Summary

Langvarig Inkubasjon av akutt nervevev for Elektro og kalsium-imaging

Published: February 15, 2017
doi:

Summary

Når den er fjernet fra kroppen, er nervevev sterkt påvirket av miljømessige forhold, som fører til eventuell nedbrytning av vev etter 6 – 8 timer. Ved å bruke en unik fremgangsmåte inkubasjon, som nøye overvåker og regulerer den ekstracellulære miljø av vev, kan vev levedyktighet bli betydelig forlenget i> 24 timer.

Abstract

Akutt forberedelser nevrale vev, hjerne skiver og retinal wholemount, kan vanligvis bare opprettholdes for 6-8 timer etter disseksjon. Dette begrenser den eksperimentelle tiden, og øker antallet dyr som benyttes per undersøkelse. Denne begrensningen spesielt påvirker protokoller som kalsium bildebehandling som krever langvarig pre-inkubasjon med bade-anvendt fargestoffer. Eksponensiell bakterievekst i løpet av 3 – 4 timer etter kutting er tett korrelert med en reduksjon i vev helse. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for å begrense spredning av bakterier i akutte preparater for å opprettholde levedyktig neuronalvev for lengre perioder (> 24 timer) uten behov for antibiotika, sterile prosedyrer, eller vevskultur-medium inneholdende vekstfaktorer. Ved å sykle den ekstracellulære væske gjennom UV-bestråling og å holde vevet i en tilpasset holdekammer ved 15 – 16 ° C, viser det vev ingen forskjell i elektrofysiologiske egenskaper, eller kalsium signaling gjennom intracellulære kalsiumfargestoffer ved> 24 h postdissection. Disse metodene vil ikke bare forlenge forsøkstiden for de som bruker akutt nervevev, men vil redusere antall dyr er nødvendig for å fullføre eksperimentelle mål, og vil sette en gullstandard for akutt nervevev inkubasjon.

Introduction

Elektrofysiologi og funksjonell imaging (kalsium, spenningsfølsomme fargestoffer) er to av de mest brukte eksperimentelle teknikker i nevrovitenskap. Hjernen slice forberedelser og retinal wholemount, som vil bli undersøkt her, være et middel for å undersøke elektrofysiologiske egenskaper og synaptiske tilkobling uten forurensning fra bedøvelse eller muskelavslappende. Hjerneskiver og retinal wholemount opprettholde sin strukturelle integritet, i motsetning til kulturer eller cellehomogenater, slik at studiet av bestemte kretser og hjernenettverk 1. Opptak fra isolerte vev har fordeler fremfor in vivo innspillinger som bevegelser i forbindelse med hjerteslag og åndedrett er eliminert. Videre tillater direkte visualisering bestemte klasser av celler til å være målrettet, og lokal bruk av farmakologiske verktøy 2, 3.

Patch-clamp opptak og calcium dye-lasting i retinal wholemount kompliseres av eksistensen av Indre Begrense Membrane (ILM), som dekker gangliecelle (RGC) lag og hindrer direkte tilgang til cellene. Vanligvis er denne membran skrapes bort med en glass pipette for å tillate direkte anvendelse av en lapp pipette og dannelse av en tetning gigaohm på en enkelt celle. I tillegg trenger bade-anvendt kalsium fargestoffer ikke krysse ILM og må enten injiseres under denne membranen 4, retrograd transporteres etter injeksjon på synsnerven 5 eller electroporated gjennom vevet 6. Videre, når utnytte en gnager-modell med retinitis pigmentosa, rd / rd mus, er det ILM tykkere og mer ugjennomtrengelig. Her bruker vi en teknikk for å fjerne ILM med enzymatisk fordøyelse 7, slik at begge allestedsnærværende kalsium dye-lasting, og direkte tilgang til gangliecelle for patch-clamp recordiNGS 8.

Vellykket opptak fra enten hjerneskiver eller retinal wholemount avhenge disseksjon og inkubasjon av levedyktig nervevev. Vanligvis er vevet ekstrahert om morgenen eksperimentet og inkubert i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) inntil den brukes til opptak. Vanligvis forblir vev levedyktig for 6 – 8 timer, med betydelig degradering etter dette tidsvinduet. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae preparater vanligvis produsere mer vev enn det som kan tas opp fra løpet av denne korte tidsperioden. Følgelig blir vev ofte kastet på slutten av dagen, og den disseksjon fullføres igjen på påfølgende dager. Dette betyr et annet dyr blir utnyttet og -2 timer om oppsett og disseksjon / farging gjentas. Følgende protokoll beskriver en metode for å forlenge levetiden til nervevev i mer enn 24 timer, noe som betyr at færre dyr blir benyttet, og mer eksperimentelle tid er tilgjengelig. Tissue levedyktighet wsom vurderes gjennom opptak elektrofysiologiske egenskaper og kalsium dynamikk, og disse egenskapene ble utvisket mellom <4 t og> 24 h postdissection.

Disse resultatene tyder på at det ikke bare er enkelt celle egenskaper intakt og funksjonell etter langvarig inkubasjon, men nettverksaktivitet, som vurderes av kalsium-bildebehandling og elektrofysiologiske opptak, er uendret> 24 h postdissection. Videre viser vi at kalsiumfargestoffer som kan forbli i cellene i lengre perioder uten å forårsake noen skadelige virkninger. Bruk av denne protokollen viser at den funksjonelle aktiviteten til nerveceller i akutt nervevev kan opprettholdes i lange perioder, når det ytre miljø er sterkt regulert. Videre, ettersom vev levedyktighet varierer mellom laboratorier på grunn av ulike ruge protokoller, etablerer denne metoden en gullstandard for ideelle parametere som skal brukes til å redusere variabiliteten i helse av akutt neuRonal vev.

Protocol

Protokollen nedenfor beskriver fremstillingen av C57BL / 6 og C3H / He (retinally degenerert) mus nervevev, men lignende teknikker kan brukes på andre arter. Alle dyrene var friske og håndteres med standardbetingelser av temperatur, fuktighet, 12 timer lys / mørke syklus, fri tilgang til mat og vann, og uten noen hensikt stresset stimuli. Alle forsøkene ble godkjent og utført i samsvar med Western Sydney University Animal Care og etikk komité og i henhold til dyret bruk og retningslinjer omsorg (forsøksdyr # A9452, # A10396 og # A896…

Representative Results

Tett regulering av bakteriemengden og temperaturen til aCSF under inkubering er viktig å opprettholde neuronal levedyktighet vev. Dette kan optimaliseres ved bestråling med lys UVC og opprettholdelse av temperaturen i aCSF ved 15 – 16 ° C (figur 1). Videre parametere den aCSF stempel (APS, figur 1C) gir eksperimentator med en registrering av miljøforhold (pH og temp.), Og dermed tilby en gullstandard for parametre når inkubasjon nervevev, som, hvis …

Discussion

Denne artikkelen beskriver en inkubasjon metode for å forlenge levedyktigheten av akutt neuronalvev for bildebehandling og elektrofysiologiske eksperimenter, og dermed redusere dyret tallene som trengs for å fullføre eksperimentelle mål. To hovedprosesser styrer forverring av nervevev over tid: i) økt bakterienivå, og den tilhørende økning i bakterie endotoksin løslatt, og ii) excitotoxicity som følger den traumatiske slicing prosedyren 10. Som akutt nervevevet er miljømessig forsvarsl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Materials

Sodium Chloride Sigma Aldrich VETEC V800372
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333
N-Methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S2554
Magnesium chloride Sigma Aldrich M9272 
Calcium chloride  Sigma Aldrich 223506
Papain Dissociation System Worthington  LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma Aldrich 276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance* Life technologies P-6867 20% solution in DMSO 
Fura-2 AM   Anaspec 84017
Fluo-4 AM   Life Technologies F23917
Fluo-8 AM Abcam Ab142773
Vibrating blade microtome  Leica Biosystem VT1200 S Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device 
Antivibration table Kinetic Systems Vibraplane  Vibraplane 9100/9200 
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI 
Microscope Objective Olympus XLUMPlanFLN 20x/1.00w 20X 
Microscope Objective Olympus LUMPlanFLN 60x/1.00w 60X
CCD Camera Andor Ixon +
High speed wavelength switcher Sutter instrument Lambda DG-4 
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries Sutter Instrument Co BF150-86-10
Microelectrode puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-40LP Low Profile Open Bath Chambers
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software Andor Andor iQ3
Braincubator Payo Scientific BR26021976 www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler TE Technology CP-121
Temperature Controller TE Technology TC-36-25 RS232

References

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
  8. Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
  13. Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).

Play Video

Cite This Article
Cameron, M. A., Kekesi, O., Morley, J. W., Bellot-Saez, A., Kueh, S., Breen, P., van Schaik, A., Tapson, J., Buskila, Y. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120), e55396, doi:10.3791/55396 (2017).

View Video