Langvarig Inkubasjon av akutt nervevev for Elektro og kalsium-imaging

Summary

Når den er fjernet fra kroppen, er nervevev sterkt påvirket av miljømessige forhold, som fører til eventuell nedbrytning av vev etter 6 - 8 timer. Ved å bruke en unik fremgangsmåte inkubasjon, som nøye overvåker og regulerer den ekstracellulære miljø av vev, kan vev levedyktighet bli betydelig forlenget i> 24 timer.

Abstract

Akutt forberedelser nevrale vev, hjerne skiver og retinal wholemount, kan vanligvis bare opprettholdes for 6-8 timer etter disseksjon. Dette begrenser den eksperimentelle tiden, og øker antallet dyr som benyttes per undersøkelse. Denne begrensningen spesielt påvirker protokoller som kalsium bildebehandling som krever langvarig pre-inkubasjon med bade-anvendt fargestoffer. Eksponensiell bakterievekst i løpet av 3 - 4 timer etter kutting er tett korrelert med en reduksjon i vev helse. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for å begrense spredning av bakterier i akutte preparater for å opprettholde levedyktig neuronalvev for lengre perioder (> 24 timer) uten behov for antibiotika, sterile prosedyrer, eller vevskultur-medium inneholdende vekstfaktorer. Ved å sykle den ekstracellulære væske gjennom UV-bestråling og å holde vevet i en tilpasset holdekammer ved 15 - 16 ° C, viser det vev ingen forskjell i elektrofysiologiske egenskaper, eller kalsium signaling gjennom intracellulære kalsiumfargestoffer ved> 24 h postdissection. Disse metodene vil ikke bare forlenge forsøkstiden for de som bruker akutt nervevev, men vil redusere antall dyr er nødvendig for å fullføre eksperimentelle mål, og vil sette en gullstandard for akutt nervevev inkubasjon.

Introduction

Elektrofysiologi og funksjonell imaging (kalsium, spenningsfølsomme fargestoffer) er to av de mest brukte eksperimentelle teknikker i nevrovitenskap. Hjernen slice forberedelser og retinal wholemount, som vil bli undersøkt her, være et middel for å undersøke elektrofysiologiske egenskaper og synaptiske tilkobling uten forurensning fra bedøvelse eller muskelavslappende. Hjerneskiver og retinal wholemount opprettholde sin strukturelle integritet, i motsetning til kulturer eller cellehomogenater, slik at studiet av bestemte kretser og hjernenettverk ^1. Opptak fra isolerte vev har fordeler fremfor in vivo innspillinger som bevegelser i forbindelse med hjerteslag og åndedrett er eliminert. Videre tillater direkte visualisering bestemte klasser av celler til å være målrettet, og lokal bruk av farmakologiske verktøy ^{2, 3.}

Patch-clamp opptak og calcium dye-lasting i retinal wholemount kompliseres av eksistensen av Indre Begrense Membrane (ILM), som dekker gangliecelle (RGC) lag og hindrer direkte tilgang til cellene. Vanligvis er denne membran skrapes bort med en glass pipette for å tillate direkte anvendelse av en lapp pipette og dannelse av en tetning gigaohm på en enkelt celle. I tillegg trenger bade-anvendt kalsium fargestoffer ikke krysse ILM og må enten injiseres under denne membranen ^4, retrograd transporteres etter injeksjon på synsnerven ⁵ eller electroporated gjennom vevet ^6. Videre, når utnytte en gnager-modell med retinitis pigmentosa, rd / rd mus, er det ILM tykkere og mer ugjennomtrengelig. Her bruker vi en teknikk for å fjerne ILM med enzymatisk fordøyelse ^7, slik at begge allestedsnærværende kalsium dye-lasting, og direkte tilgang til gangliecelle for patch-clamp recordiNGS ^8.

Vellykket opptak fra enten hjerneskiver eller retinal wholemount avhenge disseksjon og inkubasjon av levedyktig nervevev. Vanligvis er vevet ekstrahert om morgenen eksperimentet og inkubert i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) inntil den brukes til opptak. Vanligvis forblir vev levedyktig for 6 - 8 timer, med betydelig degradering etter dette tidsvinduet. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae preparater vanligvis produsere mer vev enn det som kan tas opp fra løpet av denne korte tidsperioden. Følgelig blir vev ofte kastet på slutten av dagen, og den disseksjon fullføres igjen på påfølgende dager. Dette betyr et annet dyr blir utnyttet og -2 timer om oppsett og disseksjon / farging gjentas. Følgende protokoll beskriver en metode for å forlenge levetiden til nervevev i mer enn 24 timer, noe som betyr at færre dyr blir benyttet, og mer eksperimentelle tid er tilgjengelig. Tissue levedyktighet wsom vurderes gjennom opptak elektrofysiologiske egenskaper og kalsium dynamikk, og disse egenskapene ble utvisket mellom <4 t og> 24 h postdissection.

Disse resultatene tyder på at det ikke bare er enkelt celle egenskaper intakt og funksjonell etter langvarig inkubasjon, men nettverksaktivitet, som vurderes av kalsium-bildebehandling og elektrofysiologiske opptak, er uendret> 24 h postdissection. Videre viser vi at kalsiumfargestoffer som kan forbli i cellene i lengre perioder uten å forårsake noen skadelige virkninger. Bruk av denne protokollen viser at den funksjonelle aktiviteten til nerveceller i akutt nervevev kan opprettholdes i lange perioder, når det ytre miljø er sterkt regulert. Videre, ettersom vev levedyktighet varierer mellom laboratorier på grunn av ulike ruge protokoller, etablerer denne metoden en gullstandard for ideelle parametere som skal brukes til å redusere variabiliteten i helse av akutt neuRonal vev.

Protocol

Protokollen nedenfor beskriver fremstillingen av C57BL / 6 og C3H / He (retinally degenerert) mus nervevev, men lignende teknikker kan brukes på andre arter. Alle dyrene var friske og håndteres med standardbetingelser av temperatur, fuktighet, 12 timer lys / mørke syklus, fri tilgang til mat og vann, og uten noen hensikt stresset stimuli. Alle forsøkene ble godkjent og utført i samsvar med Western Sydney University Animal Care og etikk komité og i henhold til dyret bruk og retningslinjer omsorg (forsøksdyr # A9452, # A10396 og # A8967).

1. Brain Slice Forberedelse

1. Bedøve dyret ved inhalering av isofluran (5%) og fremrykning ved hjelp av en gnager giljotinen. Fjern hjernen raskt, slik det er beskrevet tidligere ⁹ og plassere den i iskald fysiologisk oppløsning (aCSF) inneholdende (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 2 _CaCl2, 25_NaHCO3, 25 dekstrose, og mettet med karbogen (95% _O2 / 5% CO _2-blanding; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Skjær hjerneskiver, i regionen av interesse, 300 mikrometer tykk med en vibrerende mikrotom.
3. Overfør skiver til en tilpasset bygget inkubasjon system som overvåker nøye og kontrollerer pH-verdier (pH 7.2 til 7.4), carbogen flyt og temperatur som tidligere beskrevet ^{10, 11.}
4. Still første kammertemperatur til 35 ° C 15 - 30 minutter, og deretter sakte redusert til 15 - 16 ° C, som vist i figur 1C. Deretter inkuberes skiver i inkubasjon systemet inntil nødvendig, enten for elektro eller bildebehandling.
   MERK: Hvis skiver som skal brukes for kalsium-bildebehandling, følg trinnene nedenfor før du avkjøler vevet under RT.

2. Netthinne Wholemount Forberedelse og Indre Begrense Membran Removal

1. Forbered retinal wholemounts under enten normallaboratorie lysforhold eller svakt rødt / infrarødt lys.
2. Avlive dyr ved halshugging og umiddelbart enucleate øyne. Lag et lite snitt langs ora serrata, og plasser i enten Ames media, eller aCSF inneholder (mm): 125 NaCl, 25 _NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 _MgCl2, 10 glukose, 0,5 L-glutamin, og mette med karbogen (95% _O2 / 5% CO _2-blanding; ~ 300 mOsm; pH 7,4), ved romtemperatur.
3. Fjern umiddelbart hornhinnen, linsen og glasslegemet ved å kutte langs ora serrata med liten saks og fjerne linsen og glasslegemet med pinsett. Plasser vev i inkubasjonen systemet ved RT.
   MERK: retinal vev kan opprettholdes i øyet-cup, etter langsom temperaturreduksjon til 15 - 16 ° C, i> 24 timer i inkubasjon systemet inntil nødvendig.
4. For å fjerne ILM, overføre eye-cup som inneholder netthinnen til en liten glasskrukke som inneholder 30 U / ml papain, 1 mM L-cystein, 0,5 mM EDTA og 0,005% DNase i Earl's-Balanced Salt Solution (BSS) ved 37 ° C i 20 min. Anvende 95% O _2/5% CO ₂ til oppløsningen gjennom lokket, men gjør ikke boble. Hvis du bruker vev fra unge dyr (<6 uker), fortynne løsningen på halv styrke.
   1. Stoppe enzymatisk fordøyelse, ved å sette vevet i en ovomucoid (10 mg / ml) og BSA (10 mg / ml) løsning i 10 minutter i Earls BSS. Vask vev grundig med aCSF før overføring til inkubering systemet og redusere temperaturen til 15 - 16 ° C.
5. Oppretthold retinal vev i øyet-cup inntil nødvendig. For overføring til mikroskopet, isolere netthinnen fra øyet-cup og kutt i 4 stykker med et barberblad. Hvis hele netthinnen er nødvendig, gjør fire små kutt i periferien av netthinnen for å tillate den å ligge flatt.
   MERK: For bildebehandling eksperimenter, last med kalsium-fargestoffer før overføring til inkubasjon systemet, se nedenfor.

3. Opprettholde Tissue i Inkubator

(figur 1A, B).
1. Sirkulere aCSF gjennom et andre kammer (UVC kammer, bygget som tidligere beskrevet ¹²⁾ isolert fra hovedkammeret og utsatt for 1,1 W UVC lampe (254 nm, 5W / 2P-sterilisator UV-lampe) for å eradiate bakterier som flyter i oppløsning (figur 1A). Kontroll UVC lys timing via en programmerbar timer ved hjelp av en tilfeldig funksjon som slår på til tider varierende mellom 15 og 26 min hver 15-30 minutter for å unngå overdreven oppvarming av aCSF.
2. Angi strømningshastigheten i UVC kammeret til 12 ml / min, som tidligere rapportert ^12. Dekk UVC kammer med aluminiumsfolie for å hindre at UVC belysning på utsiden av kammeret, noe som kan skade nervevev.
   MERK: For dark-tilpasset retinal vev, bruke en skreddersydd dekselet til hovedkammeret for å utelukke lys.
3. Bruk en peristaltisk pumpe til Circulate oppløsningen (aCSF) gjennom de to kammere, og en termoelektrisk Peltier kald plate kjøler til enten å kjøle eller varme i hovedkammeret til de ønskede temperaturer i området 0 - 50 ° C. For optimal vev inkubasjon, bruker 15 - 16 ° C for langsiktig levedyktighet.

4. Kalsium Dye Loading

1. Velg kalsium fargestoffer basert på preferanse for den enkelte forsker. Her bruker vi Fura-2AM, Fluo-8am eller Fluo-4 AM. Imidlertid kan denne metoden anvendes for andre fargestoffer i tillegg: oppløse kalsiumfargestoffer i DMSO til en 1 mM oppløsning og 1% blokk-kopolymerer (for eksempel Pluronic syre-127) til et endelig volum på 50 ul og sonikere i 10 min.
2. Legg løsning til aCSF til en sluttkonsentrasjon på 10 uM, 0,01% blokk-kopolymerer for hjernesnitt, og 20 uM (netthinnen), 0,02% blokk-kopolymerer for netthinnen. I retinae (papain behandlet) og hjernesnitt fra unge dyr, belastning til badet i 45 minutter ved 37 ° C (Fura-2 AM) eller RT (Fluo-4 AM; Fluo-8 AM).
   1. For voksne dyr, (> 12 uker) pipettere fargestoffer (50 ul) direkte på hjernesnitt, og vedlikeholde i 75 minutter for å tillate bedre gjennomtrengning av farvestoffet inn i de dype lag.
   2. For å sikre tilstrekkelig oksygenering av undervanns skive under fargestoff inkubasjon forberede et glass lasterommet med lukket lokk (sirkulær glass diameter 2,5 cm, 3,5 cm høyde) med kalsium fargestoffer fortynnet i 2,5 ml aCSF. Oksygenere kontinuerlig med 95% _O2 / 5% _CO2. Ikke boble.
3. Etter lasting fargestoff, vaskes vevet med aCSF og overføring til inkubasjon system, langsomt redusere temperaturen til 15 - 16 ° C inntil eksperimentell bruk.

5. Elektro Recordings og bildebehandling

1. Plasser vev i et neddykket registreringskammer under et mikroskop, og perfuse med oksygenert aCSF ved en strømningshastighet av 4 - 5 ml / min, enten ved romtemperatur (~ 22 ° C) eller fysiologisk temperatur (~ 35 ° C). Hold vevet på plass ved hjelp av en spesiallaget '' harpe '', laget av nylon eller gull tråder strukket og limt på tvers av et U-formet stykke av gull eller platinatråd.
2. For elektrofysiologi:
   1. Fremstille opptaks pipetter fra 1,5 mm (1,19 mm ID) borsilikatglass ved anvendelse av en mikropipette avtrekker for å oppnå en endelig motstand på 5-6 Megohm.
   2. Fylle pipetten med med 3 - 4 mL av interne oppløsning som tidligere beskrevet ¹³ og visualisere celler under infrarød Differential Interference Contrast (IR-DIC) ved hjelp av et CCD-kamera. Den intracellulære løsningen bør være nøye skreddersydd for hvert forsøk for å oppnå eksperimentelle resultater.
   3. Stilling pipette, og samtidig opprettholde positivt trykk tilført gjennom en sugeport på pipetten holderen, på membranen av en celle ved hjelp av en mikromanipulator. Siden ILM har blitt fjernet fra netthinnen, er ingen tidligere membran skraping er nødvendig. Når pipetten er på cellen, anvende milde negativtrykk til pipetten for å oppnå en gigaohm tetning. Deretter briste cellemembranen med en kort mengde av undertrykk.
   4. Gjør hel-celle Strøm- eller spennings-klemme opptak med standard teknikker som passer.
3. Kalsium-bildebehandling:
   1. For ratiometrisk avbildning av Fura-2, må du bruke en bølgelengde switcher ultrahøy hastighet for å gi eksitasjonsbølgelengdene av 340 nm og 380 nm. Pass slippes lys fra enkeltceller gjennom en emisjon filter på 510 ± 20 nm, og ta bilder med høy følsomhet, høy hastighet digitalkamera.
   2. For en enkelt eksitasjon bølgelengde på Fluo-4, filter eksitasjon lys gjennom en 460-490 nm band pass filter og slippes lys gjennom en 515-550 nm band pass filter. For den raskeste og mest sensitive opptak bruke en høyhastighets digitalt kamera slik. Hente bilder etter behov.
   3. Måle endringer i fluorescens som en funksjon av tid, enten ved en enkelt bølgelengde (Fluo-4) eller ved hjelp av forholdet mellom bølgelengdeFremgangsmåte (Fura-2), som tidligere beskrevet ^{8, 14.}

Representative Results

Tett regulering av bakteriemengden og temperaturen til aCSF under inkubering er viktig å opprettholde neuronal levedyktighet vev. Dette kan optimaliseres ved bestråling med lys UVC og opprettholdelse av temperaturen i aCSF ved 15 - 16 ° C (figur 1). Videre parametere den aCSF stempel (APS, figur 1C) gir eksperimentator med en registrering av miljøforhold (pH og temp.), Og dermed tilby en gullstandard for parametre når inkubasjon nervevev, som, hvis de følges, vil redusere variabilitet mellom eksperimenter.

Figur 1. Et Inkubasjon system som gjør at Tight Regulering av Tissue Miljø. A, Skjematisk fremstilling av inkubering system bestående av en kjøle Peltier plate, hovedkammeret, peristaltisk pumpe og UVC kammeret. B,Sideriss av hovedkammeret som viser innløps- og utløpspunktene til aCSF, samt karbogen innløps, temperatur og pH-sonder. Tissue er plassert på trådduken som angitt. Alle måle prober er festet til lokket for å tillate strukturell stabilitet. C, ACSF Parametere stempel som beskriver den temperatur og pH-verdien i aCSF under inkubering. D, sett ovenfra av hovedkammeret og viser monteringshullene for målesonder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tissue levedyktighet kan måles ved hjelp av nett-aktivitet (figur 2), så vel som forskjellige avbildningsmetoder, herunder kalsium responser (Figur 2B, C). Å overvåke nettverk aktivitet, søkte vi aCSF inneholdende en høy konsentrasjon av kaliumklorid (KCl, 30 mM) lokalt,noe som førte til depolarisering av nevroner og gliaceller i nærheten av anvendt K ^+. Dette depolarisasjon kan observeres ved økningen i kalsium transienter (figur 2B, C) og spiking aktivitet (figur 2D), som også tjener som en fysiologisk indikator for cellenes levedyktighet. Våre resultater viser at spiking aktivitet i stykker som ble inkubert i> 24 timer i inkubasjonsblandingen systemet var lik den "friske" stykker inkubert i kortere perioder (> 4 h; figur 2D). Videre individuell neuron levedyktighet, som ble overvåket gjennom intracellulære elektrofysiologiske opptak av både passive og aktive membranegenskaper, deriblant hvilemembranpotensialet, inngangsmotstand, tidskonstant, og virkningspotensial var sammenlignbare parametere som er rapportert i litteraturen ¹⁵ (figur 2E, F ).

Figur 2. Elektro og Kalsium Egenskaper av hjerneskiver etter langvarig inkubasjon. A, bilde av en hjerne skive tatt 28 timer etter kutting med to ekstracellulære opptak elektroder som benyttes for måling av nettverksaktivitet. En tredje elektrode (merket med stjerne) brukes til å blåse 30 mM KCl. B, tidsforløp bilder av skiver lastet med Fluo-4 AM i> 24 timer, viser en økning i intracellulære kalsium transienter følgende bath bruk av KCl. C, intracellulært kalsium transienter følgende kort anvendelse av KCl (30 mM; 1 s). Red - gjennomsnittlig signal, Grey - kalsium spor i enkeltceller som vist i B. D, Ekstracellulær fysiologisk opptak av nettverket aktivitet før og etter påføringen av KCl (røde piler) var stort sett uendret mellom "friske" skiver (<4 h postdissection) Og de som ble inkubert i> 24 timer i inkubatoren. Legg merke til at økningen i spiking aktivitet umiddelbart etter påføring KCl indikerer levedyktige nevroner som reagerer på økning i [K ^+] med depolarisering. E & F, Passiv (E), og aktive (F) membranegenskapene til pyramide neuron følgende 2 h (blå spor) eller 26 timer (svarte spor) inkubering i inkubasjonen systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å tilveiebringe direkte adgang til cellene i cellelaget ganglion av wholemount hinnen av retinally degenererte rd / rd mus, ble ILM spaltet av enzymet papain ^{7, 8.} Etter fordøyelsen, kan RGCs og ford amacrine celler være tydelig visualisert under DIC belysning (figur 3A), og cellene kan være målrettet for patch-clamp opptak uten forutgående skraping av ILM. Representative strøm-klemme opptak fra en RGC er vist i figur 3B. Depolarisering av cellen via lappen pipette forårsaket doseavhengig aksjonspotensialet generasjon, noe som indikerer levedyktighet av cellene følgende papain behandling.

Fjerning av ILM også tillatt allestedsnærværende farging av ganglion celle lag (GCL) med Fura-2AM (figur 3D) og cellene responderte på 30 mM KCl søknad med en stor økning i 340/380 nm forhold i forhold til F _0, som betegner en stor økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon (figur 3E). Kalsiumnivået tilbake til utgangspunktet etter stimulering og cellene kan deretter bli stimulert for å produsere en lignende amplituderespons. Videre disse svarene ble utvisket mellom retinae registrert på <4 t og> 24 h postdissection (figur 3F, G).

Figur 3: Elektro og kalsium Recordings i Retinal Wholemount. A, Differential interferens kontrast bilde av en patch-clamp opptak fra en gangliecelle i GCL etter papain fordøyelsen. B, Celler beholde doseavhengig spiking reaksjoner når depolarisert med 50, 100 og 150 pA henholdsvis. C & D, Fjerning av indre begrensende membran før badet påføring av Fura-2AM tillater allestedsnærværende lasting av gangliecelle, bilde tatt med 380 nm eksitasjon. E, når 30 mM KCI ASCF kommer til anvendelse, 85% av fargede celler reagerte med en økning i 340/380-forhold. F & G, Økningen i 340/380 ratio tilbake til baseline etter 30 mM KCl søknad (røde søyler), Og cellene svare på påfølgende stimulering begge <4 h og> 24 timer etter disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne artikkelen beskriver en inkubasjon metode for å forlenge levedyktigheten av akutt neuronalvev for bildebehandling og elektrofysiologiske eksperimenter, og dermed redusere dyret tallene som trengs for å fullføre eksperimentelle mål. To hovedprosesser styrer forverring av nervevev over tid: i) økt bakterienivå, og den tilhørende økning i bakterie endotoksin løslatt, og ii) excitotoxicity som følger den traumatiske slicing prosedyren ^10. Som akutt nervevevet er miljømessig forsvarsløs, er avgjørende for å opprettholde cellular aktivitet samt nettverk integritet stram regulering av vevet miljøet gjennom tett oppfølging av pH, temperatur og bakterier nivåer. Disseksjon, og vev behandling (papain fordøyelse, kalsium fargestoff lasting) kan ta over 2 timer for å fullføre, forårsaker en reduksjon i eksperimentell tid. Men siden vev kan holdes i inkubasjonen system for> 24 t uten et målbart tap in levedyktighet ^{7, 8,} må denne fremstilling bare å være ferdig en gang for å oppnå> 24 h resultater. Som en del av 3R-strategi (Replacement, Reduction, Refinement) sikte på å gi føringer for etisk bruk av dyr ^16, denne metoden vil ha en stor innvirkning på å redusere antall dyr som brukes i slike eksperimenter.

Fordøyelse av ILM av retinal wholemount vev gir enkel målretting av celler i GCL for patch-clamp opptak og allestedsnærværende kalsium fargestoff lasting av bad søknad. Disse teknikkene er spesielt anvendbare for degenerert retinae hvori ILM er mye tykkere og vanskeligere å bryte ved å skrape med en glasspipette. Videre gir papain forberedelse en måte å utføre parvise celleopptak ved hjelp av to elektroder for å ta opp fra gap-krysset sammen celler i GCL, noe som tidligere ikke har vært mulig. derimotHar papain fordøyelse sannsynlig noen effekter på normal retinal fysiologi som K ⁺ reseptor-ekspresjon er vist å endres i fotoreseptorer etter dissosiasjon med papain ^6. Det er også mulig at retinal arkitekturen er berørt. Velte og Masland viste at selv om noen RGC Somas og dendritter ble skadet av papain behandling for å fjerne den ILM, kan de med hell opp fra RGC dendritter distalt til soma i de fleste nevroner, noe som indikerer den strukturelle integriteten av cellene og prosesser ^5. Viktigere, forlater retina festet til det retinale pigmentepitel (RPE) og sklera, som beskrevet ovenfor, isolerer den ytre retina fra papain diffusjon og kan redusere eventuelle uheldige virkninger på fotoreseptoren ytre segmenter når denne protokollen blir brukt for å WT retinae. I begge tilfeller, papain behandling, eller skraping av ILM, noen celleskader vil oppstå, må eksperimentator velge den metoden som passer til experimental spørsmålet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232