L'incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Summary

Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per> 24 h.

Abstract

Acuta preparati tessuto neuronale, fettine di cervello e della retina wholemount, di solito può essere mantenuta solo per 6-8 ore dopo la dissezione. Ciò limita il tempo sperimentale, e aumenta il numero di animali che sono utilizzate per studio. Questa limitazione in particolare gli impatti protocolli come l'imaging di calcio che richiedono una prolungata pre-incubazione con coloranti vasca da applicare. crescita batterica esponenziale entro 3 - 4 h dopo il taglio è strettamente correlata con una diminuzione della salute dei tessuti. Questo studio descrive un metodo per limitare la proliferazione di batteri preparati acute per mantenere il tessuto neuronale vitale per periodi prolungati di tempo (> 24 h) senza la necessità di antibiotici, procedure sterili o terreni di coltura contenenti fattori di crescita. Con ciclismo liquido extracellulare tramite irradiazione UV e mantenendo il tessuto in una camera di contenimento personalizzati 15 - 16 ° C, il tessuto non mostra differenze nelle proprietà elettrofisiologiche, o si calciognaling attraverso coloranti intracellulari di calcio a> 24 h postdissection. Questi metodi non solo estendere il tempo di sperimentazione per coloro che utilizzano il tessuto neuronale acuta, ma ridurrà il numero di animali necessari per completare gli obiettivi sperimentali, e stabiliscono un gold standard per l'incubazione del tessuto neuronale acuta.

Introduction

Elettrofisiologia e di imaging funzionale (calcio, tensione di coloranti sensibili) sono due delle tecniche sperimentali più comunemente utilizzati nel campo delle neuroscienze. preparati fetta del cervello e della retina wholemount, che sarà esaminato qui, forniscono un mezzo per esaminare le proprietà elettrofisiologiche e connettività sinaptica senza contaminazione da anestetici o miorilassanti. Fettine di cervello e della retina wholemount mantenere la loro integrità strutturale, a differenza di culture o omogenati cellulari, permettendo lo studio di circuiti specifici e reti del cervello ^1. Le registrazioni dal tessuto isolato presentano vantaggi rispetto vivo registrazioni i movimenti connessi con il battito cardiaco e la respirazione sono eliminati. Inoltre, la visualizzazione diretta permette specifiche classi di celle da mirati, e l'applicazione locale di strumenti farmacologici ^{2, 3.}

registrazioni patch-clamp e calcIUM Dye-carico in wholemount retina è complicato dalla presenza di Inner Limitazione membrana (ILM), che copre lo strato di cellule gangliari della retina (RGC) e impedisce l'accesso diretto alle cellule. Tipicamente, questa membrana è raschiato via con una pipetta di vetro per consentire l'applicazione diretta di una pipetta di patch e la formazione di un sigillo gigaohm su una singola cella. Inoltre, coloranti calcio bagno-applicata non attraversano la ILM e devono o essere iniettato sotto questa membrana ^4, retrograda trasportato dopo l'iniezione al nervo ottico o ⁵ elettroporate attraverso il tessuto ^6. Inoltre, quando si utilizza un modello di roditore di retinite pigmentosa, il mouse rd / rd, la ILM è più spessa e più impenetrabile. Qui, si usa una tecnica per rimuovere il ILM con digestione enzimatica ^7, per consentire sia onnipresente calcio dye-carico e l'accesso diretto alle cellule gangliari della retina per recordi patch-clampngs ^8.

registrazioni di successo da entrambi fettine di cervello o wholemount retina dipendono da dissezione e l'incubazione del tessuto neuronale vitali. Tipicamente, il tessuto viene estratto il mattino dell'esperimento ed incubato nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) fino al suo utilizzo per le registrazioni. Di solito, il tessuto rimane vitale per 6 - 8 ore, con notevole degrado in seguito questa finestra temporale. Tuttavia, entrambe le fettine di cervello e preparati RETINÆ wholemount solito producono più tessuto che può essere registrata all'interno di questo breve periodo di tempo. Di conseguenza, il tessuto è spesso scartata alla fine della giornata e la dissezione è completata nuovamente nei giorni successivi. Questo significa che un altro animale è utilizzato e ~ 2 ore di messa a punto e la dissezione / colorazione ripetuto. Il protocollo che segue descrive un metodo per prolungare la durata del tessuto neuronale per più di 24 ore, il che significa meno animali vengono utilizzati, e il tempo più sperimentale è disponibile. Tissue vitalità wvalutata attraverso la registrazione di proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio, e queste proprietà erano indistinguibili tra <4 ore e> 24 ore postdissection.

Questi risultati indicano che non solo sono proprietà delle celle singole intatte e funzionali dopo incubazione prolungata, ma l'attività di rete, come valutato dal calcio-imaging e registrazioni elettrofisiologiche, è invariato> 24 h postdissection. Inoltre, dimostriamo che coloranti calcio possono rimanere nelle cellule per periodi prolungati senza provocare effetti dannosi. L'applicazione di questo protocollo dimostra che l'attività funzionale dei neuroni nel tessuto neuronale acuta può essere mantenuta per lunghi periodi, una volta che l'ambiente esterno è altamente regolata. Inoltre, come la vitalità del tessuto varia notevolmente tra i laboratori a causa di diversi protocolli di incubazione, questo metodo stabilisce un gold standard per i parametri ideali che dovrebbero essere applicati per ridurre la variabilità nella salute di Neu acutatessuto Ronal.

Protocol

Il protocollo seguente descrive la preparazione di C57BL / 6 e C3H / He (retinally degeneri) tessuto neuronale mouse, ma le tecniche simili possono essere applicati ad altre specie. Tutti gli animali erano sani e maneggiato con condizioni standard di temperatura, umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, libero accesso a cibo e acqua, e senza stimoli di stress previsti. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in accordo con il comitato Occidentale Sydney University cura degli animali e etica e secondo l'uso animale e le linee guida per la cura degli animali (Research Autorità # A9452, # A10396 e # A8967).

1. Cervello Fetta Preparazione

1. Anestetizzare l'animale per inalazione di isoflurano (5%) e decapitare utilizzando una ghigliottina roditore. Rimuovere il cervello rapidamente, come descritto in precedenza ⁹ e posizionarlo nella soluzione ghiacciata fisiologica (aCSF) contenente (in mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 CaCl _2, 25NaHCO _3, 25 destrosio, e saturata con CarboGen (95% O _2/5% della miscela di CO _2; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Tagliare sezioni di cervello, nella regione di interesse, 300 micron di spessore con un microtomo vibrante.
3. Trasferire le fette di un sistema di incubazione su misura che monitora e controlla i livelli di pH (pH 7,2-7,4) da vicino, il flusso di CarboGen, e la temperatura come descritto in precedenza ^{10, 11.}
4. Impostare temperatura iniziale della camera a 35 ° C per 15 - 30 min, e poi lentamente ridurre a 15 - 16 ° C, come mostrato nella Figura 1C. Incubare fette nel sistema di incubazione fino a quando necessario, sia per elettrofisiologia o imaging.
   NOTA: se devono essere utilizzati per il calcio fette imaging, seguire i passi di seguito prima di raffreddamento del tessuto sotto RT.

2. retina Wholemount Preparazione e interna rimozione membrana limitante

1. Preparare wholemounts retina in entrambi i normalicondizioni di illuminazione di laboratorio o fioca luce rossa / infrarossi.
2. L'eutanasia degli animali da dislocazione cervicale e immediatamente gli occhi enucleare. Fare un piccolo taglio lungo la serrata, e il luogo in entrambe le Ames dei media, o aCSF contenente (mm): 125 NaCl, 25 NaHCO _3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 di glucosio, 0.5 L-glutammina, e saturare con CarboGen (95% O _2/5% CO ₂ miscela; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a temperatura ambiente.
3. Rimuovere immediatamente la cornea, cristallino e vitreo tagliando lungo la serrata con piccole forbici e la rimozione del cristallino e corpo vitreo con una pinza. Posizionare il tessuto nel sistema di incubazione a RT.
   NOTA: tessuto retinico può essere mantenuta nell'occhio coppa, dopo la riduzione di temperatura lento a 15 - 16 ° C, per> 24 ore nel sistema di incubazione fino a quando necessario.
4. Per rimuovere la ILM, trasferire l'occhio-tazza contenente la retina un vasetto di vetro contenente papaina 30 U / mL, 1 mM L-cistina, 0,5 mM EDTA e 0,005% in DNasi Earl's-Soluzione salina bilanciata (BSS) a 37 ° C per 20 min. Applicare 95% O _2/5% di CO ₂ alla soluzione attraverso il coperchio ma non fare bolle. Se si utilizza il tessuto da animali giovani (<6 settimane), diluire la soluzione a mezza forza.
   1. Arrestare digestione enzimatica, posizionando il tessuto in una soluzione ovomucoid (10 mg / mL) e BSA (10 mg / ml) per 10 min in BSS Earl. tessuto Lavare accuratamente con aCSF prima del trasferimento al sistema di incubazione e ridurre la temperatura a 15 - 16 ° C.
5. Mantenere tessuto retinico in un occhio-tazza fino a quando necessario. Per il trasferimento al microscopio, isolare la retina dall'occhio-tazza e tagliato in 4 pezzi con una lametta. Se è richiesta l'intera retina, fare quattro piccoli tagli nella periferia della retina per permettere di distendersi.
   NOTA: Per gli esperimenti di imaging, carico con calcio-coloranti prima del trasferimento al sistema di incubazione, vedere di seguito.

3. Il mantenimento dei tessuti nell'incubatrice

(Figura 1A, B).
1. Circolare aCSF attraverso una seconda camera (camera UVC, costruito come descritto in precedenza ¹²⁾ isolata dalla camera principale ed esposti a 1,1 W luce UVC (254 nm, 5W / 2P sterilizzatrice lampada UV) per eradiate batteri galleggiano nella soluzione (Figura 1A). temporizzazione luce controllo UVC tramite un timer programmabile tramite una funzione casuale che si attiva in tempi variabili tra 15 e 26 min ogni 15 - 30 min per evitare eccessivo riscaldamento del aCSF.
2. Impostare la portata nella camera UVC a 12 ml / min come riportato in precedenza ^12. Coprire la camera UVC con un foglio di alluminio per evitare l'illuminazione UVC di fuori della camera, che può danneggiare il tessuto neuronale.
   NOTA: per tessuto retinico adattata al buio, applicare una copertura su misura per la camera principale per escludere la luce.
3. Utilizzare una pompa peristaltica a circulate la soluzione (aCSF) attraverso le due camere e una piastra termoelettrico Peltier cooler per raffreddarsi o riscaldare la camera principale alle temperature desiderate nell'intervallo 0 - 50 ° C. Per incubazione del tessuto ottimale, utilizzare 15 - 16 ° C per la redditività a lungo termine.

4. Il calcio Dye Caricamento

1. Selezionare coloranti di calcio in base alla preferenza del singolo ricercatore. Qui usiamo Fura-02:00, Fluo-08:00 o Fluo-4 del mattino. Tuttavia, questo metodo può essere applicato ad altri coloranti così: sciogliere coloranti calcio in DMSO ad una soluzione 1 mM e 1% di copolimeri a blocchi (es, acido-127 Pluronic) ad un volume finale di 50 microlitri e ultrasuoni per 10 min.
2. Aggiungere la soluzione al aCSF ad una concentrazione finale di 10 mM, 0,01% copolimeri a blocchi di fettine cerebrali, e 20 pM (retina), 0,02% copolimeri a blocchi per la retina. In retinae (papaina trattato) e sezioni di cervello da animali giovani, carico al bagno per 45 min a 37 ° C (Fura-2 AM) o RT (Fluo-4 del mattino; Fluo-08:00).
   1. Per gli animali adulti, (> 12 settimane) pipettare i coloranti (50 ml) direttamente sui sezioni di cervello, e mantenere per 75 minuti per consentire una migliore penetrazione del colorante negli strati profondi.
   2. Per assicurare un'adeguata ossigenazione della fetta sommersa durante l'incubazione colorante, preparare un vetro camera di carico con coperchio chiuso (barattolo circolare del diametro di 2,5 cm, 3,5 cm di altezza) con coloranti calcio diluito in 2,5 mL di aCSF. Ossigenare continuamente con il 95% O _2/5% di CO _2. Non farlo bolla.
3. Dopo dye carico, lavare il tessuto con aCSF e trasferimento al sistema di incubazione, ridurre lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C fino al momento dell'uso sperimentale.

5. elettrofisiologiche Recordings e Imaging

1. Posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommerso sotto un microscopio, e profumato con ossigenato aCSF ad una portata di 4 - 5 mL / min sia a RT (~ 22 ° C) o temperatura fisiologica (~ 35 ° C). Hold il tessuto in luogo utilizzando un custom made '' arpa '', realizzato in nylon o in oro le discussioni tese e incollate su un pezzo a forma di U di oro o filo di platino.
2. Per elettrofisiologia:
   1. Preparare pipette di registrazione da 1,5 mm (1,19 millimetri ID) in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta per ottenere una resistenza finale di 5-6 MW.
   2. Riempire la pipetta con 3-4 ml di soluzione interna come descritto in precedenza ¹³ e visualizzare le cellule sotto infrarossi interferenza differenziale contrasto (IR-DIC) utilizzando una telecamera CCD. La soluzione intracellulare deve essere attentamente su misura per ogni esperimento per ottenere risultati sperimentali.
   3. Posizione pipetta, mantenendo una pressione positiva applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta, sulla membrana di una cellula con un micromanipolatore. Poiché la ILM è stato rimosso dalla retina, non è richiesta alcuna raschiare membrana prima. Una volta che la pipetta è sulla cella, applicare delicato negativopressione alla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm. Poi rompere la membrana cellulare con una breve quantità di pressione negativa.
   4. Effettuare registrazioni current- o tensione-clamp cellule intere utilizzando tecniche standard a seconda dei casi.
3. Calcio-immagini:
   1. Per l'imaging raziometrico di Fura-2, utilizzare un ultra-alta lunghezza d'onda switcher velocità per offrire lunghezze d'onda di eccitazione di 340 nm e 380 nm. Far passare la luce emessa da singole cellule attraverso un filtro di emissione di 510 ± 20 nm, e catturare con un'elevata sensibilità, fotocamera digitale ad alta velocità.
   2. Per una singola lunghezza d'onda di eccitazione di Fluo-4, la luce filtro di eccitazione attraverso un 460 - filtro passa banda nm 490 e la luce emessa attraverso un 515 - filtro passa banda nm 550. Per la registrazione più veloce e sensibile utilizzare una fotocamera digitale ad alta velocità tale. Acquisire immagini come richiesto.
   3. Misurare alterazioni di fluorescenza in funzione del tempo sia ad una sola lunghezza d'onda (Fluo-4) o utilizzando il rapporto di lunghezza d'ondaMetodo (Fura-2), come precedentemente descritto ^{8, 14.}

Representative Results

stretta regolazione della carica batterica e la temperatura del aCSF durante l'incubazione è essenziale per mantenere la vitalità del tessuto neuronale. Questo può essere ottimizzato mediante irraggiamento con luce UVC e mantenendo la temperatura della aCSF a 15 - 16 ° C (Figura 1). Inoltre, il aCSF parametri di bollo (APS; Figura 1C) fornisce lo sperimentatore con un record delle condizioni ambientali (pH e temperatura.), Offrendo così un gold standard per i parametri quando l'incubazione del tessuto neuronale, che, se seguito, sarà ridurre la variabilità tra esperimenti.

Figura 1. Un sistema di incubazione che consente regolamento stretta dell'Ambiente Tissue. A, Schema del sistema di incubazione composto da una piastra di raffreddamento Peltier, camera principale, pompa peristaltica e la camera UVC. B,Vista laterale della camera principale che mostra i punti di ingresso e di uscita del aCSF, nonché le sonde ingresso CarboGen, temperatura e pH. Tissue è posto sulla mesh come indicato. Tutte le sonde di misura sono fissati al coperchio per consentire stabilità strutturale. C, ACSF Parametri Stamp descrive la temperatura e pH del aCSF durante l'incubazione. D, Vista dall'alto della camera principale che mostra i fori di montaggio per le sonde di misura. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tissue vitalità può essere misurata mediante l'attività di rete (figura 2), così come i vari metodi di imaging, comprese le risposte di calcio (Figura 2B, C). Per monitorare l'attività di rete, abbiamo applicato aCSF contenente un'alta concentrazione di cloruro di potassio (KCl; 30 mM) localmente,che ha portato alla depolarizzazione dei neuroni e glia all'interno vicinanze del applicata K ^+. Questa depolarizzazione può essere osservato l'aumento transienti di calcio (Figura 2B, C) e l'attività spiking (Figura 2D), che serve anche come indicatore fisiologico per la vitalità cellulare. I nostri risultati mostrano che spiking attività fette che sono state incubate per> 24 h nel sistema di incubazione era simile a "fresco" fette incubate per periodi più brevi (> 4 h; Figura 2D). Inoltre, i singoli neuroni redditività, che è stato monitorato mediante registrazioni elettrofisiologiche intracellulari di entrambe le proprietà della membrana passivi e attivi, compreso il potenziale di membrana, resistenza di ingresso, costante di tempo, e il potenziale azione era paragonabile a parametri riportati in letteratura ¹⁵ (Figura 2E, F ).

Figura 2. elettrofisiologici e calcio proprietà di Brain fette dopo incubazione prolungata. Una, Immagine di una fetta del cervello preso 28 ore dopo il taglio con due elettrodi di registrazione extracellulari utilizzati per misurare l'attività di rete. Un terzo elettrodo (contrassegnati con asterisco) è utilizzato per gonfiare 30 mM di KCl. B, Tempo immagini lasso di fette caricato con Fluo-04:00 per> 24 h, raffiguranti un aumento di transienti di calcio intracellulare in seguito all'applicazione bagno di KCl. C, transienti intracellulari di calcio seguente breve applicazione di KCl (30 mm, 1 s). Red - segnale medio, grigio - tracce di calcio in singole cellule come indicato in B. D, extracellulare registrazione fisiologica dell'attività di rete prima e dopo l'applicazione di KCl (frecce rosse) erano sostanzialmente invariata tra fette "fresco" (<4 h postdissection) E quelle che sono state incubate per> 24 ore in incubatore. Nota l'aumento spiking subito dell'attività dopo l'applicazione KCl indicando neuroni vitali che rispondono ad aumentare [K ^+] con depolarizzazione. E & F, Passive (E), ed attivi proprietà (F) membrana di piramidale neurone seguenti 2 h (tracce blu) o 26 h (tracce nere) di incubazione nel sistema di incubazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per fornire l'accesso diretto alle cellule dello strato di cellule gangliari della retina wholemount di topi rd / rd retinally degenerati, la ILM stato digerito dal papaina enzima ^{7, 8.} Dopo la digestione, RGCs e cellule amacrine sfollati possono essere chiaramente visualizzati under illuminazione DIC (figura 3A), e le cellule possono essere mirati per le registrazioni di patch-clamp senza raschiare prima della ILM. Rappresentativi registrazioni current-clamp da una RGC sono mostrati nella Figura 3B. Depolarizzazione della cellula tramite la pipetta di patch causato dose-dipendente potenziale d'azione generazione, indicando la vitalità delle cellule dopo il trattamento papaina.

La rimozione del ILM permesso anche colorazione onnipresente dello strato di cellule gangliari (GCL) con Fura-02:00 (Figura 3D) e cellule risposto alla domanda 30 mM KCl con un grande aumento del rapporto 340/380 nm rispetto a F _0, significa un grande aumento della concentrazione di calcio intracellulare (Figura 3E). I livelli di calcio tornata ai livelli iniziali a seguito di stimolazione e le cellule potrebbero essere successivamente stimolati a produrre una risposta di ampiezza simile. Inoltre, queste risposte erano indistinguibili tra retinae registrato a <4 ore e> 24 h postdissection (Figura 3F, G).

Figura 3: registrazioni elettrofisiologiche e calcio in retina Wholemount. Un'immagine contrasto interferenziale, differenziale di una registrazione patch-clamp da un cellule gangliari della retina in GCL dopo papaina digestione. B, cellule conservano dose-dipendente risposte Schiacciata quando depolarizzato, rispettivamente con 50, 100 e 150 Pa. C & D, la rimozione della membrana limitante interna prima dell'applicazione bagno di Fura-02:00 permette il carico onnipresente di cellule gangliari della retina, immagine presa con 380 nm di eccitazione. E, quando viene applicato il 30 mM KCl ASCF, l'85% delle cellule colorate ha risposto con un aumento del rapporto di 340/380. F & G, L'aumento del rapporto 340/380 ritorna al basale dopo 30 applicazioni mM KCl (barre rosse), E le cellule rispondono alla conseguente stimolazione sia <4 h e> 24 ore seguenti la dissezione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo articolo descrive un metodo di incubazione per estendere la vitalità del tessuto neuronale acuta per immagini ed elettrofisiologici esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per completare obiettivi sperimentali. Due processi principali governano il deterioramento del tessuto neuronale nel tempo: i) un aumento dei livelli di batteri, e il conseguente aumento endotossina batterica rilasciato, e ii) eccitotossicità che segue la procedura affettamento traumatica ^10. Come tessuto neuronale acuta è senza difesa dell'ambiente, stretta regolamentazione dell'ambiente tessuto attraverso un attento monitoraggio dei livelli di pH, temperatura e batteri è essenziale per mantenere l'attività cellulare, così come l'integrità della rete. Dissezione, e il trattamento del tessuto (papaina digestione, calcio dye loading) possono assumere 2 h per completare, causando una riduzione del tempo sperimentale. Tuttavia, poiché il tessuto può essere mantenuto nel sistema di incubazione per> 24 ore senza una perdita misurabile in vitalità ^{7, 8,} questa preparazione deve soltanto essere completata una volta per ottenere> 24 h di risultati. Come parte della strategia delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement) volto a fornire principi guida per l'uso etico degli animali ^16, questo metodo avrà un grande impatto sulla riduzione del numero di animali utilizzati in questi tipi di esperimenti.

Digestione della ILM di tessuto retinico wholemount permette un facile il targeting di cellule nel GCL per le registrazioni di patch-clamp e di calcio carico colorante onnipresente dall'applicazione bagno. Queste tecniche sono particolarmente utili per retina degenerata in cui la ILM è molto più spessa e più difficile da violare raschiando con una pipetta di vetro. Inoltre, la preparazione papaina fornisce un modo per eseguire registrazioni accoppiato a celle utilizzando due elettrodi per registrare dalle cellule accoppiate gap-giunzione in GCL, qualcosa che non è stato possibile in precedenza. però, La papaina digestione probabilmente ha alcuni effetti sulla normale fisiologia della retina come espressione del recettore K ⁺ ha dimostrato di essere modificato in seguito fotorecettori dissociazione con papaina ^6. È anche possibile che l'architettura retinica è interessato. Velte e Masland hanno dimostrato che alcuni somas e dendriti RGC sono stati danneggiati dal trattamento papaina per rimuovere il ILM, potrebbero registrare correttamente dal RGC dendriti distale al soma nella maggior parte dei neuroni, indicando l'integrità strutturale delle cellule e processi ^5. È importante sottolineare che, lasciando la retina attaccata alla pigmentato retinico (RPE) e sclera, come sopra descritto, isola la retina esterna da papaina diffusione e può ridurre gli effetti negativi per segmenti esterni dei fotorecettori quando questo protocollo è applicato a WT retine. In entrambi i casi, il trattamento papaina, o raschiatura della ILM, qualche danno cellulare si verifica, lo sperimentatore deve scegliere il metodo appropriato per la sperimdomanda ental.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232