezeigt aufgetreten ist . Es ist auch denkbar andere transgene Zebrafischlinien, zu verwendenals Tg [GFAP: EGFP] NT11 Zebrabärbling dass GFP im Zytoplasma exprimieren (Daten nicht gezeigt). Obwohl es möglich ist, zuverlässig zu apikalen Bewegung und horizontalen Zellteilungen bestimmen, ist es oft schwierig, genau die Position der basal Migration Tochterkerne und vertikalen Zellteilungen in der Tg identifizieren [GFAP: EGFP] NT11 Zebrabärbling Retina (Daten nicht gezeigt).
Um die Geschwindigkeit zu bestimmen, ein GFAP: nGFP -positiver Kern , die nicht während des gesamten Aufzeichnungsperiode migriert haben als Bezugspunkt (Stern, 4A - E) gewählt. Der Abstand des migrierenden Kern (senkrechte rote Linie, 4A - E) wurde in Bezug auf die Referenz GFAP bestimmt: nGFP -positiver Kern (horizontale rote Linie, 4A - E) zu jedem Zeitpunkt der Bildserie auf maximal xz oder yz-Projektionen (je unter welchem Winkel die Kerne könnte Visualized am effizientesten). Der Abstand, der Kern migriert wurde gegen die Zeit in einer Tabelle aufgezeichnet (4F - H). Kernmembran Abbau wurde häufig in dem Diagramm als Anfangs basalward Bewegung beobachtet aufgrund der Neuverteilung von GFP in der gesamten Zelle (basal größten Teil des Zellkörpers in diesem Fall). Die apikale Geschwindigkeit wurde vor Kernhülle Abbau bestimmt, eine lineare Regressionskurve (grau gepunktete Linie, 4G) passend zum Abstand gegen die Zeit für die Zeit vor der Kernhülle Zusammenbruch (rote Diamant, 4G) aufgetragen. Die Steigung 'm' der linearen Regressionskurve (y = mx + c) stellt die Geschwindigkeit dx / dt '. Die apikale Geschwindigkeit für die Zelle , dargestellt in Figur 4 betrug 10,89 & mgr; m / h. Der gleiche Ansatz wurde angewendet , um die Geschwindigkeit der anfänglichen schnellen basale Bewegung (v b) der neu gebildeten Tochterkerne (4F, zu berechnen H). Die basale Wanderungsgeschwindigkeit v b von -67,71 und 33,51 & mgr; m / h von Tochterzellen D1 und D2 wurden jeweils vergleichsweise schneller als der apikalen Geschwindigkeit. Leider war es nicht möglich, die apikal Geschwindigkeit nach Kernhülle Zusammenbruch wie das GFP in der gesamten Zelle diffundieren zu bestimmen. Stattdessen wurde die Momentangeschwindigkeit basierend auf der Zeitsteuerung und der Position des Kerns vor der Kernhülle Abbau und die erste Visualisierung der neu gebildeten Tochterkerne berechnet. Die Momentangeschwindigkeit von 7,9 um / h für die Zelle in Figur 4 gezeigt ist wahrscheinlich eine Unterschätzung als das Chromatin der ONL vor der Telophase der Mitose erreicht, wenn die Tochterkerne sichtbar werden.
Zusammenfassend ermöglicht die Kultur der retinalen Explantate Abbildung lebender Zellen von INM im erwachsenen Zebrafisch Retina regenerieren und die Bestimmung der Migration und Zellteilung pametern der einzelnen Kerne.
Abbildung 1: Retinal Isolierungsverfahren. A) Schematische Darstellung eines Zebrabärbling Kopf mit seinem Auge. B) Das Auge wird von der Zebrabärbling entfernt und orientiert sich an der Vorderseite des Auges mit dem Schüler zu zeigen. C) Drehen Sie das Auge 180 ° , so dass die Rückseite des Auges mit dem optischen Stiel (gefüllt schwarzer Kreis) wird sichtbar in (D) und die Pupille nach unten gerichtet ist . Die graue Farbe zeigt das Vorhandensein der Sklera des Auges. E) eine Klinge aus einem Paar von McPherson-Vannas Schere wird in den optic Stiel des Auges (gefüllten schwarzen Kreis) eingefügt in seine dorsalen und ventralen Seiten zu schneiden , die durch den weißen segmentierte Linie angedeutet ist. F) dorsale Hälfte des Auges nach der ventralen Hälfte entfernt wurde. Der schwarze Halbkreis zeigt ter Rest Teil der Optik Stiel. G) Schalten Sie das Auge 90 ° nach hinten zu offenbaren (H) , um das Innere des Auges mit der Retina (braun), Glaskörper (nicht dargestellt) und die Linse (L, hellgrau Kreis) , die immer noch von der Lederhaut (graue Linie eingeschlossen ist ). I) Die Sklera abgelöst wurde (beachten Sie , graue Linie fehlt) und J) die Linse und Glas entfernt, die zu nur der Netzhaut (braun). K) Retina um 90 ° nach vorne in eine flache Montage Ansicht der dorsalen Retina (L) führt. M) Dorsal retinalen Explantation Flach montiert auf einem Glasboden - fluorodish. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: 3-D - RekonstruktionRetinal Multiphotonenionisation Z-Stacks. A) 3-D - Rekonstruktion eines Multi z-Stapel Bilderserie von GFAP: nGFP- positiven Zellen in der Netzhaut ganz-mount Kulturen von Zebrabärbling nach 48 h Lichtschäden. B - D) Einzel Multiphotonen- xy-Bilder von GFAP: nGFP -positiven in der 3D-Rekonstruktion angezeigt Zellen in (A) auf der Höhe des ONL (B), der INL (C), die zu der Schicht entspricht , die Müller enthält Glia Soma und der GCL (D). Pfeil in (B) zeigt eine vergrößerte Runde Müller Glia in der ONL nach Kernhülle Zusammenbruch. E) 3-D - Rekonstruktion eines Multi z-Stapel Bildserie eines retinalen Explantation von unbeschädigtem Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 Zebrabärbling. F - H) Einzel Multiphotonen- xy-Bilder auf der Ebene der Stabinnensegmente (RIS, F), Stabkernschicht (GUnd) auf der Höhe der inneren Retina (H). GCL, Ganglion Zellschicht; INL, Innere Kernschicht; ONL, äußere Kernschicht; RIS, Rod innere Segment. Maßstabsbalken in A, D, E und H, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Timelapse Bildfolge von INM. A - J) Bild - Serie von 3D-Rekonstruktion von Z-Stapel Timelapse Serie Anzeige Tg [GFAP: nGFP] mi2004 -positiver Kerne , die INM durchlaufen in der Netzhaut Explantate (obere Reihe) in der ONL zu teilen. Die Position einer apikal Migration Kern und seine Migration basal Tochterkerne wird durch rote Pfeile angedeutet. Roter Stern zeigt während der Mitose Kernhülle Zusammenbruch. A - J, untere Reihe) DieSerie gleiche Bild wie in der oberen Reihe war übersättigten und zugeschnitten auf den sich teilenden Zellen in der ONL zu fokussieren. INL, Innere Kernschicht; IPL, inneren plexiformen Schicht; ONL, äußere Kernschicht. Maßstabsbalken in A, 10 & mgr; m und ist für B - J. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Analyse von Apical und Basal Wanderungsgeschwindigkeit. A - E) Maximum yz-Projektion eines z-Stapel Bild Reihe von Tg [GFAP: nGFP] mi2004 retinalen Explantate an verschiedenen Zeitpunkten der Zeitrafferaufzeichnung durch Multiphotonenmikroskopie erfasst. Mit Hilfe der Zeilentool unter der Funktion "manuelle Messung", wurde eine horizontale Linie auf der Ebene der Referenzzelle platziert, mit einem Stern gekennzeichnet. Eine vertikale michasurement Linie wurde auf der horizontalen Linie positioniert beginnend und sich bis zu den basalen Position des migrierenden GFAP: nGFP -positiven Kern. Die Länge der Messleitung ist in den weißen Feldern auf die Bilder und zur besseren Lesbarkeit unter den Bildern gegeben. L1 = Länge, die Tochterzelle 1 migriert; L2 = Länge, die Tochterzelle 2 migriert. F) Entfernung , dass die Zelle (F0) , gemessen in (A - E) migriert apikal und dass die entstehenden Tochterzellen D1 und D2 basal in der Multiphotonen- Timelapse Aufnahme migriert. Die rote Linie zeigt die Messungen , für die die apikale Wanderungsgeschwindigkeit (v a) berechnet wurde , während die schwarzen und grauen Linien die Messungen zeigen die basale Wanderungsgeschwindigkeit (v b) für D1 bzw. D2 zu berechnen. G, H) Der Abstand wurde aufgetragen gegen die Zeit in Excel für apikale Migration vor Kernhülle Zusammenbruch (G) und die Phase des schnellen basalenMigration für Tochterzelle D1 (H). Eine lineare Regressionskurven wurden eingebaut und die Funktionen sind unter den Graphen mit der Steigung, die die Geschwindigkeit gegeben. INL, Innere Kernschicht; IPL, inneren plexiformen Schicht; ONL, äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Tg [GFAP: EGFP] NT11 | Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] nt19 | ||||||||
| Laserleistung | gewinnen | Laserleistung | gewinnen | ||||||
| Top (Stange Photorezeptor) | 13 | 126 | 3.5 | 118 | Middle (Müller Glia) | 10 | 126 | 2.8 | 118 |
| Unten (GCL) | 8 | 126 | 2.1 | 118 | |||||
Tabelle 1: Laser und aussteuern Verwendet für Z-Intensity Korrekturen bei den verschiedenen Ebenen für die in den 2 angezeigt Experimente - 4.
Film 1: Bildgebung lebender Zellen von Retinal Explantate durch Multiphotonenmikroskopie. (Rechtsklick zum Download).
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Discussion
Studien , die Mechanismen zu untersuchen Leitungs Regeneration des geschädigten erwachsenen Zebrabärbling Retina überwiegend eingesetzten immunzytochemische Methoden 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Festlegung der Bedingungen, die mit Retina-Explantate Kultur und Live-Cell-Imaging auf Phänomene, wie INM, geben Sie uns eine Technik zur Durchführung in der Tiefe räumlichen und zeitlichen Informationen zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Migrationsgeschwindigkeiten Bestimmung des Zeitpunkts und der Position der Kernhülle Abbau während der Prophase der Mitose und die Länge und Position der Zellteilung. Darüber hinaus ist es möglich, die Teilungsebene und das Schicksal der entstehenden Tochterzellen in Bezug auf ihre spätere Lage herzustellen. Letztlich wird diese leistungsstarke Ansatz festzustellen, ob M2; ller Glia und neuronale Vorläuferzellen verhalten sich unterschiedlich in Bezug auf INM bei Netzhautregeneration. Die Verwendung von transgenen Zebrafisch Linien , die proliferierenden Zellen in der Retina Regenerieren wird Dechiffrieren Differentialverhalten 6 bei verschiedenen Stufen der Regenerationsreaktion zu identifizieren helfen. Im Fall des Multiphotonen-Mikroskop hier GFP reporter Zebrabärbling Leitungen verwendet werden als Anregung von Red Fluorescent Protein (RFP) bevorzugt, ist nicht sehr effizient; aber auch andere Multisysteme können effiziente Anregung von RFP oder gleichwertige Fluorophore ermöglichen.
Einer der kritischen Schritte in dem Netzhautisolierungsverfahren wird der Netzhaut befestigen. Retinae haben so flach wie möglich montiert werden für die Multiphotonen-Licht auf die tieferen z-Ebenen des ONL passieren zu können. Krümmen der Netzhaut vor allem im Randbereich, Rest glasigen und / oder Ansammlung von Agarose unter der Netzhautkultur, die die zur Immobilisierung verwendet wird,Gewebe, führen am häufigsten zusätzlichen Platz zwischen dem Deckglas und der Netzhautkultur. Darüber hinaus erhöhte Laserleistung und Verstärkung müssen verwendet werden, um Bilder zu erwerben, wenn die Netzhaut nicht flach ist, und dies wird folglich erhöht Photobleaching und eine verminderte Lebensfähigkeit der retinalen Kultur führen. Falsche Montage führt oft auch zu einer schlechteren Bildqualität aufgrund reduzierter Durchdringung Licht und die Fähigkeit beeinflussen, die Abstände zu messen, die Kerne gewandert waren und daher die Berechnung der Wanderungsgeschwindigkeiten.
Die Geschwindigkeiten der apikalen Migration vor Kernhülle Abbau und der basalen Migration zuverlässig in einer Bildserie von Tg bestimmt werden [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling retinalen Explantate. Allerdings ist es derzeit nicht möglich, die Geschwindigkeit der apikalen Migration des Chromatins nach Kernhülle Zusammenbruch in dieser transgenen Zebrabärbling Linie wie die GFP neuverteilt im gesamten Zytoplasma zu bestimmen. LABÉLIng der retinalen Explantate mit dem Kernfarbstoff Hoechst führte zu dim Aufnahme in Müller Gliazellen Kerne, die die Veränderung der Wellenlänge 830 nm (Lahne & Hyde, nicht veröffentlichte Daten) erforderlich, die die Lebensfähigkeit des Gewebes beeinträchtigt und verursacht ein Abwürgen des Zellzyklus ( Lahne & Hyde, nicht veröffentlichte Daten). Während Entwicklung der Retina, Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 Zebrabärbling , die GFP - Histon 2 fusioniert exprimieren wurden INM erfolgreich zur Überwachung und Wanderungsgeschwindigkeiten in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus 12, 31 bestimmen. In Zukunft retinalen Explantate von Tg [h2afva: h2afva-GFP] kca6 Zebrabärbling wird auch die Visualisierung von Chromatin während des Zellzyklus aktivieren und die Analyse der apikalen Wanderungsgeschwindigkeit nach der Kernmembran Abbau in adulten Regenerieren Zebrabärbling Retina ermöglichen.
Nachdem wir die Voraussetzungen geschaffen INM zu überwachen, indemLive-Cell-Imaging in Retina-Explantate von lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch und die entsprechende Analyse der Geschwindigkeiten wird die Grundlage bilden, der Mechanismen, die INM zu untersuchen. Einige Studien begann die Mechanismen der INM im Erwachsenen untersuchen Retina Regenerieren Immunzytochemie mit der Position der mitotischen Phospho-Histon - 3-positiven Kerne 6, um zu bestimmen , 7. Jedoch mit Signalwegen zu stören kann die Position der Mitose nicht übertragen, sondern können auch andere Parameter wie Geschwindigkeit, Zeitpunkt der Mitose und Division beeinflussen, die nicht möglich wäre / sehr schwierig durch Immunzytochemie zu erkennen. Zuvor war es , dass Phospho-Histon - 3-positive mitotischen Kerne 11 bis basaleren Positionen in der Entwicklung von Netzhaut in Dynactin Mutanten und morphants mislocalized gezeigt. nachfolgende Bildgebung an lebenden Zellen ergab jedoch, dass die Kern Migration vor der Zellteilung wurde in Dynactin geschwächten Zelle verzögerts, während eine erhöhte apikalen Wanderungsgeschwindigkeit Kerne aktiviert zu erreichen und die Zellteilung an der apikalen Oberfläche 11, 12 zu unterziehen. In diesem Beispiel wird ein Beispiel für die Macht der Live-Cell-Imaging. Wenn in ähnlicher Weise die Mechanismen zu entwirren, die INM im erwachsenen Regenerieren Zebrabärbling Retina zu erleichtern, wird live-cell imaging Studien ergänzen und in verschiedenen Instanzen über, immunzytochemischer Ansätze von Vorteil sein.
Wie oben besprochen, bietet Live-Cell-Imaging viele Vorteile gegenüber immunhistochemischen / statische Methoden; jedoch hat es im Auge zu behalten , dass der Netzhaut Explantate sind ein ex - vivo - Modell. Als solche können sich während der Isolierungsverfahren und / oder Kulturbedingungen entstandenen Schäden zelluläre Prozesse beeinflussen. Darüber hinaus kann das Bilderzeugungsverfahren selbst toxische Wirkungen ausüben , die 23 Zellverhalten beeinflussen können, 32. Während es disadvantages zu Live-Cell-Imaging von Retinal Kulturen, es ist zur Zeit unsere beste Methode dynamische Informationen von INM zu erhalten. Wichtig ist, dass die Live-Cell-Imaging Verfahren der retinalen Explantate auf andere biologische Fragen, die bei Netzhautregeneration angewendet werden. Basierend auf immunzytochemischen Daten wurde es zuvor vorgeschlagen , dass Müller Glia phagozytieren 33 lichtinduzierten Photorezeptorschäden nach Fotorezeptoren / Trümmer zu sterben. leben diese Prozessparameter Bild einstellen werden überprüfen, ob die Phagozytose von sterbenden Photorezeptoren in der regenerierenden Zebrabärbling Retina auftritt und verwendet werden können, die zugrunde liegenden Mechanismen zu studieren. Aufweist , kann gezeigt werden, dass Bilder auf der Ebene der Stabkerne und Stangen inneren Segmente in Tg [rho: Eco.NfsB-EGFP] erworben werden nt19 Zebrabärbling, sollte es möglich sein , die Bedingungen zu Bildphotorezeptor Phagozytose einzustellen. In ähnlicher Weise Wissen ist begrenzt in Bezug auf das dynamische Verhalten von Mikroglia und die Mechanismen ihrer LeitungsFunktion in der degenerierenden und regenerierende Retina 34, 35. Mikroglia-spezifischen transgenen Zebrafisch Ausnutzen in Verbindung mit Live-Cell - Imaging wird auch unser Verständnis der Funktion der Mikroglia bei Erwachsenen erhöhen Zebrabärbling Netzhaut regenerieren 36, 37. Um zusammenzufassen, ist Live-Cell-Imaging von Retinal Explantate ein mächtiges Werkzeug, dynamische Informationen von zellulären Prozessen zu gewinnen und das Verhalten und die Funktion verschiedener Zelltypen in der regenerierende Retina zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir schätzen die Unterstützung durch William Archer und der Notre Dame Integrated Imaging Facility. Besonderer Dank für ihre kontinuierliche Unterstützung und ihre Pflege und Haltung der Zebrabärbling den Freimann Life Sciences Techniker gerichtet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute of NIH DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) und dem Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, University of Notre Dame, Notre Dame, IN unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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