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Developmental Biology

Multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव सेल इमेजिंग के लिए वयस्क ट्रांसजेनिक Zebrafish रेटिना explants की संस्कृति

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55335
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

Summary

Zebrafish रेटिना उत्थान ज्यादातर तय रेटिना का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। हालांकि, इस तरह interkinetic परमाणु प्रवास के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं पुनर्योजी प्रतिक्रिया के दौरान हो और अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग की आवश्यकता होती है। यहाँ, हम multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग Interkinetic परमाणु प्रवासन (INM) वास्तविक समय में निगरानी के लिए संस्कृति और इमेजिंग की स्थिति का वर्णन है।

Abstract

एक अंतर्जात उत्थान कार्यक्रम न्यूरोनल क्षति और मृत्यु के बाद वयस्क zebrafish में मुलर glia द्वारा शुरू की है (Danio rerio) रेटिना। सेल चक्र मुलर glia फिर से प्रवेश करने और न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं है कि कोशिका विभाजन के बाद के दौर से गुजरना और खो न्यूरोनल सेल प्रकार में अंतर पैदा करते हैं। दोनों मुलर glia और neuronal पूर्वज सेल नाभिक उनके डीएनए दोहराने के लिए और एक प्रक्रिया के रूप में वर्णित Interkinetic में रेटिना, यानी वे बेसल भीतर परमाणु परत (लीग) और बाहरी परमाणु परत (ONL) के बीच विस्थापित, क्रमशः, के अलग स्थानों में बँटवारा गुजरना परमाणु प्रवासन (INM)। INM मुख्य रूप से विकासशील रेटिना में अध्ययन किया गया है। वयस्क विस्तार से zebrafish रेटिना regenerating में INM की गतिशीलता की जांच करने के लिए, fluorescently लेबल मुलर glia / न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं का जीना सेल इमेजिंग की आवश्यकता है। यहाँ, हम स्थितियों को अलग-थलग करने के लिए और संस्कृति पृष्ठीय रेटिना प्रदानसे टीजी [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish है कि 35 घंटे के लिए निरंतर तीव्र प्रकाश के संपर्क में थे। हम यह भी पता चलता है कि इन रेटिना संस्कृतियों को लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए, लगातार multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग GFAP के प्रवासी व्यवहार की निगरानी के लिए अप करने के लिए 8 घंटे के लिए रेटिना explant की मोटाई भर Z ढेर छवियों को प्राप्त करने के लिए व्यवहार्य हैं: nGFP पॉजिटिव कोशिकाओं । इसके अलावा, हम के बाद इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए शिखर और बेसल INM के वेग का निर्धारण करने के विवरण का वर्णन। संक्षेप में, हम neuronal उत्थान के एक वयस्क मॉडल में INM की गतिशीलता का अध्ययन करने की स्थिति की स्थापना की। यह इस महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ अग्रिम और हमें तंत्र है कि INM पर नियंत्रण निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा।

Introduction

मनुष्य के विपरीत, zebrafish (Danio rerio) प्रदर्शनी रेटिना न्यूरॉन्स 1, 2, 3, 4 की मौत पर सेल एक मजबूत उत्थान प्रतिक्रिया। ट्यूमर परिगलन कारक α, एक संकेत अणु है कि रेटिना न्यूरॉन्स मरने से जारी है मुलर glia बेसल भीतर परमाणु परत रेटिना के (लीग) में रहने वाले, 5 पैदा करना और न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं है कि neuronal सेल में फर्क से पहले पैदा जारी उत्पादन करने के लिए प्रेरित करता है कि 2 की मौत हो गई प्रकार, 3, 4। उत्थान प्रतिक्रिया के proliferative चरण के दौरान, मुलर glia के नाभिक और उनके निकाली गई न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं सेल चक्र (Interkinetic परमाणु प्रवासन, INM) 6 के साथ चरण में एक दोहराव प्रवासी पैटर्न से गुजरना >, 7। बेसल लीग में तैनात नाभिक बाहरी परमाणु परत (ONL) जहां वे विभाजित पहले उत्पन्न होने वाली नाभिक लीग को basally लौटने के लिए पलायन करने से पहले उनके डीएनए को दोहराने। यह प्रक्रिया पहले ऊतकीय तरीकों का उपयोग कर neuroepithelial विकास के दौरान वर्णित किया गया था, लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण बाद में Sauer 8, 9, 10, 11, 12 से व्याख्या की पुष्टि की है। दोनों histochemical और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण अंतर्निहित INM और रेटिना 9, 11, 12, 13 सहित neuroepithelia के विकास में अपना कार्य तंत्र निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, वयस्क रेटिना regenerating में INM गवर्निंग तंत्र में ज्यादा विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया हैxref "> 6, 7। लाइव सेल इमेजिंग एक अमूल्य दृष्टिकोण संकेत दे रास्ते कि वयस्क regenerating रेटिना में INM पर नियंत्रण के हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए किया जाएगा।

अभी हाल तक, रेटिना में INM का जीना सेल इमेजिंग या तो रहते zebrafish भ्रूण करने के लिए या भ्रूण लड़की या प्रसव के बाद माउस रेटिना explants 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 तक ही सीमित था। माउस, चूहा और zebrafish सहित प्रजाति की एक किस्म के वयस्क जानवरों से रेटिना explants अलग सेल जैविक दृष्टिकोण 17, 18, 19, 20 के लिए उपयोग किया गया है, वहीं इमेजिंग प्रयोगों रहते सेल रेटिना explants हेक्टेयर का उपयोग करve समय की अवधि जानकारी देने के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया और कई घंटे 21, 22 से अधिक लगातार निष्पादित नहीं किया गया है। यहाँ, हम बहु photon माइक्रोस्कोपी 6 का उपयोग कर रहते सेल इमेजिंग प्रयोगों निगरानी INM प्रदर्शन करने के लिए संस्कृति प्रकाश क्षतिग्रस्त वयस्क zebrafish रेटिना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन। लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण प्रतिरक्षाऊतकरसायन तरीकों पर लाभप्रद जब तंत्र को नियंत्रित करने INM की जांच, INM की गतिशीलता के रूप में, उदाहरण के लिए, वेग नहीं बल्कि बँटवारा का स्थान है, जो संभवतः immunocytochemistry का उपयोग नहीं कर पता लगाया जाएगा से प्रभावित हो सकते हैं।

ऐसे मुलर glia या microglia के व्यवहार से फोटोरिसेप्टर मरने की phagocytosis के रूप में रेटिना उत्थान के दौरान अन्य गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा करने के लिए भविष्य में, इस विधि को भी क्षमता है।

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Protocol

नोट: Zebrafish उठाया और Freimann जीवन विज्ञान केंद्र में नोट्रे डेम Zebrafish सुविधा में बनाए रखा गया। तरीकों इस पांडुलिपि में वर्णित नोट्रे डेम पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और जानवरों की दृष्टि और नेत्र विज्ञान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन द्वारा विजन रिसर्च में उपयोग के लिए बयान के अनुपालन में हैं।

1. समाधान

  1. टिशू कल्चर हुड और किसी भी उपकरण / अभिकर्मकों कि टिशू कल्चर हुड में स्थानांतरित कर रहे हैं बाँझ 70% इथेनॉल तैयार करें।
  2. (: 500 2-phenoxyethanol 1) 2-phenoxyethanol के 2 एमएल प्रणाली पानी का 1 एल में जोड़े।
  3. 0.1 मिमी 3 NaHCO, पीएच 8.0 से तैयार करें। एक निष्फल टिशू कल्चर हुड में समाधान बाँझ एक 10 एमएल सिरिंज और एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करें।
    नोट: 3 NaHCO कुशलता fluorodishes की coverslip सतह भर में सेल और ऊतक चिपकने वाला प्रसार करने के लिए प्रयोग किया जाता है (देखें3.2 कदम)।
  4. तैयार 1.0 एम 2 CaCl और 1.0 एम 2 MgCl। एक 10 एमएल सिरिंज और एक निष्फल टिशू कल्चर हुड में 0.2 माइक्रोन ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ।
  5. Hank's संतुलित नमक समाधान (HBSS) तैयार करने के लिए, बाँझ 2 CaCl और बाँझ 2 MgCl 1x HBSS करने के लिए सीए 2/2 मिलीग्राम + बिना, 1 मिमी प्रत्येक का एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ने फिनोल लाल के बिना। एक बाँझ वातावरण में काम करते हैं।
  6. संस्कृति के माध्यम से तैयार करने के लिए, 50% 1x न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) लाल फिनोल के बिना, 25% HBSS CaCl 2 और 2 MgCl युक्त (खंड 1.4 देखें), 25% हार्स सीरम (एचएस), 10 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 10 मिश्रण माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन। एक बाँझ वातावरण में काम करते हैं।
    नोट: फिनोल लाल युक्त मध्यम से बचें क्योंकि यह autofluoresces, जिससे शोर अनुपात करने के लिए संकेत प्रभावित। 23
  7. फिनोल लाल के बिना 1x सदस्य में 1% कम पिघलने बिंदु agarose के 10 एमएल तैयार करें। पिघला एक microw का उपयोग कर agarose / 1x सदस्यAVE। तरल पदार्थ वाष्पीकरण के कारण आयन सांद्रता बदल जाएगा agarose (जैसे, 10 एमएल) दोहराए बार गर्म करने के रूप में की छोटी मात्रा में तैयार करें।
  8. संवर्धन करने से पहले, autoclaving द्वारा 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों बाँझ।

2. हल्के-नुकसान प्रतिमान

  1. काले अनुकूलन
    1. जगह 2 - 3 टीजी [GFAP: nGFP] 6 पर mi2004 zebrafish (या हित के अन्य ट्रांसजेनिक zebrafish) - 14 घ के लिए एक माहौल प्रकाश से रहित में उम्र के 14 महीने। आगे विस्तार के लिए संदर्भ 2, 6, 24, 25 देखें।
  2. दो फ्लोरोसेंट लैंप कि 2800 लक्स 2, 6, 24, 25 के प्रकाश का उत्सर्जन के बीच प्रणाली पानी में 3 काले अनुकूलित ट्रांसजेनिक zebrafish - 2 युक्त टैंक स्थिति। 35 घंटे के लिए निरंतर तीव्र प्रकाश के लिए zebrafish बेनकाब। प्रकाश जोखिम के दौरान विश्वास दिलाता हूं कि पानी का तापमान 31 के बीच बनाए रखा है - 33 डिग्री सेल्सियस।

3. संवर्धन के लिए तैयारी (रेटिना अलगाव के दिन)

  1. 70% इथेनॉल का उपयोग करना, टिशू कल्चर हुड और घटकों बाँझ / उपकरण है कि टिशू कल्चर हुड में स्थानांतरित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, सदस्य और HBSS, pipettes, बाँझ पिपेट टिप्स, आदि युक्त बोतल।)।
  2. fluorodishes की तैयारी
    1. कोट सेल और ऊतक चिपकने के साथ प्रत्येक रेटिना के लिए एक fluorodish (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. (लगभग 1, 70 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 मिमी 3 NaHCO में सेल और ऊतक चिपकने वाला पतला प्रत्येक fluorodish करने के लिए 50 μL जोड़ें और एक 200 μL विंदुक टिप के साथ fluorodish के केंद्र में समाधान का प्रसार - 1.2 सेमी व्यास )।
    3. आरटी पर 3 घंटे के लिए - 1 लेपित fluorodishes सेते(वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं)।
    4. समाधान निकालें और प्रत्येक धोने के लिए 1x सदस्य के 500 μL के साथ 3x कुल्ला। बाहर सुखाने से लेपित fluorodishes से बचने के लिए, उन्हें सदस्य में बनाए रखने के लिए जब तक रेटिना explants बढ़ रहे हैं।
  3. 1.6 चरण में वर्णित के रूप में संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। संस्कृति के माध्यम 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया जा सकता है।

4. अलगाव और रेटिना explants का संवर्धन

नोट: प्रोटोकॉल नीचे दिये पृष्ठीय रेटिना, जो रेटिना क्षेत्र है कि मुख्य रूप से वर्णित प्रकाश नुकसान प्रतिमान द्वारा lesioned है के अलगाव के लिए है। इसलिए, नुकसान प्रेरित प्रसार और परमाणु interkinetic प्रवास के जुड़े घटना पृष्ठीय रेटिना में होते हैं। हालांकि, अलगाव की प्रक्रिया के शोधकर्ता / अनुसंधान प्रश्न की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार रेटिना क्षेत्रों उपज के लिए समायोजित किया जा सकता है।

  1. Euthanize एक प्रकाश क्षतिग्रस्त ट्रांसजेनिक zebrafish एक1 में टा समय: 500 2-phenoxyethanol।
  2. एक 1000 μL विंदुक के साथ एक fluorodish से सदस्य निकालें इतना ही तरल पदार्थ अवशेष की एक पतली फिल्म है।
  3. एक सूखी कागज तौलिया पर zebrafish स्थानांतरण, Dumont संदंश (संदंश # 5, 45 डिग्री कोण) के एक घुमावदार जोड़ी के साथ आंखों को हटाने और fluorodish पर यह हस्तांतरण।
  4. एक stereomicroscope का प्रयोग, fluorodish के कवर पर्ची पर पुतली के साथ नजर उन्मुख इतना है कि ऑप्टिक तंत्रिका के साथ आंखों के पीछे दिख रहा है (चित्रा -1)।
  5. मैकफर्सन-Vannas कैंची की एक जोड़ी के साथ ऑप्टिक तंत्रिका को हटाने, आंखों के पीछे के करीब काटने। इसके अलावा, आंख के बाहर अस्तर संयोजी ऊतक को हटा दें।
  6. # 5 संदंश की एक जोड़ी के साथ अपनी नाक और लौकिक पक्ष के बीच आंख पकड़ो, जबकि एक कैंची ब्लेड पटल cribrosa के माध्यम से भेदी और दोनों नाक और आंख के अस्थायी पक्षों के साथ काटने से ऑप्टिक डंठल पर एक चीरा (देखें चित्र 1E , खंडों लीNE)।
  7. रेटिना के पृष्ठीय पक्ष और अन्य जोड़ी, पृष्ठीय रेटिना से उदर अलग ऊतक खींचने के लिए आयोजित करने के लिए # 5 संदंश के दो जोड़े, एक का उपयोग करना।
    नोट: यह पृष्ठीय रेटिना उन्मुख करने के लिए इतना है कि लेंस और नाड़ीग्रन्थि सेल परत coverslip का सामना करना पड़ता है, जबकि श्वेतपटल ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है की सलाह दी जाती है।
  8. # 5 संदंश की एक जोड़ी के साथ पृष्ठीय रेटिना से श्वेतपटल निकालें, लेंस है कि # 5 संदंश (चित्रा 1H, मैं) की एक दूसरी जोड़ी के साथ रेटिना से जुड़ा है जबकि पकड़े।
  9. लेंस निकालने के लिए, मैकफर्सन-Vannas कैंची का उपयोग करें और रेटिना (चित्रा 1 मैं, जम्मू) को नुकसान पहुँचाए बिना लेंस के पीछे काटा। कभी कभी, लेंस कदम 4.7 में अलग करती है। इस मामले में, # 5 संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ एक कट किनारे पर रेटिना धारण करके संदंश के साथ सावधानी से श्वेतपटल को हटा दें।
  10. कांच का हटाये रेटिना को नुकसान पहुँचाए बिना लेंस हटाने के दौरान। नाड़ीग्रन्थि सेल परत कवर पर्ची का सामना करना पड़ के साथ रेटिना समतलfluorodish की चित्रा (1L, एम)।
  11. 1% कम पिघलने बिंदु agarose के 10 μL के साथ रेटिना को चारों ओर और agarose जमना।
  12. देखना है कि तरल agarose रेटिना लिफ्ट नहीं करता है के रूप में भी एक मामूली ऊंचाई ऊतक में गहराई से ध्यान केंद्रित करने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। उठाने मनाया जाता है, agarose हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। अधिक जोड़ने के लिए प्रयास करने से पहले अवशिष्ट agarose स्थापित करते हैं।
  13. दोहराएँ कदम 4.12 कई बार पूरे fluorodish कवर करने के लिए 1% कम पिघलने बिंदु agarose जोड़ने से पहले। एक बार agarose जम गया है, 1.5 एमएल संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
  14. एक 5% सीओ 2 / हवा वातावरण लगभग 12 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर सेट में रेटिना explant संस्कृति को बनाए रखने रेटिना तनाव अलगाव की प्रक्रिया के द्वारा किए गए से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए। 32 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट प्रकाश का इलाज zebrafish रूप में ही तापमान में रेटिना बनाए रखने के लिए (2.3 कदम देखें)।

5. Multiphoton माइक्रोस्कोपी

(सामग्री की तालिका देखें), एक 40x ए पी ओ लंबी दूरी पानी विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.15) से लैस एक multiphoton माइक्रोस्कोप, एक बिजली स्कैनर और एक के लिए अनुकूलित किया गया पर्यावरण कक्ष है कि चार 35 मिमी पेट्री डिश के लिए एक सम्मिलित होते हैं। छवियों को एक गैर descanned डिटेक्टर (आर-NDD) के साथ हासिल किया गया।

  1. इमेजिंग के लिए पहले, एक 5% सीओ 2 / हवा वातावरण को प्राप्त करने के लिए पर्यावरण कक्ष संतुलित करना। सुनिश्चित करें कि खाली पेट्री डिश के कमरे में गैस के रिसाव से बचने के लिए धारक में डाला जाता है सुनिश्चित करें।
  2. माइक्रोस्कोपी प्रणाली चालू करें।
  3. एक बार जब पर्यावरण कक्ष equilibrated है, 40X ए पी ओ लंबी दूरी पानी विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.15) पर अपवर्तनांक तरल जोड़ें।
    नोट: पानी के समान ऑप्टिकल गुणों के साथ अपवर्तनांक तरल लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान पानी का वाष्पीकरण से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  4. प्लेस फ्लूचैम्बर में रेटिना explants साथ orodishes। brightfield प्रकाश का प्रयोग, प्रकाश पथ में नमूना स्थिति और ध्यान के विमान में पृष्ठीय रेटिना की midregion लाने के लिए।
  5. GFAP पर ध्यान केंद्रित करने के लिए GFP epifluorescent प्रकाश का प्रयोग करें: nGFP पॉजिटिव मुलर glia नाभिक (चित्रा 2A, सी)।
    नोट: explants फ्लैट या agarose explant के तहत संचित मुहिम शुरू नहीं कर रहे हैं, तो यह GFAP पर ध्यान केंद्रित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा: nGFP पॉजिटिव नाभिक या वे dimly प्रतिदीप्ति जाएगा।
    1. जाँच करें कि क्या एक ही रेटिना explant के भीतर एक अलग क्षेत्र के लिए चलती ध्यान केंद्रित कर इस मुद्दे को दूर करेंगे। अन्यथा एक अलग रेटिना explant के लिए कदम।
  6. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, 'A1 सांसद जीयूआई', 'TiPad', 'ए 1 कॉम्पैक्ट जीयूआई' और 'एन डी अधिग्रहण' खिड़कियां खुली। multiphoton इमेजिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि 'आईआर NDD' विकल्प 'A1 कॉम्पैक्ट जीयूआई' में चुना जाता है।
  7. 'Settin मेंजी 'क्षेत्र, 1 सेंट dichroic दर्पण के लिए आईआर डीएम का चयन करें और बैंड पास फिल्टर 525/50 GFP प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए चुनें।
  8. खिड़की लेबल 'A1MP जीयूआई' में आईआर लेजर पर स्विच। यह एक कुछ मिनट लग लेजर के लिए तैयार हो जाएगा। GFP प्रतिदीप्ति उत्तेजित और 'A1 सांसद जीयूआई' विंडो में 'ऑटो संरेखण' बटन पर क्लिक करके लेजर के लिए पंक्ति में 910 एनएम के तरंग दैर्ध्य सेट करें।
  9. सुनिश्चित करें कि कमरे और उपकरण लाइट बंद या 'A1 सांसद जीयूआई' में शटर खोलने photomultiplier ट्यूब के overexposure से बचने के लिए पहले कवर कर रहे हैं। शोर के स्तर को कम करने के लिए, एक अंधेरे वातावरण में माइक्रोस्कोप घर।
  10. 300 x 300 पिक्सल, के दृश्य के एक क्षेत्र की छवियों का मोल दो में से एक जूम, और 4.8 μs / पिक्सेल के एक पिक्सेल निवास समय में। मोटे तौर पर 'A1MP जीयूआई' और 'ए 1 कॉम्पैक्ट जीयूआई' विंडो में लाभ में 'अधिग्रहण' क्षेत्र बदलकर लेजर शक्ति की स्थापना की।
  11. जेड ढेर स्थापना
    1. एनडी अधिग्रहण 'विंडो' के भीतर z'-subwindow 'में जेड ढेर के शीर्ष फोकल हवाई जहाज़ स्थापित करने के लिए नाड़ीग्रन्थि सेल परत पर ध्यान दें। कुछ GFAP: nGFP पॉजिटिव कोशिकाओं को आमतौर पर नाड़ीग्रन्थि सेल परत है, जो रेटिना (चित्रा 2A, डी) के बेसल सीमा की पहचान में मदद करता है में स्थित हैं।
    2. ONL के स्तर के माध्यम से फोकल हवाई जहाज़ में ले जाएँ (चित्रा 2A, बी), dimly लेबल GFAP की उपस्थिति के द्वारा होती है जो: nGFP पॉजिटिव कोशिकाओं है कि लीग (2A चित्रा, सी) में अपने समकक्षों के दौर और बढ़े रिश्तेदार ।
    3. जेड ढेर के नीचे के रूप में इस विमान को सेट करें। सुनिश्चित करें कि पूरे ONL imaged किया जाएगा (चित्रा 2A, बी)।
    4. 'जेड' subwindow में मध्यम स्थिति पर डबल क्लिक करें फोकल हवाई जहाज़ पारियों की आवश्यकता है कि इमेजिंग अवधि के दौरान फिर से समायोजन, का सामना 'घर' की स्थिति के रूप में आवंटित करने के लिए। को बदलें 'सममित मोड परिभाषित'और क्लिक करें 'रिश्तेदार'।
    5. 1 माइक्रोन से 0.7 के बीच z कदम आकार सेट करें।
  12. जेड तीव्रता सुधार:
    1. प्रकाश बिखरने की वजह से लागू Z तीव्रता सुधार पिक्सेल तीव्रता के नुकसान की भरपाई करने के लिए जब ऊतक की गहरी परतों में इमेजिंग।
    2. सुधार की स्थापना करने के लिए, 'जेड तीव्रता सुधार' विंडो खोलें। 'जेड ढेर रेंज', 'चुन एनडी से' सेट करने के लिए।
    3. और लाभ (A1 कॉम्पैक्ट जीयूआई ( 'A1MP जीयूआई' में 'अधिग्रहण के क्षेत्र') 'जेड तीव्रता सुधार' विंडो में नीचे फोकल हवाई जहाज़ पर क्लिक करें (इस मामले में, नाड़ीग्रन्थि सेल परत से मेल खाती है) और सेट लेजर तीव्रता )।
    4. सेटिंग्स है कि बाद में चुना फोकल हवाई जहाज़ के लिए 'जेड तीव्रता सुधार' विंडो में के तहत 'डिवाइस सेटिंग' में दिखाए जाते हैं इस बात की पुष्टि करने के लिए तीर 'जेड तीव्रता सुधार' विंडो में 'जेड-मूल्यों' को क्लिक करें।
    5. बीच एक के लिए प्रक्रिया को दोहराएंएन डी शीर्ष विमानों, लेजर शक्ति और लाभ बढ़ रही है। अतिरिक्त फोकल विमानों यदि आवश्यक हो तो जोड़ा जा सकता है। 4 - आंकड़े 2 में प्रयोगों के लिए विशेष लेजर और लाभ सेटिंग्स के लिए 1 टेबल देखें।
    6. 'A1 सांसद जीयूआई' विंडो में 'अधिग्रहण के क्षेत्र' सेट करें। एक अधिग्रहण क्षेत्र में 15 से भी बड़ा है और एक लाभ अधिक से अधिक 126 इमेजिंग photobleaching को नाकाम करने के शुरू में चयन करने से बचें और शोर के स्तर में वृद्धि हुई।
      नोट: लेजर और photomultiplier ट्यूबों माइक्रोस्कोपी प्रणाली, परीक्षण और लेजर लाभ सेटिंग्स के बीच अलग रूप में माइक्रोस्कोप की स्थापना की है, जबकि photobleaching से बचने के लिए इष्टतम इमेजिंग की स्थिति प्राप्त करने के लिए।
    7. 'जेड तीव्रता सुधार' विंडो में 'रिश्तेदार तीव्रता सुधार' चुनें।
  13. 'एनडी अधिग्रहण' विंडो में 'timeseries' subwindow में, 8 घंटे की अवधि और 'कोई देरी' के अंतराल निर्धारित किया है। फिर, टी में क्लिक करने के लिए 'भागो Z-सुधार' के लिए सुनिश्चित करेंवह 'जेड ढेर' 'एनडी अधिग्रहण' विंडो बटन में उप विंडो 3-डी timeseries प्राप्त करने के लिए।
  14. छवि अधिग्रहण की अवधि के दौरान 29 डिग्री सेल्सियस - 27 के तापमान पर रेटिना explants बनाए रखें।
  15. छवि अधिग्रहण अवधि के दौरान, यदि आवश्यक हो, के आदेश के बाद इमेजिंग विश्लेषण के लिए छवि गुणवत्ता बनाए रखने के लिए सत्ता के स्तर और लाभ बदल डालना। 5.11.4 - समायोजन के लिए कदम 5.11.2 प्रदर्शन करते हैं।
  16. अगर फोकल हवाई जहाज़ पाली, रोक सकते हैं या रन रोकने के लिए और कदम 5.11 फिर से प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: यदि 'रिश्तेदार Z-सुधार' कदम 5.12.7 में चुना गया था और कदम 5.11.4 प्रदर्शन किया गया था यह आवश्यक हो, सत्ता और लाभ के स्तर को बदल डालना जब तक व्यापक photobleaching हुआ नहीं होना चाहिए।

6. वेग का विश्लेषण

  1. समय निकालें, छवि पर एक 'ब्याज के क्षेत्र' की स्थापना। 'समय माप' उपकरण का उपयोग करें और एक स्प्रेडशीट के लिए समय मान निर्यात।
  2. एक क्षेत्र है कि एक di शामिल फसलviding GFAP: nGFP पॉजिटिव नाभिक।
  3. फसली क्षेत्र का चयन इतना है कि यह कम से कम एक नाभिक है कि बाद में दूरी है कि विभाजन नाभिक बेसल लीग के संबंध में चले मापने के लिए एक संदर्भ बिंदु सेट करने के लिए INM गुजरना नहीं करता है शामिल हैं। नोट: एक नाभिक है कि बेसल लीग में रहता है चुनने के लिए, यह timeseries के एक 3-डी पुनर्निर्माण को तैयार करने में मदद करता है।
  4. वैकल्पिक रूप से, अगर एक GFAP: nGFP पॉजिटिव सेल अधिग्रहण अवधि के दौरान ONL में मनाया जाता है, के लिए एक संदर्भ बिंदु की पहचान करने में तय की लंबाई बेसल लीग को ONL नाभिक से फैले की एक खड़ी रेखा का उपयोग करें।
  5. 'शो स्लाइस देखें' समारोह का उपयोग करना, orthogonal अनुमानों उत्पन्न करते हैं। बाद में, के लिए 'अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण' 'टुकड़ा' से मोड बदल जाते हैं।
  6. orthogonal अधिकतम प्रक्षेपण के 'XY' देखने को बंद कर दें। उन्मुखीकरण जिस पर पलायन / विभाजित नाभिक, सबसे अच्छा दिख रहा है एक पर निर्भर करता हैLSO या तो 'xz'- या' yz'-दृश्य बंद कर देते हैं।
  7. सही माउस बटन के साथ शेष छवि पर क्लिक करें और इस दृष्टि से नया दस्तावेज़ बनाएँ 'समारोह' xz 'या' के साथ yz' छवि श्रृंखला 'निकाल सकते हैं। यदि आवश्यक हो, छवि को घुमाएगी।
  8. 'मैनुअल माप' समारोह का उपयोग करना, नाभिक कि बेसल लीग में रहता है और INM गुजरना नहीं करता है के नीचे के स्तर पर छवि भर में एक क्षैतिज रेखा खींचना (= संदर्भ बिंदु, चित्रा -4 ए - ई, लाल क्षैतिज रेखा)।
  9. संदर्भ लाइन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में 'लाइन माप' उपकरण (- ई चित्रा -4 ए देखें) का उपयोग timeseries के लिए पलायन नाभिक के बेसल बिंदु के बीच की दूरी को मापने।
  10. एक बार जब परमाणु लिफाफा टूट जाती है, सोमा के बेसल स्थिति को मापने के लिए अगर यह GFP के प्रसार पूरे सेल में निम्नलिखित पहचाने जाने योग्य है।
  11. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, दूरी एक परमाणु साजिशcleus समय बीत (चित्रा 4F) के खिलाफ चले गए।
    1. शिखर पलायन वेग (वी), ग्राफ दूरी परमाणु लिफाफा टूटने से पहले की अवधि के लिए कूच होता है (चित्रा 4 जी) निर्धारित करने के लिए।
    2. चार्ट में डेटा श्रृंखला का चयन करें, माउस को राइट क्लिक करें और इसी समारोह 'y = mx + ग' सहित एक रेखीय प्रतिगमन वक्र डालें। समारोह में ढाल 'एम' वेग का प्रतिनिधित्व करता है, वी एक (चित्रा 4 जी)।
    3. दोहराएँ तेजी से बेसल प्रवास के पहले चरण के लिए 6.11.1 और 6.11.2 कदम बेसल पलायन वेग, वी बी (चित्रा 4H) निर्धारित करने के लिए।

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Representative Results

प्रक्रिया चित्रा 1 में योजनाबद्ध में उल्लिखित के अनुसार रेटिना के अलगाव से प्रकाश क्षतिग्रस्त वयस्क टीजी एक चपटा पृष्ठीय रेटिना के संवर्धन की अनुमति देता है [GFAP: nGFP] mi2004 एक 5% सीओ में कम से कम 24 घंटे की अवधि में zebrafish 2 / हवा वातावरण। ये फ्लैट पर चढ़कर रेटिना explants गहरी ऊतक स्तरों पर छवि फोकल विमानों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उदाहरण है मुलर glia / न्यूरोनल पूर्वज सेल नाभिक मुलर glia विशिष्ट प्रमोटर GFAP (glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन) से GFP के साथ लेबल है कि ONL में प्रकाश क्षतिग्रस्त रेटिना में बँटवारा दौरान स्थित हैं (आंकड़े 2A - डी, 3)। Nt19 zebrafish आँखें है कि के तहत रॉड फोटोरिसेप्टर में EGFP एक्सप्रेस: आगे कहा कि इस दृष्टिकोण के विभिन्न रेटिना सेल परतों छवि के लिए लागू है इस बात की पुष्टि करने के लिए, तीव्रता से पृथक रेटिना explants से undamaged टीजी [Eco.NfsB-EGFP रो] तैयार किए गएrhodopsin प्रमोटर। चित्रा 2 ई - एच पता चलता है कि यह GFP पॉजिटिव रॉड फोटोरिसेप्टर और उनके भीतर क्षेत्रों की छवियों को प्राप्त करने के लिए संभव है। छड़ी भीतरी क्षेत्रों के रेटिना वर्णक उपकला की ओर कोन फोटोरिसेप्टर के बीच विस्तार के रूप में, इन आंकड़ों का मतलब यह होता है कि यह भी छवि कोन फोटोरिसेप्टर के लिए संभव है। हालांकि यह आगे की जांच नहीं था।

मनाया मुलर glia / न्यूरोनल पूर्वज सेल ONL में प्रकाश क्षतिग्रस्त रेटिना में नाभिक के बाद, हम विस्तार (चित्रा 3 और मूवी 1) में अपने प्रवासी व्यवहार होती है। मुलर glia / न्यूरोनल पूर्वज सेल GFP द्वारा लेबल नाभिक लीग जहां वे आम तौर पर रहते हैं और ONL, फोटोरिसेप्टर नुकसान की साइट के बेसल की स्थिति के बीच विस्थापित द्विशताब्दी directionally। आमतौर पर, GFAP: nGFP पॉजिटिव नाभिक लीग में एक छोटी दूरी (चित्रा 3 ए - सी) चले गए पहले वे कराना पड़ापरमाणु लिफाफा टूटने, अभी भी लीग में तैनात, GFP के पुनर्वितरण पूरे मुलर glia / न्यूरोनल पूर्वज सेल (चित्रा 3 डी) की कोशिका द्रव्य में पर आधारित है। ONL में कोशिका विभाजन के बाद, दो GFAP: nGFP पॉजिटिव नाभिक ONL (चित्रा 3F, जी) कि बेसल लीग (- जम्मू चित्रा 3H) को लौट में दिखाई बन गया। कोशिका विभाजन पर, नव उत्पन्न होने वाली नाभिक शुरू में बहुत ही मंद है और इसलिए की पहचान करने के लिए (चित्रा 3 जी) के लिए मुश्किल थे। हालांकि, बँटवारा के बाद एक से दो समय फ्रेम के भीतर, परमाणु GFP प्रतिदीप्ति उज्ज्वल बन गया, जो परमाणु प्रवास के दृश्य (चित्रा 3H - जे) सक्षम होना चाहिए। लाइव सेल इमेजिंग भी विभाजन विमान (चित्रा 3F, जी), जो सेल 3 चित्र में दिखाया के लिए रेटिना के शिखर सतह को क्षैतिज हुआ के दृश्य की अनुमति दी। यह भी अन्य ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों का उपयोग करने के लिए संभव हैके रूप में टीजी [GFAP: EGFP] nt11 zebrafish कि कोशिका द्रव्य में व्यक्त GFP (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि यह संभव है मज़बूती से शिखर आंदोलन और क्षैतिज कोशिका विभाजन निर्धारित करने के लिए है, यह अक्सर मुश्किल होता है के लिए वास्तव में basally पलायन बेटी नाभिक और टीजी में खड़ी कोशिका विभाजन की स्थिति की पहचान [GFAP: EGFP] nt11 zebrafish रेटिना (डेटा) नहीं दिखाया।

वेग का निर्धारण करने के लिए, एक GFAP: nGFP पॉजिटिव नाभिक है कि रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान विस्थापित नहीं किया संदर्भ बिंदु (- ई स्टार, चित्रा -4 ए) के रूप में चुना गया था। अधिकतम xz या पर छवि श्रृंखला के प्रत्येक timepoint पर - nGFP पॉजिटिव नाभिक (ई क्षैतिज लाल रेखा, चित्रा -4 ए): - पलायन नाभिक (खड़ी लाल रेखा, चित्रा -4 ए ई) की दूरी संदर्भ GFAP के संबंध में निर्धारित किया गया था yz-अनुमानों (निर्भर करता है जो कोण पर नाभिक हो सकता है visualiसबसे अधिक कुशलता से जेड)। दूरी है कि नाभिक चले एक स्प्रेडशीट (- एच चित्रा 4F) में समय के खिलाफ साजिश रची गई थी। परमाणु झिल्ली टूटने अक्सर (इस उदाहरण में सेल शरीर के बेसल सबसे अधिक भाग) पूरे कोशिका के भीतर GFP की फिर से वितरण की वजह से एक प्रारंभिक basalward आंदोलन के रूप में ग्राफ में मनाया गया। शिखर वेग परमाणु लिफाफा टूटने से पहले निर्धारित किया गया था, फिटिंग दूरी परमाणु लिफाफा टूटने से पहले की अवधि (लाल हीरा, चित्रा 4 जी) के लिए समय के खिलाफ साजिश रची करने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन वक्र (ग्रे बिंदीदार रेखा, चित्रा 4 जी)। रेखीय प्रतिगमन वक्र (y = mx + C) के ढलान 'एम' वेग 'DX / डीटी' का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 4 में प्रस्तुत सेल के लिए शिखर वेग 10.89 माइक्रोन / एच था। एक ही दृष्टिकोण, प्रारंभिक तेजी से बेसल आंदोलन का वेग (वी ख) नवगठित बेटी नाभिक (चित्रा 4F गणना करने के लिए लागू किया गया था एच)। बेसल पलायन वेग -67.71 और 33.51 मीटर / बेटी कोशिकाओं डी 1 और डी 2 एच के वी बी, क्रमशः, तुलनात्मक रूप से तेजी से शिखर वेग से थे। दुर्भाग्य से, यह GFP पूरे सेल भर में दूर तक फैला हुआ के रूप में परमाणु लिफाफा टूटने के बाद शिखर वेग निर्धारित करने के लिए संभव नहीं था। इसके बजाय, तात्कालिक वेग समय और परमाणु लिफाफा टूटने और नवगठित बेटी नाभिक के पहले दृश्य से पहले नाभिक की स्थिति के आधार पर गणना की गई। सेल 4 चित्र में दिखाया के लिए 7.9 माइक्रोन / घंटा की तात्कालिक वेग होने की संभावना एक कम के रूप में क्रोमेटिन, onl बँटवारा के टीलोफ़ेज़ करने से पहले पहुंचता है जब बेटी नाभिक दिखाई देने लगते है।

संक्षेप में, रेटिना explants की संस्कृति वयस्क में INM का जीना सेल इमेजिंग zebrafish रेटिना और प्रवास और कोशिका विभाजन देहात के निर्धारण के लिए अनुमति देता है regeneratingव्यक्तिगत नाभिक के rameters।

आकृति 1
चित्रा 1: रेटिना अलगाव की प्रक्रिया। ए) योजनाबद्ध अपनी आंखों के साथ एक zebrafish सिर को दर्शाता हुआ। बी) आंख zebrafish से हटा दिया है और शिष्य के साथ आंख के सामने दिखाने के लिए उन्मुख है। सी) आँख 180 डिग्री बारी इतनी है कि ऑप्टिक डंठल (भरा काले वृत्त) के साथ आंखों के पीछे (डी में दिखाई हो जाता है) और शिष्य नीचे की ओर का सामना करना पड़ता। ग्रे रंग आंख की श्वेतपटल की उपस्थिति इंगित करता है। ई) मैकफर्सन-Vannas कैंची की एक जोड़ी की एक ब्लेड यह अपने पृष्ठीय और उदर पक्षों जो सफेद खंडों लाइन ने संकेत दिया है में कटौती करने के लिए आँख की ऑप्टिक डंठल (भरा काले वृत्त) में डाला जाता है। एफ) आंख की पृष्ठीय छमाही के बाद उदर आधे हटा दिया गया था। काले आधा सर्कल टी इंगित करता हैवह ऑप्टिक डंठल के अवशिष्ट हिस्सा है। जी) रेटिना (ब्राउन), कांच () नहीं दिखाया और लेंस (एल, हल्के भूरे रंग के चक्र) है कि अभी भी श्वेतपटल (ग्रे लाइन द्वारा encased है के साथ नजर 90 ° पिछड़े प्रकट करने के लिए (एच) आंख के अंदर की बारी )। मैं) श्वेतपटल अलग किया गया था (ध्यान दें, ग्रे लाइन याद आ रही है) और जे) लेंस और शीशे केवल रेटिना (ब्राउन) को जन्म दे रही हटा दिया। कश्मीर) रेटिना पृष्ठीय रेटिना (एल) के एक फ्लैट माउंट व्यू में 90 डिग्री आगे जन्म देने के लिए बदल गया। एम) पृष्ठीय रेटिना explant एक गिलास नीचे fluorodish पर फ्लैट मुहिम शुरू की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: 3-डी का पुनर्निर्माणरेटिना Multiphoton जेड ढेर। ए) GFAP की एक multiphoton Z ढेर छवि श्रृंखला के 3-डी पुनर्निर्माण: zebrafish से रेटिना पूरे माउंट संस्कृतियों प्रकाश-नुकसान के 48 घंटे के बाद में nGFP- सकारात्मक कोशिकाओं। बी - डी) GFAP की एकल multiphoton XY-छवियों: nGFP पॉजिटिव ONL (बी), लीग (सी), जो परत है कि मुलर शामिल करने के लिए संगत के स्तर पर) में (एक 3 डी पुनर्निर्माण में दिखाया कोशिकाओं glia सोमा और GCL (डी)। में तीर (बी) परमाणु लिफाफा टूटने के बाद ONL में एक बढ़े दौर मुलर glia इंगित करता है। ई) से एक undamaged टीजी एक रेटिना explant के एक multiphoton Z ढेर छवि श्रृंखला के 3-डी पुनर्निर्माण [रो: Eco.NfsB-EGFP] nt19 zebrafish। एफ - एच) रॉड भीतरी क्षेत्रों (आरआईएस, एफ), रॉड परमाणु परत के स्तर पर एकल multiphoton XY-छवियों (जी) और भीतरी रेटिना (एच) के स्तर पर। GCL, नाड़ीग्रन्थि सेल परत; लीग, भीतर परमाणु परत; ONL, बाहरी परमाणु परत; आरआईएस, रॉड इनर सेगमेंट। ए, डी, ई और एच, 10 माइक्रोन में स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: INM की Timelapse छवि श्रृंखला। एक - जे) छवि जेड ढेर timelapse श्रृंखला के 3 डी पुनर्निर्माण के प्रदर्शित करने टीजी श्रृंखला [GFAP: nGFP] mi2004 पॉजिटिव नाभिक कि INM गुजरना रेटिना explants में ONL (शीर्ष पंक्ति) में विभाजित करने के लिए। एक ऊर्ध्वस्थ होते हुए पलायन नाभिक और उसके basally पलायन बेटी नाभिक की स्थिति लाल तीर द्वारा संकेत दिया है। लाल सितारा बँटवारा दौरान परमाणु लिफाफा टूटने का संकेत है। एक - जम्मू, नीचे पंक्ति)शीर्ष पंक्ति के रूप में ही छवि श्रृंखला oversaturated था और ONL में विभाजित कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए फसली। लीग, भीतर परमाणु परत; आईपीएल, इनर उलझन परत; ONL, बाहरी परमाणु परत। एक में स्केल बार, 10 माइक्रोन और बी के लिए एक ही है - जे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: शिखर और बेसल प्रवासन वेग के विश्लेषण। एक - ई) के टीजी एक z ढेर छवि श्रृंखला की अधिकतम yz प्रक्षेपण [GFAP: nGFP] timelapse रिकॉर्डिंग बहु photon माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत की अलग timepoints पर mi2004 रेटिना explants। 'मैनुअल माप' समारोह के तहत लाइन उपकरण का उपयोग, एक क्षैतिज रेखा संदर्भ सेल के स्तर पर, एक स्टार ने संकेत पर रखा गया था। एक ऊर्ध्वाधर मेरेasurement लाइन क्षैतिज रेखा पर शुरू तैनात किया गया था और पलायन GFAP के बेसल स्थिति के लिए बढ़ा: nGFP पॉजिटिव नाभिक। माप लाइन की लंबाई छवियों पर और छवियों के तहत पठनीयता के लिए सफेद बक्से में दी गई है। एल 1 = लंबाई है कि बेटी सेल 1 चले गए; एल 2 = लंबाई है कि बेटी सेल 2 चले गए। एफ) की दूरी है कि सेल (F0) में (ए मापा - ई) ऊर्ध्वस्थ होते चले गए और उस उत्पन्न होने वाली बेटी कोशिकाओं डी 1 और डी 2 multiphoton timelapse रिकॉर्डिंग में basally चले गए। लाल रेखा माप जिसके लिए जबकि काले और भूरे रंग लाइनों, (v ख) डी 1 और डी 2 के लिए बेसल पलायन वेग की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता क्रमश: माप का संकेत शिखर पलायन वेग (वी) गणना की गई इंगित करता है। जी, एच) दूरी परमाणु लिफाफा टूटने (जी से पहले शिखर प्रवास के लिए एक्सेल में समय के खिलाफ साजिश रची गई थी) और तेजी से बेसल के चरणबेटी सेल डी 1 (एच) के लिए पलायन। रेखीय प्रतिगमन घटता लगे थे और कार्यों ढलान वेग का प्रतिनिधित्व करने के साथ रेखांकन नीचे दिए गए हैं। लीग, भीतर परमाणु परत; आईपीएल, इनर उलझन परत; ONL, बाहरी परमाणु परत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टीजी [GFAP: EGFP] nt11 टीजी [रो: Eco.NfsB-EGFP] nt19
लेजर शक्ति लाभ लेजर शक्ति लाभ
शीर्ष (रॉड फोटोरिसेप्टर) 13 126 3.5 118 मध्य (मुलर glia) 10 126 2.8 118
नीचे (GCL) 8 126 2.1 118

तालिका 1: लेजर और लाभ के स्तर आंकड़े 2 में प्रदर्शित प्रयोगों के लिए विभिन्न विमानों पर जेड तीव्रता सुधार के लिए प्रयुक्त - 4।

चित्र 2
फिल्म 1: Multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा रेटिना explants का लाइव सेल इमेजिंग। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

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Discussion

क्षतिग्रस्त वयस्क zebrafish रेटिना मुख्य रूप से इस्तेमाल immunocytochemical तरीकों 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30 के उत्थान के शासी तंत्र की जांच के अध्ययन। संस्कृति रेटिना explants करने की स्थिति की स्थापना और इस तरह INM के रूप में घटना, पर लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, हमें गहराई स्थानिक और लौकिक जानकारी में प्राप्त करने के लिए एक तकनीक प्रदान करते हैं। इस तकनीक को पलायन वेग, बँटवारा और लंबाई और कोशिका विभाजन की स्थिति के prophase के दौरान समय और परमाणु लिफाफा टूटने की स्थिति का निर्धारण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह उनके बाद स्थान के संबंध में विभाजन विमान और उत्पन्न होने वाली बेटी कोशिकाओं के भाग्य की स्थापना संभव है। अंत में, इस शक्तिशाली दृष्टिकोण तय करेंगे कि क्या एम2; ller glia और न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं रेटिना उत्थान के दौरान INM के संबंध में अलग तरह से व्यवहार करते हैं। कि उत्थान प्रतिक्रिया के अलग चरणों में regenerating रेटिना में proliferating कोशिकाओं की पहचान ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों का उपयोग अंतर व्यवहार 6 गूढ़ रहस्य सहायता करेगा। multiphoton यहां इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के मामले में, GFP संवाददाता zebrafish लाइनों लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) की उत्तेजना के रूप में पसंद कर रहे हैं बहुत कुशल नहीं है; हालांकि, अन्य multiphoton सिस्टम आरएफपी या समकक्ष fluorophores के कुशल उत्तेजना अनुमति हो सकती है।

रेटिना अलगाव की प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक रेटिना के बढ़ते है। Retinas संभव के रूप में के रूप में फ्लैट के लिए मुहिम शुरू की जा multiphoton प्रकाश ONL की गहरी जेड स्तर को पारित करने के लिए सक्षम होने के लिए है। रेटिना विशेष रूप से सीमांत क्षेत्र में, अवशिष्ट कांच का, और / या agarose का संचय रेटिना संस्कृति के तहत है, जो स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है की Curvingऊतक, सबसे अधिक कवर पर्ची और रेटिना संस्कृति के बीच अतिरिक्त स्थान परिचय। इसके अलावा, बढ़ लेजर शक्ति और लाभ यदि रेटिना फ्लैट नहीं है और इस फलस्वरूप वृद्धि हुई photobleaching और रेटिना संस्कृति के कम व्यवहार्यता का कारण होगा छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना है। गलत बढ़ते अक्सर भी कम प्रकाश पैठ के कारण गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम है और दूरी है कि नाभिक पलायन वेग की गणना के लिए चले गए हैं और इसलिए था उपाय करने की क्षमता को प्रभावित करेगा।

Mi2004 zebrafish रेटिना explants: परमाणु लिफाफा टूटने से पहले और बेसल प्रवास के शिखर प्रवास के वेग मज़बूती टीजी [nGFP GFAP] से एक छवि श्रृंखला में निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, यह अभी संभव नहीं पूरे कोशिका द्रव्य भर GFP फिर से वितरित रूप में इस ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन में परमाणु लिफाफा टूटने के बाद क्रोमेटिन के शिखर प्रवास के वेग को निर्धारित है। labeliपरमाणु डाई Hoechst के साथ रेटिना explants की एनजी मुलर glia नाभिक कि 830 एनएम (Lahne और हाइड, अप्रकाशित डेटा) है, जो ऊतकों की व्यवहार्यता प्रभावित है और कोशिका चक्र की वजह से रोकने के लिए तरंग दैर्ध्य में परिवर्तन की आवश्यकता में मंद तेज में हुई ( Lahne और हाइड, अप्रकाशित डेटा)। रेटिना विकास के दौरान, टीजी [h2afva: h2afva-GFP] kca6 zebrafish कि हिस्टोन 2 से जुड़े हुए व्यक्त GFP सफलतापूर्वक INM पर नजर रखने और सेल चक्र 12, 31 के विभिन्न चरणों में पलायन वेग निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। भविष्य में, से टीजी [h2afva: h2afva-GFP] रेटिना explants kca6 zebrafish भी सेल चक्र के दौरान क्रोमेटिन के दृश्य के लिए सक्षम हो जाएगा और वयस्क zebrafish रेटिना regenerating में परमाणु झिल्ली टूटने के बाद शिखर पलायन वेग के विश्लेषण के लिए अनुमति देगा।

शर्तों के लिये INM की निगरानी के लिए स्थापित करने के बादप्रकाश क्षतिग्रस्त वयस्क zebrafish और वेग के इसी विश्लेषण से रेटिना explants में रहते सेल इमेजिंग आधार INM गवर्निंग तंत्र की जांच के लिए बनेगी। कुछ अध्ययनों से वयस्क रेटिना regenerating mitotic phospho-हिस्टोन 3 पॉजिटिव नाभिक 6, 7 की स्थिति का निर्धारण करने के लिए immunocytochemistry का उपयोग करने में INM के तंत्र की जांच शुरू कर दी। हालांकि, संकेत दे रास्ते के साथ हस्तक्षेप बँटवारा की स्थिति को प्रस्तुत करना नहीं हो सकता है, लेकिन इस तरह के वेग, बँटवारा और विभाजन के समय में संभव है कि / immunocytochemistry द्वारा विचार करने के लिए बहुत मुश्किल नहीं होगा के रूप में अन्य मानकों को प्रभावित कर सकता है। इससे पहले, यह दिखाया गया था कि phospho-हिस्टोन 3 पॉजिटिव mitotic dynactin म्यूटेंट और morphants 11 में विकासशील रेटिना में अधिक पदों के लिए बेसल नाभिक mislocalized। हालांकि, बाद में लाइव सेल इमेजिंग से पता चला है कि परमाणु प्रवास Division Cell करने से पहले dynactin-समझौता सेल में देरी हुईएस, एक वृद्धि की शिखर पलायन वेग सक्षम है, जबकि नाभिक तक पहुंचने के लिए और शिखर सतह 11, 12 में कोशिका विभाजन से गुजरना है। इस उदाहरण को लाइव सेल इमेजिंग की शक्ति एक मिसाल है। इसी प्रकार, जब तंत्र है कि zebrafish रेटिना regenerating वयस्क में INM की सुविधा unraveling, लाइव सेल इमेजिंग के अध्ययन पूरक होगा, और विभिन्न मामलों में अधिक है, immunocytochemical दृष्टिकोण लाभप्रद होगा।

जैसा कि ऊपर चर्चा की, लाइव सेल इमेजिंग प्रतिरक्षाऊतकरसायन / स्थैतिक तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है; तथापि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि रेटिना explants एक पूर्व vivo मॉडल हैं। इस तरह, क्षति अलगाव की प्रक्रिया के दौरान किए गए और / या संस्कृति की स्थिति सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग प्रक्रिया ही विषाक्त प्रभाव है कि सेलुलर व्यवहार 23, 32 प्रभावित कर सकते हैं लागू हो सकती है। जबकि वहाँ disadv हैंलाइव सेल को antages रेटिना संस्कृतियों की इमेजिंग, यह वर्तमान में INM के गतिशील जानकारी प्राप्त करने के लिए हमारे सबसे अच्छा तरीका है। महत्वपूर्ण बात है, रेटिना explants का जीना सेल इमेजिंग प्रक्रिया रेटिना उत्थान के दौरान अन्य जैविक सवालों पर लागू होगी। Immunocytochemical आंकड़ों के आधार पर यह पहले सुझाव दिया था कि मुलर glia मर फोटोरिसेप्टर / मलबे प्रकाश प्रेरित फोटोरिसेप्टर नुकसान 33 निम्नलिखित phagocytose। छवि के लिए मानकों का समायोजन इस प्रक्रिया रहते हैं मर फोटोरिसेप्टर के phagocytosis regenerating zebrafish रेटिना में होता है और अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सत्यापित करेंगे। छवियों टीजी में रॉड नाभिक और रॉड भीतरी क्षेत्रों के स्तर पर हासिल किया जा सकता है कि [रो: Eco.NfsB-EGFP] दिखाया nt19 zebrafish, यह छवि फोटोरिसेप्टर phagocytosis को स्थिति को समायोजित करने के लिए संभव होना चाहिए। इसी तरह, ज्ञान microglia के गतिशील व्यवहार और उनके शासी तंत्र के बारे में सीमित हैdegenerating में समारोह और regenerating रेटिना 34, 35। लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में microglia-विशिष्ट ट्रांसजेनिक zebrafish शोषण भी zebrafish रेटिना 36, 37 regenerating वयस्क में microglia के समारोह के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी। संक्षेप में, रेटिना explants का जीना सेल इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं के गतिशील जानकारी हासिल करने के लिए और regenerating रेटिना में व्यवहार और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के समारोह निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम विलियम आर्चर और नोट्रे डेम एकीकृत इमेजिंग सुविधा द्वारा प्रदान की समर्थन की सराहना करते हैं। विशेष धन्यवाद उनके सतत और उनकी देखभाल और zebrafish के पशुपालन के लिए Freimann लाइफ साइंसेज तकनीशियनों के लिए निर्देशित कर रहे हैं। इस अध्ययन के मानव संसाधन निदेशक के लिए एनआईएच के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (R01-EY018417, R01-EY024519) और zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र, नोट्रे डेम विश्वविद्यालय, नोट्रे डेम, में से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 World precision instruments 14098
Dumont forceps #5, 45° angle World precision instruments 14101
McPherson-Vannas scissors World precision instruments 501233
Fluordishes World precision instruments FD35-100
Stereomicroscope Nikon  SMZ-1B similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2 Labconco equivalent type will work
tissue culture incubator Thermoscientific HEPA-class 100 equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO Bulbtronics 31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter VWR 4192
10 mL Luer-lok syringe VWR BD309604
60 mL Luer-lok syringe VWR BD309653
NaHCO3 FischerScientific S233-500
CaCl2 ThermoScientific C79-500
MgCl2 EMD Millipore 5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco ThermoScientific 5100-038
Horse serum, heat-inactivated ThermoScientific 26050-070
penicillin/streptomycin VWR 16777-164
Ultrapure low melting point agarose ThermoScientific 16520-100
ethanol, absolute ThermoScientific BP2818-4
2-phenoxyethanol Sigma 77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive  VWR 354240
refractive index liquid  Cargille Lab 1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser Nikon equivalent system will work
40X Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes Okolab equivalent system will work
NIS analysis software Nikon

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References

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Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson,… More

Lahne, M., Gorsuch, R. A., Nelson, C. M., Hyde, D. R. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e55335, doi:10.3791/55335 (2017).

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