Langvarig Inkubasjon av akutt nervevev for Elektro og kalsium-imaging

Summary

Når den er fjernet fra kroppen, er nervevev sterkt påvirket av miljømessige forhold, som fører til eventuell nedbrytning av vev etter 6 – 8 timer. Ved å bruke en unik fremgangsmåte inkubasjon, som nøye overvåker og regulerer den ekstracellulære miljø av vev, kan vev levedyktighet bli betydelig forlenget i> 24 timer.

Abstract

Akutt forberedelser nevrale vev, hjerne skiver og retinal wholemount, kan vanligvis bare opprettholdes for 6-8 timer etter disseksjon. Dette begrenser den eksperimentelle tiden, og øker antallet dyr som benyttes per undersøkelse. Denne begrensningen spesielt påvirker protokoller som kalsium bildebehandling som krever langvarig pre-inkubasjon med bade-anvendt fargestoffer. Eksponensiell bakterievekst i løpet av 3 – 4 timer etter kutting er tett korrelert med en reduksjon i vev helse. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for å begrense spredning av bakterier i akutte preparater for å opprettholde levedyktig neuronalvev for lengre perioder (> 24 timer) uten behov for antibiotika, sterile prosedyrer, eller vevskultur-medium inneholdende vekstfaktorer. Ved å sykle den ekstracellulære væske gjennom UV-bestråling og å holde vevet i en tilpasset holdekammer ved 15 – 16 ° C, viser det vev ingen forskjell i elektrofysiologiske egenskaper, eller kalsium signaling gjennom intracellulære kalsiumfargestoffer ved> 24 h postdissection. Disse metodene vil ikke bare forlenge forsøkstiden for de som bruker akutt nervevev, men vil redusere antall dyr er nødvendig for å fullføre eksperimentelle mål, og vil sette en gullstandard for akutt nervevev inkubasjon.

Introduction

Elektrofysiologi og funksjonell imaging (kalsium, spenningsfølsomme fargestoffer) er to av de mest brukte eksperimentelle teknikker i nevrovitenskap. Hjernen slice forberedelser og retinal wholemount, som vil bli undersøkt her, være et middel for å undersøke elektrofysiologiske egenskaper og synaptiske tilkobling uten forurensning fra bedøvelse eller muskelavslappende. Hjerneskiver og retinal wholemount opprettholde sin strukturelle integritet, i motsetning til kulturer eller cellehomogenater, slik at studiet av bestemte kretser og hjernenettverk ^1. Opptak fra isolerte vev har fordeler fremfor in vivo innspillinger som bevegelser i forbindelse med hjerteslag og åndedrett er eliminert. Videre tillater direkte visualisering bestemte klasser av celler til å være målrettet, og lokal bruk av farmakologiske verktøy ^{2, 3.}

Patch-clamp opptak og calcium dye-lasting i retinal wholemount kompliseres av eksistensen av Indre Begrense Membrane (ILM), som dekker gangliecelle (RGC) lag og hindrer direkte tilgang til cellene. Vanligvis er denne membran skrapes bort med en glass pipette for å tillate direkte anvendelse av en lapp pipette og dannelse av en tetning gigaohm på en enkelt celle. I tillegg trenger bade-anvendt kalsium fargestoffer ikke krysse ILM og må enten injiseres under denne membranen ^4, retrograd transporteres etter injeksjon på synsnerven ⁵ eller electroporated gjennom vevet ^6. Videre, når utnytte en gnager-modell med retinitis pigmentosa, rd / rd mus, er det ILM tykkere og mer ugjennomtrengelig. Her bruker vi en teknikk for å fjerne ILM med enzymatisk fordøyelse ^7, slik at begge allestedsnærværende kalsium dye-lasting, og direkte tilgang til gangliecelle for patch-clamp recordiNGS ^8.

Vellykket opptak fra enten hjerneskiver eller retinal wholemount avhenge disseksjon og inkubasjon av levedyktig nervevev. Vanligvis er vevet ekstrahert om morgenen eksperimentet og inkubert i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) inntil den brukes til opptak. Vanligvis forblir vev levedyktig for 6 – 8 timer, med betydelig degradering etter dette tidsvinduet. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae preparater vanligvis produsere mer vev enn det som kan tas opp fra løpet av denne korte tidsperioden. Følgelig blir vev ofte kastet på slutten av dagen, og den disseksjon fullføres igjen på påfølgende dager. Dette betyr et annet dyr blir utnyttet og -2 timer om oppsett og disseksjon / farging gjentas. Følgende protokoll beskriver en metode for å forlenge levetiden til nervevev i mer enn 24 timer, noe som betyr at færre dyr blir benyttet, og mer eksperimentelle tid er tilgjengelig. Tissue levedyktighet wsom vurderes gjennom opptak elektrofysiologiske egenskaper og kalsium dynamikk, og disse egenskapene ble utvisket mellom <4 t og> 24 h postdissection.

Disse resultatene tyder på at det ikke bare er enkelt celle egenskaper intakt og funksjonell etter langvarig inkubasjon, men nettverksaktivitet, som vurderes av kalsium-bildebehandling og elektrofysiologiske opptak, er uendret> 24 h postdissection. Videre viser vi at kalsiumfargestoffer som kan forbli i cellene i lengre perioder uten å forårsake noen skadelige virkninger. Bruk av denne protokollen viser at den funksjonelle aktiviteten til nerveceller i akutt nervevev kan opprettholdes i lange perioder, når det ytre miljø er sterkt regulert. Videre, ettersom vev levedyktighet varierer mellom laboratorier på grunn av ulike ruge protokoller, etablerer denne metoden en gullstandard for ideelle parametere som skal brukes til å redusere variabiliteten i helse av akutt neuRonal vev.

Protocol

Protokollen nedenfor beskriver fremstillingen av C57BL / 6 og C3H / He (retinally degenerert) mus nervevev, men lignende teknikker kan brukes på andre arter. Alle dyrene var friske og håndteres med standardbetingelser av temperatur, fuktighet, 12 timer lys / mørke syklus, fri tilgang til mat og vann, og uten noen hensikt stresset stimuli. Alle forsøkene ble godkjent og utført i samsvar med Western Sydney University Animal Care og etikk komité og i henhold til dyret bruk og retningslinjer omsorg (forsøksdyr # A9452, # A10396 og # A896…

Representative Results

Tett regulering av bakteriemengden og temperaturen til aCSF under inkubering er viktig å opprettholde neuronal levedyktighet vev. Dette kan optimaliseres ved bestråling med lys UVC og opprettholdelse av temperaturen i aCSF ved 15 – 16 ° C (figur 1). Videre parametere den aCSF stempel (APS, figur 1C) gir eksperimentator med en registrering av miljøforhold (pH og temp.), Og dermed tilby en gullstandard for parametre når inkubasjon nervevev, som, hvis …

Discussion

Denne artikkelen beskriver en inkubasjon metode for å forlenge levedyktigheten av akutt neuronalvev for bildebehandling og elektrofysiologiske eksperimenter, og dermed redusere dyret tallene som trengs for å fullføre eksperimentelle mål. To hovedprosesser styrer forverring av nervevev over tid: i) økt bakterienivå, og den tilhørende økning i bakterie endotoksin løslatt, og ii) excitotoxicity som følger den traumatiske slicing prosedyren ^10. Som akutt nervevevet er miljømessig forsvarsl…

Materials

Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232