Summary
إزالة مرة واحدة من الجسم، والأنسجة العصبية تتأثر كثيرا الظروف البيئية، مما يؤدي إلى تدهور في نهاية المطاف من الأنسجة بعد 6-8 ساعة. باستخدام طريقة حضانة فريدة من نوعها، التي تراقب عن كثب وتنظم البيئة خارج الخلية من الأنسجة، وقابلية الأنسجة يمكن تمديدها بشكل ملحوظ ل> 24 ساعة.
Abstract
الحادة الاستعدادات الأنسجة العصبية، وشرائح المخ وwholemount في شبكية العين، وعادة ما يمكن أن تستمر إلا لل6-8 ساعة بعد تشريح. وهذا يحد من الوقت التجريبية، ويزيد من عدد الحيوانات التي تستخدم في الدراسة. هذا القيد على وجه التحديد الآثار بروتوكولات مثل التصوير الكالسيوم التي تتطلب فترات طويلة قبل الحضانة مع الأصباغ التطبيقية حمام. ويرتبط 4 ساعات بعد تشريح بإحكام مع انخفاض في صحة الأنسجة - نمو البكتيريا الأسي خلال 3. توضح هذه الدراسة وسيلة للحد من انتشار البكتيريا في الأعمال التحضيرية الحادة للحفاظ على الأنسجة العصبية قابلة للحياة لفترات طويلة من الزمن (> 24 ساعة) دون الحاجة للمضادات الحيوية، والإجراءات العقيمة، أو وسائل الإعلام زراعة الأنسجة التي تحتوي على عوامل النمو. عن طريق دورة السائل خارج الخلية من خلال الأشعة فوق البنفسجية والحفاظ على الأنسجة في غرفة مخصصة عقد في 15-16 درجة مئوية، تظهر الأنسجة لا فرق في الخصائص الكهربية، أو الاشتراكية الكالسيومgnaling من خلال الأصباغ الكالسيوم داخل الخلايا في> 24 ساعة postdissection. وهذه الطرق تمتد ليس فقط وقت تجريبي لتلك التي تستخدم الأنسجة العصبية الحادة، ولكن سوف يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لاستكمال أهداف تجريبية، وسوف تحدد معيار الذهب للحضانة الأنسجة العصبية الحادة.
Introduction
الكهربية والتصوير وظيفي (الكالسيوم، والجهد الأصباغ الحساسة) وهما من التقنيات التجريبية الأكثر شيوعا في علم الأعصاب. الدماغ الاستعدادات شريحة وwholemount في شبكية العين، والتي سيتم مناقشتها هنا، وتوفير وسيلة لدراسة الخصائص الكهربية واتصال متشابك دون تلوث من التخدير أو مرخيات العضلات. شرائح الدماغ وشبكية العين wholemount حفاظ على السلامة الهيكلية، على عكس الثقافات أو الخليط خلية، والسماح للدراسة دوائر محددة وشبكات الدماغ 1. تسجيلات من الأنسجة المعزولة لها يتم استبعاد من المزايا أكثر في الجسم الحي التسجيلات الحركات المرتبطة ضربات القلب والتنفس. وعلاوة على ذلك، والتصور المباشر يسمح فئات معينة من الخلايا لتكون مستهدفة، والتطبيق المحلي للأدوات الدوائية 2 و 3.
تسجيلات التصحيح المشبك وأحسبالبوتاسيوم صبغ التحميل في wholemount الشبكية معقدة بسبب وجود الداخلية الحد من غشاء (ILM)، الذي يغطي طبقة الشبكية العقدة الخليوي (RGC) ويمنع الوصول المباشر إلى الخلايا. عادة، يتم كشط هذا الغشاء بعيدا مع ماصة الزجاج للسماح التطبيق المباشر للماصة التصحيح وتشكيل ختم gigaohm على خلية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، والأصباغ الكالسيوم تطبيقها حمام لا تعبر ILM وإما أن يتم حقنه تحت هذا الغشاء 4، نقل retrogradely حقن التالية في العصب البصري 5 أو electroporated من خلال الأنسجة 6. وعلاوة على ذلك، عندما تستخدم نموذجا القوارض من التهاب الشبكية الصباغي، الماوس الثالثة / الثالثة، وILM هو أكثر سمكا وأكثر من ذلك لا يمكن اختراقها. هنا، ونحن نستخدم تقنية لإزالة ILM مع الهضم الأنزيمي 7، للسماح كلا في كل مكان الكالسيوم صبغ التحميل، والوصول المباشر إلى خلايا الشبكية العقدة لrecordi التصحيح، المشبكخ ع 8.
تعتمد التسجيلات ناجحة سواء من شرائح الدماغ أو wholemount في شبكية العين على تشريح وحضانة الأنسجة العصبية قابلة للحياة. عادة، يتم استخراج الأنسجة صباح يوم التجربة والمحتضنة في الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF) حتى يتم استخدامها للتسجيلات. عادة، لا تزال الأنسجة قابلة للحياة 6-8 ساعة، مع تدهور كبير بعد هذه النافذة الوقت. ومع ذلك، كل شرائح الدماغ والاستعدادات الشبكية wholemount عادة ما تنتج المزيد من الأنسجة مما يمكن تسجيله من ضمن هذه الفترة الزمنية القصيرة. ونتيجة لذلك، غالبا ما يتم تجاهل الأنسجة في نهاية اليوم واكتمال تشريح مرة أخرى في الأيام اللاحقة. وهذا يعني يستخدم حيوان آخر و~ 2 ساعة من الإعداد وتشريح / تلطيخ المتكررة. يصف بروتوكول التالية وسيلة لإطالة حياة بعض الأنسجة العصبية لأكثر من 24 ساعة، وهذا يعني عددا أقل من الحيوانات تستخدم، والمزيد من الوقت التجريبي هو متاح. الأنسجة الحيوية ثكما تقييمها من خلال تسجيل الخصائص الكهربية وديناميات الكالسيوم، وكانت هذه الخصائص لا يمكن تمييزه بين <4 ساعات و> 24 ساعة postdissection.
وتشير هذه النتائج التي هي خصائص خلية واحدة سليمة وظيفية بعد حضانة طويلة فحسب، بل نشاط الشبكة، وفقا لتقييم الكالسيوم التصوير والتسجيلات الكهربية، هو دون تغيير> 24 ساعة postdissection. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الأصباغ الكالسيوم يمكن أن يبقى في الخلايا لفترات طويلة دون أن تسبب أي آثار ضارة. تطبيق هذا البروتوكول يوضح أن النشاط الوظيفي للخلايا العصبية في الأنسجة العصبية الحادة يمكن أن يستمر لفترات طويلة، وبمجرد درجة عالية من التنظيم والبيئة الخارجية. وعلاوة على ذلك، كما الجدوى الأنسجة تختلف اختلافا كبيرا بين المختبرات بسبب البروتوكولات حضانة مختلفة، يحدد هذا الأسلوب معيار الذهب للمعلمات المثالية التي يجب تطبيقها للحد من التباين في صحة نوي الحادالأنسجة رونالد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف بروتوكول أدناه إعداد C57BL / 6 و C3H / و(تتدهور retinally) الأنسجة العصبية الماوس، ولكن تقنيات مشابهة يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى. وكانت جميع الحيوانات السليمة والتعامل مع الظروف القياسية لدرجة الحرارة، والرطوبة، 12 ساعة ضوء / دورة الظلام، وحرية الحصول على الغذاء والماء، ودون أي محفزات الإجهاد المقصود. تمت الموافقة على جميع التجارب وتنفيذها وفقا للجنة جامعة ويسترن سيدني رعاية الحيوان والأخلاق وفقا للاستخدام الحيواني والمبادئ التوجيهية الرعاية (الحيوان البحوث السلطة # A9452، # A10396 و# A8967).
1. إعداد شريحة الدماغ
- تخدير الحيوانات عن طريق الاستنشاق من الأيزوفلورين (5٪)، وقطع رأس باستخدام المقصلة القوارض. إزالة الدماغ بسرعة، كما هو موضح سابقا 9 ووضعه في حل المثلج الفسيولوجية (ACSF) التي تحتوي على (مم): 125 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1 MgCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4، 2 CaCl 2، 25NaHCO 3 و 25 وسكر العنب، ومشبعة كربوجين (95٪ O 2/5٪ CO 2 الخليط، 310 ملي أوزمول، ودرجة الحموضة 7.4).
- قطع شرائح الدماغ، في المنطقة من الفائدة، 300 ميكرون سميكة مع مشراح تهتز.
- نقل شرائح إلى المخصصة بنيت نظام الحضانة التي تراقب عن كثب، وتسيطر على مستويات الحموضة (الرقم الهيدروجيني 7،2-7،4)، وتدفق كربوجين، ودرجة الحرارة كما هو موضح سابقا 10 و 11.
- ضبط درجة الحرارة غرفة الأولية إلى 35 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة، ثم خفض ببطء إلى 15-16 درجة مئوية كما هو مبين في الشكل 1C. ثم احتضان شرائح في نظام الحضانة لحين الحاجة إليها، إما لالكهربية أو التصوير.
ملاحظة: إذا كانت لاستخدامها شرائح للكالسيوم التصوير، اتبع الخطوات التالية قبل تبريد الأنسجة تحت RT.
إعداد 2. الشبكية Wholemount والداخلية الحد من إزالة غشاء
- إعداد wholemounts الشبكية تحت إما وضعها الطبيعيظروف الإضاءة المختبر أو خافت أحمر / الأشعة تحت الحمراء ضوء.
- الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم وعيون استأصل على الفور. جعل قطع صغيرة على طول مشرشر أورا، ومكان سواء في أميس وسائل الإعلام، أو ACSF تحتوي على (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 25 NaHCO 3، 3 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2 و 10 الجلوكوز، 0.5 L-الجلوتامين، و تشبع مع كربوجين (95٪ O 2/5٪ CO 2 الخليط؛ ~ 300 ملي أوزمول، ودرجة الحموضة 7.4)، في RT.
- على الفور إزالة القرنية، العدسة والجسم الزجاجي عن طريق قطع على طول مشرشر أورا مع مقص صغير وإزالة العدسة والجسم الزجاجي مع ملقط. وضع الأنسجة في نظام الحضانة في RT.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الأنسجة الشبكية في العين الكأس، بعد انخفاض درجة الحرارة بشكل بطيء إلى 15-16 درجة مئوية، ل> 24 ساعة في نظام الحضانة لحين الحاجة إليها. - لإزالة ILM، ونقل العين كوب يحتوي على شبكية العين في جرة زجاجية صغيرة تحتوي على 30 وحدة / مل غراء، 1 مم L-سيستين، 0.5 ملي EDTA و 0.005٪ الدناز في Earl's-محلول ملحي متوازن (BSS) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تطبيق 95٪ O 2/5٪ CO 2 إلى الحل من خلال الغطاء ولكن لا فقاعة. في حالة استخدام الأنسجة من الحيوانات الصغيرة (<6 أسابيع)، وتمييع الحل لنصف القوة.
- وقف الهضم الأنزيمي، عن طريق وضع النسيج في محلول مخاطاني البيض (10 ملغ / مل)، وديوان الرقابة المالية (10 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة في BSS إيرل. غسل الأنسجة تماما مع ACSF قبل نقلها إلى نظام الحضانة وتقلل درجة الحرارة إلى 15-16 درجة مئوية.
- الحفاظ على الأنسجة الشبكية في العين كوب لحين الحاجة إليها. لنقلها إلى المجهر، عزل شبكية العين من العين كوب ومقطعة إلى 4 قطع مع razorblade. إذا كنت بحاجة شبكية العين بأكملها، وجعل أربعة الجروح الصغيرة في المحيط الخارجي للشبكية العين للسماح له أن يكذب شقة.
ملاحظة: للحصول على تجارب التصوير، والحمل مع الكالسيوم الأصباغ قبل نقلها إلى نظام الحضانة، انظر أدناه.
3. الحفاظ على الأنسجة في حاضنة
- تعميم ACSF من خلال الغرفة الثانية (UVC غرفة، الذي بني كما هو موضح سابقا 12) معزولة عن الغرفة الرئيسية ويتعرض إلى 1.1 W UVC الضوء (254 نانومتر، 5W / 2P معقم مصباح الأشعة فوق البنفسجية) وذلك لأشع البكتيريا العائمة في الحل (الشكل 1A). ضوء توقيت السيطرة UVC عبر الموقت للبرمجة باستخدام ميزة العشوائية التي تدور حول في أوقات متفاوتة ما بين 15 و 26 دقيقة كل 15-30 دقيقة لتجنب الإفراط في التدفئة من ACSF.
- تعيين معدل التدفق في غرفة UVC إلى 12 مل / دقيقة كما سبق وذكرت 12. تغطية غرفة UVC مع رقائق الألومنيوم لمنع UVC الإضاءة خارج الغرفة، التي يمكن أن تتلف الأنسجة العصبية.
ملاحظة: للحصول على أنسجة الشبكية الظلام تكييفها، وتطبيق غطاء مصنوعة خصيصا لالقاعة الرئيسية لمنع الضوء. - استخدام مضخة تحوي على circulaالشركة المصرية للاتصالات الحل (ACSF) من خلال المجلسين وبلتيير لوحة الباردة الحرارية برودة إما باردة أو حرارة الغرفة الرئيسية لدرجات الحرارة المطلوبة في حدود 0-50 درجة مئوية. لحضانة الأنسجة المثلى، استخدم 15-16 درجة مئوية لمدة البقاء على المدى الطويل.
4. الكالسيوم صبغ تحميل
- اختيار الأصباغ الكالسيوم على أساس تفضيل الباحث الفردية. هنا نستخدم FURA-02:00، فلوو-08:00 أو فلوو-04:00. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لالأصباغ الأخرى أيضا: حل الأصباغ الكالسيوم في DMSO إلى بوليمرات 1 حل ملم و 1٪ كتلة (على سبيل المثال، حمض 127 pluronic) إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر ويصوتن لمدة 10 دقيقة.
- إضافة إلى حل ACSF إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر، 0.01٪ كتلة بوليمرات لشرائح الدماغ، و 20 ميكرومتر (شبكية العين)، 0.02٪ كتلة بوليمرات لشبكية العين. في الشبكية (غراء معاملة) وشرائح الدماغ من الحيوانات الصغيرة، تحميل إلى الحمام لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية (FURA-02:00) أو في RT (فلوو-04:00، Fلوه-08:00).
- للحيوانات الكبار، (> 12 أسبوعا) ماصة الأصباغ (50 ميكرولتر) مباشرة على شرائح الدماغ، والحفاظ على ل75 دقيقة للسماح للتغلغل أفضل من الصبغة في الطبقات العميقة.
- لضمان الأوكسجين الكافي للشريحة المغمورة أثناء الحضانة صبغ، وإعداد غرفة زجاجية تحميل مع غطاء مغلق (جرة دائرية قطرها 2.5 سم، 3.5 سم الارتفاع) مع الأصباغ الكالسيوم المخفف في 2.5 مل من ACSF. الأوكسجين بشكل مستمر مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. لا فقاعة.
- بعد صبغ تحميل، وغسل الأنسجة مع ACSF ونقل إلى نظام الحضانة، والحد ببطء درجة الحرارة إلى 15-16 درجة مئوية حتى الاستخدام التجريبي.
5. تسجيلات الكهربية والتصوير
- وضع الأنسجة في غرفة تسجيل المغمورة تحت المجهر، ويروي مع الاوكسيجين ACSF بمعدل تدفق 4-5 مل / دقيقة إما في RT (~ 22 درجة مئوية) أو درجة حرارة الفسيولوجية (~ 35 درجة مئوية). الحولد الأنسجة في المكان باستخدام العرف '' القيثارة ''، مصنوعة من النايلون أو الذهب المواضيع امتدت ولصقها في جميع أنحاء قطعة على شكل حرف U من الذهب أو البلاتين الأسلاك.
- لالكهربية:
- إعداد الماصات تسجيل من 1.5 مم (1.19 ملم ID) زجاج البورسليكات باستخدام مجتذب micropipette لتحقيق المقاومة النهائية 5-6 MΩ.
- ملء ماصة مع 3-4 ميكرولتر من حل داخلي كما هو موضح سابقا 13 وتصور الخلايا تحت الأشعة تحت الحمراء التفاضلية التدخل التباين (IR-DIC) باستخدام كاميرا CCD. يجب أن تكون مصممة على حل الخلايا بعناية إلى كل تجربة لتحقيق النتائج التجريبية.
- موقف ماصة، مع الحفاظ على ضغط إيجابي تطبيقها من خلال منفذ الشفط على حامل ماصة، على غشاء الخلية باستخدام micromanipulator. منذ أن تم نقل ILM من شبكية العين، لا يلزم كشط غشاء مسبق. مرة واحدة ماصة هي على الخلية، وتطبيق سلبية لطيفالضغط على ماصة لتحقيق ختم gigaohm. ثم تمزق غشاء الخلية مع كمية وجيزة من الضغط السلبي.
- جعل خلية كاملة التسجيلات current- أو الجهد المشبك باستخدام التقنيات القياسية حسب الاقتضاء.
- الكالسيوم التصوير:
- للتصوير ratiometric من FURA-2، استخدام فائقة الطول الموجي الجلاد سرعة لتوفير موجات الإثارة من 340 نانومتر و 380 نانومتر. يمر الضوء المنبعث من الخلايا الفردية من خلال تصفية الانبعاثات من 510 ± 20 نانومتر، والتقاط مع حساسية عالية وسرعة عالية في الكاميرا الرقمية.
- لطول موجة الإثارة واحد من فلوو-4، وعلى ضوء فلتر الإثارة من خلال 460-490 نانوميتر تمرير تصفية والضوء المنبعث من خلال 515-550 نانومتر الفرقة تمرير مرشح. لأسرع والأكثر حساسية تسجيل استخدام الكاميرا الرقمية بسرعة عالية مثل. الحصول على صور كما هو مطلوب.
- قياس التغيرات في مضان بوصفها وظيفة من الزمن سواء في الطول الموجي واحد (فلوو-4) أو باستخدام نسبة الطول الموجيطريقة (FURA-2)، كما هو موضح سابقا 8، 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تنظيم محكم من الحمولة الجرثومية ودرجة حرارة ACSF خلال حضانة ضروري للمحافظة على سلامة الأنسجة العصبية. يمكن أن يكون الأمثل ذلك من خلال التعرض للأشعة UVC والحفاظ على درجة حرارة ACSF في 15-16 درجة مئوية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، فإن ACSF المعلمات ختم (وكالة الأنباء الجزائرية، الشكل 1C) توفر مجرب مع سجل من الظروف البيئية (الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة)، مما يتيح معيار الذهب للمعاملات عندما تفرخ الأنسجة العصبية، والتي، إذا ما اتبعت، وتقليل التباين بين التجارب.
الشكل 1. نظام الحضانة التي تمكن تنظيم ضيق البيئة الأنسجة. A، رسم تخطيطي للنظام حضانة مكونة من التبريد لوحة بلتيير، القاعة الرئيسية، مضخة تحوي وغرفة UVC. B،عرض جانب من الغرفة الرئيسية التي تبين مدخل ومخرج نقاط من ACSF، فضلا عن مدخل كربوجين ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة تحقيقات. يتم وضع النسيج على شبكة كما هو محدد. يتم إرفاق كل تحقيقات قياس إلى غطاء للسماح الاستقرار الهيكلي. C، ACSF معلمات ختم واصفا درجة الحرارة ودرجة الحموضة في ACSF خلال الحضانة. D، أعلى نظرا القاعة الرئيسية تظهر الثقوب المتزايدة للتحقيقات القياس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بقاء الأنسجة يمكن قياسها عن طريق نشاط الشبكة (الشكل 2)، وكذلك طرق التصوير المختلفة، بما في ذلك ردود الكالسيوم (الشكل 2B، C). لمراقبة نشاط الشبكة، طبقنا ACSF تحتوي على نسبة عالية من كلوريد البوتاسيوم (بوكل و 30 ملم) محليا، مما أدى إلى الاستقطاب من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية داخل محيط K + تطبيقها. هذا الاستقطاب يمكن ملاحظتها من خلال الزيادة في العابرين الكالسيوم (الشكل 2B، C) والنشاط ارتفاعه (الشكل 2D)، الذي يشغل أيضا منصب مؤشر الفسيولوجية لبقاء الخلية. نتائجنا تظهر ان ارتفاعه النشاط في شرائح التي حضنت ل> 24 ساعة في نظام الحضانة كانت مشابهة لشرائح "جديدة" حضنت لفترات أقصر (> 4 ساعات؛ الشكل 2D). وعلاوة على ذلك، كانت قابلية الخلايا العصبية الفردية، التي تم رصدها من خلال التسجيلات الكهربية داخل الخلايا من كلا خصائص الغشاء السلبية والإيجابية، بما في ذلك احتمال غشاء يستريح، ومقاومة المدخلات، ووقت ثابت، وإمكانية عمل مماثلة لمعلمات عنها في الأدبيات 15 (الشكل 2E، F ).
الطبقة = "jove_content"> 
الشكل 2. الكهربية والكالسيوم خصائص الدماغ شرائح بعد الحضانة لفترات طويلة. A، صورة شريحة الدماغ اتخذت 28 ساعة تقطيع مع قطبين تسجيل خارج الخلية المستخدمة لقياس نشاط الشبكة بعد. ويستخدم القطب الثالث (ملحوظ مع النجمة) إلى نفخة 30 ملم من بوكل. B، وقت الصور انقضاء شرائح محملة فلوو-04:00 ل> 24 ساعة، والتي تصور زيادة في العابرين الكالسيوم داخل الخلايا بعد تطبيق حمام من بوكل. C، العابرين الكالسيوم داخل الخلايا التالية تطبيق وجيزة من بوكل (30 ملم، 1 ثانية). الحمراء - متوسط إشارة، رمادي - آثار الكالسيوم في الخلايا واحد كما هو مبين في (ب). كانت D، تسجيل الفسيولوجية خارج الخلية من نشاط الشبكة قبل وبعد تطبيق بوكل (الأسهم الحمراء) دون تغيير إلى حد كبير بين شرائح "جديدة" (<4 ساعات postdissection) وتلك التي حضنت ل> 24 ساعة في الحاضنة. ملاحظة الزيادة في ارتفاعه النشاط فورا بعد تطبيق بوكل مشيرا إلى الخلايا العصبية قابلة للحياة التي تستجيب للزيادة في [K +] مع الاستقطاب. E & F، السلبي (E)، ونشط خصائص (F) غشاء الخلايا العصبية الهرمية التالية 2 ح (آثار الزرقاء) أو 26 ساعة (آثار السوداء) من الحضانة في نظام الحضانة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتوفير إمكانية الوصول المباشر إلى خلايا طبقة الخلايا العقدية للشبكية wholemount من المنحطة retinally الفئران الثالثة / الثالثة، وهضم ILM بواسطة غراء انزيم 7 و 8. بعد الهضم، RGCs والخلايا عديم الاستطالات المشردين يمكن تصور بوضوح اوندإيه مدينة دبي للإنترنت إضاءة (الشكل 3A)، والخلايا يمكن أن يكون هدفا للتسجيلات التصحيح المشبك دون أي كشط مسبق من ILM. وتظهر الممثلة تسجيلات المشبك الحالي من RGC في الشكل 3B. الاستقطاب الخلية من خلال ماصة التصحيح تسبب عمل جيل محتمل تعتمد على الجرعة، مما يدل على بقاء الخلايا بعد العلاج غراء.
يسمح إزالة ILM أيضا تلطيخ كل مكان من طبقة الخلايا العقدية (GCL) مع FURA-02:00 (الشكل 3D) والخلايا استجابت ل30 تطبيق ملي بوكل مع زيادة كبيرة في نسبة 340/380 نانومتر نسبة إلى F 0، مما يدل على كبير زيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا (الشكل 3E). عادت مستويات الكالسيوم الى الاساس التحفيز التالية والخلايا يمكن حفزت لاحقا لإنتاج استجابة السعة مماثلة. وعلاوة على ذلك، كانت هذه الردود تمييزه بين صسجلت etinae في <4 ساعات و> 24 ساعة postdissection (الشكل 3F، G).
الرقم 3: تسجيلات الكهربية والكالسيوم في الشبكية Wholemount. A، التفاضلية صورة التدخل النقيض من تسجيل التصحيح، المشبك من الخلايا العقدية للشبكية في GCL بعد الهضم غراء. ب، خلايا تحتفظ الجرعة تعتمد ردود ارتفاعه عند استقطابها مع 50 و 100 و 150 على التوالي السلطة الفلسطينية. C & D، إزالة من الحد من الغشاء الداخلي قبل تطبيق حمام من FURA-02:00 تسمح تحميل كل مكان في خلايا الشبكية، الصورة التي اتخذت مع 380 نانومتر الإثارة. E، عندما يتم تطبيق 30 ملي بوكل ASCF، 85٪ من الخلايا الملون وردت مع زيادة في نسبة 340/380. F & G، الزيادة في عوائد 340/380 نسبة إلى خط الأساس بعد 30 تطبيق ملي بوكل (الحانات الحمراء)، والخلايا تستجيب لتحفيز لاحقا كل من <4 ساعات و> 24 ساعة بعد تشريح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة حضانة لتمديد بقاء الأنسجة العصبية الحادة للتصوير والكهربية التجارب، مما يؤدي إلى خفض أعداد الحيوانات اللازمة لاستكمال أهداف التجريبية. عمليتان رئيسيتان تحكم تدهور الأنسجة العصبية على مر الزمن: أ) زيادة مستويات البكتيريا، والزيادة المصاحبة في الذيفان الداخلي الجرثومي المفرج عنهم، والثاني) التحفيز الزائدة التي تتبع إجراء تشريح الصدمة 10. كما الأنسجة العصبية الحادة هي العزل للبيئة، تنظيم محكم للبيئة الأنسجة من خلال الرصد الدقيق لمستويات الحموضة ودرجة الحرارة والبكتيريا هو ضروري للحفاظ على النشاط الخلوي وكذلك سلامة الشبكة. تشريح، ومعالجة الأنسجة (غراء الهضم، الكالسيوم صبغ التحميل) يمكن أن يستغرق أكثر من 2 ساعة كاملة، مما تسبب في انخفاض في الوقت التجريبية. ومع ذلك، منذ الأنسجة يمكن أن تبقى في نظام الحضانة ل> 24 ساعة من دون خسارة قابلة للقياس طن جدوى 7، 8، يحتاج هذا الإعداد فقط أن يتم الانتهاء مرة واحدة للحصول على> 24 ساعة من النتائج. كجزء من استراتيجية 3RS (استبدال، والحد، وصقل) التي تهدف إلى توفير مبادئ توجيهية لاستخدام الأخلاقية للحيوانات 16، وهذه الطريقة سوف يكون لها تأثير كبير على تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في هذا النوع من التجارب.
الهضم من ILM من الأنسجة wholemount الشبكية يسمح استهداف السهل من الخلايا في GCL للتسجيلات التصحيح المشبك في كل مكان والكالسيوم صبغ التحميل من قبل تطبيق الحمام. هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص لشبكية المنحطة فيها ILM هو أكثر سماكة وأكثر صعوبة في اختراق عن طريق كشط مع ماصة الزجاج. وعلاوة على ذلك، وإعداد غراء يوفر وسيلة لأداء التسجيلات خلايا يقترن باستخدام قطبين لتسجيل من الخلايا إلى جانب الفجوة تقاطع في GCL، وهو الأمر الذي لم يكن ممكنا في السابق. ومع ذلك، غراء الهضم المرجح أن لديه بعض التأثيرات على علم وظائف الأعضاء في شبكية العين العادي كما ثبت K + التعبير مستقبلات لتغييرها في المستقبلات الضوئية التالية التفكك مع غراء 6. ومن الممكن أيضا أن العمارة الشبكية يتأثر. أظهرت Velte وMasland أنه على الرغم من بعض RGC somas والتشعبات تضررت من العلاج غراء لإزالة ILM، فإنها يمكن أن تسجل بنجاح من RGC التشعبات البعيدة إلى سوما في معظم الخلايا العصبية، مما يدل على السلامة الهيكلية للخلايا والعمليات 5. الأهم من ذلك، ترك شبكية العين تعلق على الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) والصلبة، كما هو موضح أعلاه، يعزل شبكية العين الخارجية من نشر غراء ويمكن الحد من أي آثار سلبية على قطاعات الخارجية مستقبلة للضوء عند تطبيق هذا البروتوكول لWT الشبكية. في كلتا الحالتين، والعلاج غراء، أو كشط للILM، بعض تلف الخلايا سوف تحدث، يجب المجرب اختيار الطريقة المناسبة لexperimالسؤال ental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
References
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
- Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
- Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
- Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
- Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
- Buskila, Y., et al.
- Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
- Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).
