כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.
השחזור של העצם בגודל אנושות פגמים נשאר בעיה קלינית חמורה בגלל אנגיוגנזה המסכן בתוך רקמות מהונדסים פיגומים במהלך תיקון, אשר מעורר חוסר אספקת דם מספיקה וגורם נמק של רקמות חדשות. Vascularization מהירה היא תנאי חיוני הישרדות רקמות חדשות ושילוב עם רקמות הפונדקאי הקיים. הדור דה נובו של להערכת ב פיגומים הוא אחד הצעדים החשובים ביותר ביצירת התחדשות העצם יעיל יותר, ומאפשר תיקון רקמת לגדול לתוך לפיגום. כדי להתמודד עם בעיה זו, שינוי גנטי של לפיגום biomaterial משמש כדי להאיץ אנגיוגנזה ואת פרכת. עם זאת, להמחיש ומעקב ויוו היווצרות כלי דם בזמן אמת, פיגומים תלת מימדי (3D) או רקמת העצם החדש הוא עדיין מהווה מכשול עבור הנדסת רקמות העצם. מיקרוסקופ multiphoton (MPM) הוא הרומן מודאליות הדמיה זה יכול לרכוש נפחי נתונים מבנים ביולוגיים בצורה מינימלית פולשנית ברזולוציה גבוהה. מטרת מחקר זה הייתה להמחיש אנגיוגנזה עם מיקרוסקופ multiphoton ויוו ב לפיגום 3D-PLGA/nHAp מהונדסים לתיקון פגם calvarial עצם קריטי. PLGA/nHAp פיגומים היו functionalized לאספקת pdgf-b גורם גדילה גנים נושא וקטורים lentiviral (LV –pdgfb) כדי להקל על אנגיוגנזה וכדי לשפר את התחדשות העצם. ב מושתל לגרדום calvarial קריטי עצם פגם דגם העכבר, האזורים כלי דם (BVAs) ב- PHp פיגומים היו גבוהות משמעותית יותר ב- PH פיגומים. בנוסף, הביטוי של pdgf-b ו גנים הקשורים אנגיוגנזה, vWF , VEGFR2, גדל בהתאמה. ניתוח MicroCT ציינו כי היווצרות העצם החדש בקבוצה PHp השתפרו באופן דרמטי לעומת קבוצות אחרות. ידיעתנו זו הפעם הראשונה מיקרוסקופ multiphoton היה בשימוש רקמת העצם-הנדסה לחקור אנגיוגנזה 3D לגרדום ביו-מתכלים ויוו , בזמן אמת.
העצם היא רקמה vascularized מאוד שממשיך לשפץ במהלך החיים של הפרט1. התחדשות העצם מהירה ויעילה של עצם גדול פגמים הנובעים טראומה, יתאחה, כריתות גידולים או מומים ואסטתיים היא תהליך פיזיולוגי מורכב. גישות טיפוליות המסורתי המשמש לתיקון פגם העצם כוללים בשתל, להשתלת ההשתלה, אך השימוש בהם כרוך במספר בעיות, מגבלות, כגון זמינות מוגבלת, תורם משמעותי באתר תחלואה, סיכון גבוה לזיהום, ו לארח הדחייה החיסונית2,3. עם זאת, שתלי עצם מלאכותית להציע חלופה יעילה כדי להקל על מגבלות אלה. הם יכול להתבצע מחומרים מתכלים, קל יהיה להמציא עם גודל הנקבוביות מתאימים, יכולים להיות מהונדסים4,5.
כיום, יש כבר מועסקים פיגומים הנדסת רקמות שונות בפיתוח של רקמות מהונדסים עצם6,7. כדי לגרום העצם תיקון והתחדשות ביעילות רבה יותר, biomaterials מהונדסים בשילוב עם גורמי גדילה יש בקע, השיגו תוצאות טובות8,9. למרבה הצער, מחצית חיים קצר, קל שלעולם לא פעילות ו supraphysiological במינון של גורמי גדילה על יעילות טיפולית להגביל יישום קליני שלהם10. כדי להתגבר על בעיות אלה, הוכח את המשלוח של גורם גדילה גנים במקום גורמי גדילה כמו גישה יעילה לקיים אתריים לטיפול של פגמים osseous ומחלות11,12. וקטורים ויראלי הם מבטיחים מסירה כלים עבור התחדשות רקמות עקב שלהם גבוהה לבטא יעילות13.
בין גורמי הגדילה גורם גידול נגזר טסית דם (PDGF-BB) נבחר במחקר זה כי זה לא רק של mitogen, chemoattractant עבור תאים mesenchymal ו- osteogenic, אך גם מעורר אנגיוגנזה14,15 . מחקרים קודמים קליניות הראו כי PDGF-BB יכולים בבטחה וביעילות לקדם את עצם תיקון פגמים osseous חניכיים16,17. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי PDGF-BB מעוררת אנגיוגנזה המניע תא אנדותל ההגירה והתפשטות ויוו18,19. יתר על כן, PDGF-BB יכול גם לדקלם גזע mesenchymal (MSCs) מסוגל להבדיל לתוך תאי אנדותל20, ואת זה מדגיש עוד יותר את התפקיד הפוטנציאלי של MSCs כורוידאלית. לכן, וגורם להיווצרות דה נובו להערכת ב פיגומים עם PDGF-BB הוא צעד חשוב עבור התיקון של רקמות התפתחה פיגומים בהנדסת רקמות העצם.
עצם פגם הריפוי הוא תהליך morphogenetic רקמות דינמי הדורש פרכת מתואמת של אנגיוגנזה עמדות תיקון21. Neoangiogenesis לתוך פיגומים רקמות מהונדסים מושתל הוא דרישה מוקדמת חיוני לאספקת תאים עם חומרים מזינים וחמצן וצמיחה של הישרדות ועל הסרת פסולת מטבולית. בשימוש נפוץ שיטות הדמיה, כולל צילום רנטגן מיקרו-שחושב טומוגרפיה (microCT), דימות תהודה מגנטית (MRI), סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) ו לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ, מוחלים במקום בבדיקה היסטולוגית להשיג אנגיוגנזה מידע22,23. עם זאת, שיטות אלה בפני מכשולים שונים להמחיש, מדידה neovasculature ב 3D פיגומים בהנדסת רקמות העצם. מיקרוסקופ multiphoton (MPM) היא טכניקת הדמיה יחסית הרומן כי יש יתרון מובהק בו זמנית להמחיש תאים, מטריצה חוץ-תאית, וסביב רשתות כלי דם ויוו. הוא בעל יכולת הדמיה תלת מימדי הטבועה של רקמות עמוק חדירה וגורם נזקי נמוכה. לפיכך, בעשור האחרון, MPM צברה הרבה תשומת לב ב מחקרים ביו24, לרבות מדעי המוח, אימונולוגיה ודינמיקה תאי גזע. עם זאת, הוא בקושי משמש במחקר אורטופדי.
העצם היא רקמה vascularized מאוד עם קיבולת ייחודי ללא הרף להחלים ולהתאושש לשפץ לאורך כל חייו של הפרט1. הרמה של vascularization חשוב פרכת ותיקון פגם. Vascularization נמוכה מגבילה את יישום קליני רחב של רקמות מהונדסים עצם. בניית עצם רקמות מהונדסים מאוד vascularized לפי תורת ביומימטיקה הפך להיות כלי לתיקון פ?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי התוכנית טווס שנג’ן, סין (לא 110811003586331), שנג’ן התוכנית מחקר בסיסי (מס ‘ JCYJ20150401150223631, מס JCYJ20150401145529020, מס JCYJ20160331190714896), גואנג-דונג הציבורית מחקר ובניית יכולת התוכנית המיוחדת (מספר 2015A020212030), הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (מספר 81501893), התוכנית מחקר בסיסי מייג’ור הלאומי של סין (2013CB945503), ו האירוע מתקיים תוכנית חדשנות לחוקרים צעירים מצוינים (Y5G010).
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
Paraffin | Leica | RM2235 | |
Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
microCT | Bruker | 1176 | |
commercial software | Bruker |