Summary
Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.
Abstract
Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.
Introduction
Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler1kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker2zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und Funktion durch eine verbindliche Veranstaltung in ein elektrisches Signal umwandeln. Die Aufführungen und Empfindlichkeiten aller Antikörper-basierten Biosensoren sind stark abhängig von im Wesentlichen zwei Parameter: (i) die Qualität des Antikörpers und (Ii) die Eigenschaften des Systems verwendet, um das Signal2zu generieren.
Antikörper sind hochmolekulare Masse dimeres Proteine (150 – 160 kDa), die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten bestehen. Die Interaktion zwischen den leichten und schweren Ketten wird meist durch hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine konservierte Disulfid Bindung stabilisiert. Jede Kette enthält eine Variable Domäne, die mit dem Antigen im Wesentlichen über drei hypervariablen Regionen benannt ergänzende Bestimmung Regionen (CDR1-2-3) interagiert. Trotz der zahlreichen Fortschritte auf dem Gebiet der großen Ausdruck in voller Länge Antikörper mit kostengünstigen Expressionssysteme (z. B. E. Coli) führt oft zu der Produktion von instabilen und aggregierte Proteine. Deshalb verschiedene Antikörperfragmente entwickelt haben, wie z. B. Single-Chain Variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa) Fragmente. Sie bestehen aus den Variablen Domänen von bzw. einem schweren und einem leichten Ketten, die durch eine synthetische Aminosäure-Sequenz kovalent verknüpft sind. Aber diese Fragmente häufig zeigen eine schlechte Stabilität und haben die Tendenz zu aggregieren, da sie einen Großteil ihrer hydrophoben Region zu Lösungsmittel4aussetzen. In diesem Zusammenhang scheinen einzelne Kette Kameliden Antikörperfragmente, genannt Nanobodies oder FHKW, hervorragende Alternativen zu ScFvs. Diese Domains entsprechen den Variablen Domänen der Kameliden Single-Kette Antikörper. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörper Kameliden Antikörper sind frei von Lichterketten und enthalten nur zwei schwere Ketten5. Nanobodies sind daher die kleinste Monomeren Antikörperfragmente (12 kDa) Antigen ähnlich dem des herkömmlichen Antikörper6Affinität binden. Darüber hinaus präsentieren sie verbesserte Stabilität und Löslichkeit im Vergleich zu anderen Full-length Antikörper oder Antikörperfragmente. Zu guter Letzt lassen ihre kleine Größe und erweiterte CDR3 Schlaufen kryptische Epitope erkennen und binden Sie an Enzym aktiven Zentren7,8. Heute, diese Domains erhalten große Aufmerksamkeit und wurden auf die Biosensor-Technologie kombiniert. Z. B. Huang Et Al. entwickelten eine gemeinnützige-basierten Biosensor für die Erkennung und Quantifizierung von menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA)9.
Wie bereits erwähnt-oben ist ein wichtiger Parameter in Biosensor-Assays die Effizienz des Systems verwendet, um das elektrische Signal zu erzeugen. Aus diesem Grunde Enzymbasis elektrochemische Biosensoren immer größer werdende Aufmerksamkeit erregt haben und für verschiedene Anwendungen wie Gesundheit, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung verbreitet. Diese Biosensoren verlassen sich auf die katalytische Hydrolyse eines Substrats durch ein Enzym, das elektrische Signal zu generieren. In diesem Zusammenhang β-Lactamases erwiesen sich bestimmten, sensiblen und einfacher umzusetzen experimentell als viele andere Enzyme z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase10. Β-Lactamases sind Enzyme, die für bakterielle Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika sind durch sie hydrolysieren. Sie sind Monomere, sehr stabil, effizient, und klein. Darüber hinaus generieren Domäne/Peptid Einfügungen in β-Lactamases bifunktionale Chimäre Proteinen, die gezeigt wurden, und effiziente Werkzeuge, um Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen. In der Tat, haben jüngste Studien gezeigt, dass Einfügen von Variablen Antikörperfragmente in TEM1 β-Lactamase Ergebnisse in ein chimäres Protein, die in der Lage, mit hoher Affinität zu ihren Ziel-Antigen gebunden bleibt. Interessanterweise zeigte die Antigen-Bindung allosterische Verordnung TEM1 katalytische Aktivität11,12zu induzieren. Darüber hinaus zeigten wir in mehreren Studien, dass Protein Domäne einführen in eine permissive Schleife des Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase Funktionsproteine Chimären erzeugt, die gut geeignet zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen13 ,14. Wir eingefügt vor kurzem eine gemeinnützige, Fahrerhaus-Lys3, in diesem freizügigen Insertionsstelle BlaP15benannt. Diese gemeinnützige zeigte an Henne-Ei-weiß Lysozym (HEWL) binden und seine enzymatische Aktivität16zu hemmen. Wir haben gezeigt, dass das erzeugte Hybrid-Protein, benannt BlaP-Fahrerhaus-Lys3, eine hohe Spezifität erhalten / Affinität gegen HEWL, während die β-Lactamase-Aktivität blieb unverändert. Dann haben wir erfolgreich kombiniert die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine elektrochemische Biosensor und zeigte, dass die Höhe der erzeugte elektrische Signal abhängig von der Interaktion zwischen BlaP-Fahrerhaus-Lys3 und HEWL auf einer Elektrode immobilisiert. Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika durch BlaP induziert in der Tat eine Proton-Release, die in einem quantitativen elektrisches Signal umgewandelt werden kann. Diese Kombination von β-Lactamase Hybridtechnik mit eine elektrochemische Biosensor ist schnell, empfindlich, quantitative und ermöglicht Echtzeit-Messung von das erzeugte Signal. Diese Methode wird hier beschrieben.
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Protocol
(1) Protein Probenvorbereitung
- Produzieren Sie und reinigen Sie das Hybrid-Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wie in unserer vorherigen Studie15berichtet. Speichern Sie das Protein in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7.4 mit folgender Zusammensetzung: 0,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser aufgelöst, 1,44 g Na2HPO4 , 8 g NaCl und 0,2 g KCl beheben den pH-Wert der Lösung auf 7,4 vor Anpassung der letzte Band der Lösung 1 sterilisieren L. Filter die Proteinlösung.
- Bereiten Sie eine Henne Eiweiß Lysozym (HEWL) Stammlösung. Lösen Sie 100 mg (40.000 Einheiten/mg) im Handel erworbenen HEWL in 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS siehe Schritt 2.1.1 auf). Sterilisieren Sie die Proteinlösung durch Filtration, die Verwendung von Filtern mit einem Cutoff von 0,22 μm.
2. Biosensor-Assays
-
Lösung und Puffer Vorbereitung
- Bereiten Sie 50 mM PBS durch 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser auflösen. Passen Sie auf pH 7.4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH vor dem Einstellen der Lautstärke der Lösung 1 L. Filter sterilisieren und bei 4 ° c lagern
- Bereiten Sie eine Sättigung/blockieren Lösung durch Auflösen von 3 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine verbindliche Lösung durch Auflösen von 1 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
- Vorbereiten eine Waschlösung (0,1 % Tween - PBS) durch Zugabe von 100 μl der Tween 20 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS) durch Zugabe von 1 mL der Triton x-100 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine Elektrode Regenerationslösung (3,5 M KCl) durch Auflösen von 26 g KCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen 100 mL. Filtern Sie sterilisiert und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine 5 mM NaCl-Lösung durch Auflösen von 0,29 g NaCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Dann bereiten Sie eine Erkennung-Lösung (4 mM Penicillium) durch Auflösen von 26,7 mg Penicillium in 20 mL 5 mM NaCl-Lösung. Filter zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.
-
Sensor-Vorbereitung und regeneration
Hinweis: Die Polyaniline beschichtete Sensor-Chips wurden entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Die Beschreibung des Sensors sowie die Polyaniline Elektro-Polymerisation-Protokolle verwendet, um diese Sensoren zu synthetisieren sind detailliert in ihrer vorherigen Arbeit17. Kurz, nutzt dieses System wiederverwendbare Sensoren von acht einzelnen Chips, die von klassischen Printed Circuit Board (PCB) Techniken hergestellt wurden. Einzelnen Chips bestehen aus drei Elektrode runden Flecken. Die oberste ist die Arbeitselektrode auf welche Polyaniline Electro synthetisiert wurde. Die Mitte ist die Bezugselektrode und die unteren Elektrode bildet die Gegenelektrode. Sowohl die Referenz und die Zähler-Elektroden sind funktionalisiert mit soliden Ag/AgCl Amalgam auf die CO2-Schicht.- Führen Sie 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS, siehe Schritt 2.1.5.). Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
- Spülen Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well von destilliertem Wasser für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
- Regenerieren Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well der Regenerationslösung (3,5 M KCl, siehe Schritt 2.1.6) über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur.
- 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung durchzuführen (siehe Schritt 2.1.1.). Durchführen Sie jedem Waschgang für 2 Minuten mit schonendes Mischen bei Raumtemperatur.
-
Verbindliche Assay durchgeführt auf dem sensor
- HEWL Mantel auf die PANI (Polyaniline) Oberfläche der Elektrode durch die Hinterlegung einer 15 µL Drop von 40 µg/mL HEWL mit PBS-Puffer auf der Elektrodenoberfläche vorbereitet. Über Nacht bei 4 ° C oder 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
- Führen Sie drei wäscht von Elektroden mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (siehe Schritt 2.1.1) durch die Elektrode Teile des Sensor-Chips in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung eintauchen. Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.
- Die Elektroden durch Zugabe von 50 µL Tropfen die blockierende Lösung zu sättigen (siehe Punkt 2.1.2) auf der Elektrodenoberfläche. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen dreimal wie beschrieben in der vorherigen Schritt (siehe Punkt 2.3.2).
- Die BlaP-Kabine-Lys3-Lösung für 20 µg/mL in verbindlichen Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1.3) und einen 15 µL Tropfen verdünnte Lösung auf die Elektroden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Antigen-gemeinnützige Reaktion zu waschen dreimal wie beschrieben im vorherigen Schritt die Waschlösung verwenden (siehe Schritt 2.1.4). Spülen Sie die Elektrode einmal mit PBS (siehe Schritt 2.1.1).
- Schließen Sie für die Erkennung den Sensor-Chip über den Kupfer-Schaltung Teil, ein digital-Multimeter. Dann, die Sensor-Antwort durch die Anwendung eines Tropfen 50 µL Erkennung Lösung zu initiieren (siehe Schritt 2.1.7) auf den positiven Elektroden und Anwendung einen Tropfen 50 µL NaCl 5 mM Lösung auf den negativen Elektroden (siehe Schritt 2.1.7). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Leitwert mit einem digitalen Multimeter.
Hinweis: Das Multimeter wurde durch Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. bereitgestellt. Diese Potentiostaten ist computergesteuert über einen USB-Port und die acht verschiedenen Chips des Sensors gleichzeitig analysiert. Die Software erstellt von Yunus und Kollegen17 erzeugt einen Echtzeit-Plot, der die Messungen der Leitfähigkeit unterscheiden sich die Referenz und Sample Elektroden gegen die Zeit darstellt.
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Representative Results
Design und Engineering von Chimären Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3
Abbildung 1 stellt das Einfügen der Fahrerhaus-Lys3 in eine permissive BalP Klasse A β-Lactamase-Schleife aus Bacillus Licheniformis. Die Aufnahme wurde zwischen Rückstände Asp198 und Lys199 durchgeführt. Ein Thrombin-Spaltstelle wurde auf jeder Seite der Kabine-Lys3 eingeführt. Zellen mit einer konstitutiven Expressionsplasmid Codierung der BlaP-Fahrerhaus-Lys3 Chimären Proteins umgewandelt waren in der Lage, in der Gegenwart eine geringe Konzentration von Ampicillin zu wachsen. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Hybrid β-Lactamase löslich, korrekt gefaltet und kann erfolgreich in den periplasmatischen Raum wo es effizient Widerstand gegen Ampicillin bieten kann Bakterien ausgeschieden werden. Weitere analysierten wir die Bifunktionalität der unser chimäres Protein. Wie bei unseren früheren Studien berichtet, zeigte unsere Daten, dass die β-Lactamase sowie die Fahrerhaus-Lys3 Moieties chimäres Protein ihren biologischen Aktivitäten15beibehalten.
Conductimetric Biosensor-assay
Der Sensor für diese Assay verwendeten Chips ist in Abbildung 2 dargestellt. Für diese Experimente verwendeten Sensoren enthalten 8 Chips. Jeder Chip enthält drei Elektroden: eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und einer Referenzelektrode. Diese 8 Chips sind als 4 Paare im Sensor organisiert. Für jedes Paar einen der Chips mit der Bezeichnung "-" eine negative Kontrolle während der Chip mit der Bezeichnung "+" der Probe entspricht entspricht.
Abbildung 3 stellt die schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus in dieser Arbeit, die die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine potentiometrische Biosensor kombiniert verwendet. In dieser Konfiguration werden zwei Elektroden verwendet: (i) eine Referenzelektrode und (Ii) eine Polyaniline (PANI) beschichtete Elektrode. HEWL ist an die PANI beschichtete Elektrode adsorbiert, wie in anderen Studien18,19berichtet. Nach angemessenen Waschungen, BlaP-cAb-Lys3 (für "+" gekennzeichnet Späne) oder BlaP ohne eingefügte gemeinnützige (für "-" gekennzeichnet Späne) auf die Elektroden angewendet werden. Nach dem Zusatz von β-Lactam (Penicillium) an den Elektroden werden Veränderungen der Elektrode Leitwert gemessen. Β-Lactam-Hydrolyse durch β-Lactamases erzeugt in der Tat eine Freisetzung von Protonen; die zeigte signifikante Veränderungen in Elektrode Leitwert mit einer sehr kurzen Reaktionszeit zu schaffen. Der Biosensor-Assays, dargestellt in Abbildung 4 zeigen, dass die Bindung von BlaP-Fahrerhaus-lys3, HEWL immobilisiert die PANI Elektrode kann erkannt und überwacht durch die Messung der Proton Version aus der immobilisierten β-Lactamase-Aktivität. Im Gegensatz dazu war kein Leitwert Unterschied erkannt, wenn das Experiment mit BlaP ohne jede eingefügte gemeinnützige durchgeführt wurde.
Abbildung 1: Schema repräsentieren die chimäres Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 Interaktion mit HEWL. BlaP ist in Cyan, Fahrerhaus-Lys3 in Orange und HEWL in blau dargestellt. Diese Zahl wurde durch die Kombination von der dreidimensionalen Strukturen von BlaP erhalten (PDB ID: 4BLM) und dem Fahrerhaus-Lys3/HEWL Komplex (PDB-ID: 1MEL). Die β-Lactamase enthält 2 Domains: die α/β und α-Domäne, das katalytische Gelände liegt an der Schnittstelle zwischen beiden Domänen. Die Schleife verwendet für die Einfügung ist gelb markiert und befindet sich in einem Lösungsmittel ausgesetzt Loop in der α-Domäne. Die N - und C-terminalen Teile der Kabine-Lys3 werden in rot angezeigt. Die CDR3-Schleife des Taxi-Lys3 nutzt die Kontakte mit der katalytischen HEWL-Website. Die Bindung der Fahrerhaus-Lys3, HEWL hemmt die enzymatische Aktivität. Diese Zahl und die hierin vorgestellten Ergebnisse wurden in unserer bisherigen Arbeit15veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bild des Sensors in das Experiment verwendet. Jeder Sensor enthält eine Gruppe von 8 einzelnen Chips. Auf jedem Chip gibt es drei Elektroden: eine Arbeitselektrode, eine Referenzelektrode und einer Gegenelektrode Ion. Die Kupfer-bedeckten Teil angeschlossen ist, ein digital-Multimeter an einen Computer angeschlossen. Die einzelnen Chips sind als 4 Paare organisiert wo die "-" beschrifteten Chips sind Negativkontrolle Elektroden und die "+" beschrifteten Chips sind die Probe-Elektroden. Diese Einrichtung ermöglicht es, verschiedene experimentelle Wiederholungen oder HEWL / β-Lactamase-Konzentrationen gleichzeitig getestet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus in unserem Biosensor-Assay verwendet. HEWL wurde auf eine beschichtete Elektrode PANI (Polyaniline) immobilisiert. Chimäre Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wurde dann auf die Elektrode aufgetragen. Die immobilisierten β-Lactamase-Aktivität, die bestimmt wird durch die Messung der Veröffentlichung von Protonen durch die Hydrolyse von Penicillium induziert, ist direkt proportional zu der Interaktion zwischen HEWL und dem chimäres Protein. Die Proton-Freisetzung induziert elektrische Leitfähigkeit Änderungen, die in ein Signal umgewandelt werden, die vom Benutzer interpretiert werden können. Evolution der Leitwert-Unterschied zwischen den PANI beschichtet und die Bezugselektrode als Funktion der Zeit. Diese Zahl und die hierin vorgestellten Ergebnisse wurden in unserer bisherigen Arbeit15veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: grafische Darstellung der conductimetric Messungen zeigen die spezifische Interaktion von BlaP-Fahrerhaus-Lys3 HEWL. Die Zugabe von Penicillium wird durch einen Pfeil angezeigt. Diese Potentialdifferenz ergibt sich aus der Proton Version auf Antibiotika Hydrolyse auftreten. Die Messungen wurden mit dem Hybrid-Protein BlaP-cAb-Lys3 (rot) und native β-Lactamase-BlaP ohne jede eingefügte gemeinnützige (blau), als Negativkontrolle. Die verschiedenen Kurven stellen unabhängige Messungen auf verschiedenen Chips. Diese Zahl und die hierin vorgestellten Ergebnisse wurden in unserer bisherigen Arbeit15veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einfügung stellt Vorteile und Einschränkungen, die im Mittelpunkt dieses Abschnitts werden.
Vorteile der Hybrid-β-Lactamase-Technologie.
Β-Lactamases sind effiziente Enzyme
Eines der wichtigsten Parameter, die Einfluss auf die Empfindlichkeit und Signal-Rausch-Verhältnis eines Biosensors, ist die enzymatische Aktivität verwendet, um das Signal zu erzeugen. In diesem Zusammenhang β-Lactamases präsentieren mehrere Vorteile: sie sind klein (≈29 kDa), Monomere, sehr stabil und mehr wichtig ist, weisen hohe spezifische Aktivität und hohen Umsatz im Vergleich zu anderen Enzymen in potentiometrische Sensor Assays wie Glucose verwendet Oxidase, Urease, Lipase, Peroxidase oder alkalische Phosphatase20. Aus all diesen Gründen sind β-Lactamases Enzyme der Wahl für verschiedene Biosensor-Assays.
Direkte Übernahme in die β-Lactamase kann die Produktionsausbeute und Stabilität der eingefügten Protein/Domäne verbessern.
Einer der limitierenden Aspekte von vielen Immunosensor-Assays ist die Qualität (Stabilität, Reinheit) des Antikörpers verwendet, um die Analyten2erkennen. Derzeit, low-cost Produktionssysteme von Antikörpern oder Antikörperfragmente (z. B. E. Coli) bleibt anspruchsvoll und führen oft zu aggregierten Proteinen mit schlechte Löslichkeit und Stabilität21. Unsere Hybrid-β-Lactamase-Technologie scheint ein guter Ansatz, um diese Schwierigkeiten zu überwinden, da wir zuvor gezeigt, dass diese Strategie den Ausdruck Ertrag und die Stabilität der eingefügten Protein Domänen14verbessert. Insbesondere in der vorliegenden Studie mit unserem Hybrid-β-Lactamase-System, wurde das Chimäre Protein namens BlaP-Fahrerhaus-Lys3 erfolgreich in E. Coli mit eine sehr gute Ausbeute (≈10 mg reines Eiweiß pro Liter Kultur) zum Ausdruck gebracht und zur Homogenität gereinigt.
Kovalente Kopplung zwischen den Antikörper und enzymatische Moieties macht billiger und schneller Sensor-assays
In herkömmlichen Immunosensoren erfordert die Erkennung des Analyten die Auslastung der primären Antikörper, die auf den Sensor-Chip immobilisiert sind. Anschließend ist ein sekundäre Antikörper, der an ein Enzym oder ein markierte Sonde gekoppelt ist auch erforderlich, um ein messbares Signal zu erzeugen. Dieser Ansatz beinhaltet mehrere Inkubationen und Waschschritte und daher kann zeitaufwendig sein. Darüber hinaus ist dieses Protokoll teuer, da mehrere Antikörper erforderlich sind und kovalente Bindung zwischen der Sekundärantikörper und ein Enzym/Sonde auch notwendig ist. Im Gegensatz dazu unser System verwendet nur ein Hybrid-Protein zu erkennen und zu quantifizieren den Analyten und ermöglicht somit Echtzeitüberwachung ohne den Einsatz von sekundären Antikörper.
Darüber hinaus ist es wichtig festzustellen, dass Domäne einführen in Klasse wurde ein β-Lactamases gezeigt Hybrid Proteine ausstellenden allosterische Schalter-ähnliches Verhalten22,23generieren. Solche Schalter konnte zahlreiche Anwendungen in Biosensoren Tests gefunden werden.
Einschränkungen der β-Lactamase Hybridtechnologie.
Einschränkungen durch Protein-Engineering induziert.
In diesem System ist die größte Schwierigkeit zu entwerfen und ein Hybrid-Protein durch die β-Lactamase Antikörper glyko-einfügen erhalten. Dieses resultierende Chimäre Protein bifunktionelle werden muss: die enzymatische Abstimmungsunterlagen muss in der Lage, effizient hydrolyse β-Lactam-Antibiotika um das elektrische Signal zu erzeugen, während die Antikörper glyko-, gezielte Analyten mit hoher Affinität binden muss bleiben und Spezifität. Um bifunktionelle Chimären Proteinen zu erhalten, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden, um die sterische Zwänge zu vermeiden. Der erste kritische Punkt ist die Position der Insertionsstelle. Obwohl gezeigt wurde, dass mehrere Einfügepunkte möglich24,25,26, Einfügung Positionen befinden sich oft in Lösungsmittel ausgesetzt Schleifen weit weg von der aktiven Seite des das Trägerprotein. Dies minimiert mögliche Konformationsänderungen oder sterische Behinderung durch das eingefügte Protein induziert. Aus den gleichen Gründen wird es auch empfohlen, aktiven Seite des eingefügten Protein befindet sich weit weg von der Einstichstelle sein um Veränderungen ihrer Tätigkeit zu verhindern. Zu guter Letzt wird Aufnahme von Proteinen, die flexibel oder benachbarten N - und C-terminalen Extremitäten präsentieren besser toleriert werden. In der Tat können entfernte und steife Extremitäten sterische Einschränkungen für beide Partner das chimäres Protein zu verhängen und verändern damit die jeweiligen biologischen Aktivitäten. Daher ist es wichtig zu erwähnen, dass die Größe des eingefügten Proteins nur wenig Einfluss auf die resultierende chimäres Protein hat. In der Tat hat sich gezeigt, dass große strukturierten Domänen in β-Lactamases, erfolgreich eingesetzt werden können, solange ihre N - und C-terminalen Extremitäten flexibel sind oder in der Nähe von einander13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. in der vorliegenden Studie die Insertionsstelle in BlaP ist weit entfernt von seiner aktiven Seite und die eingefügten gemeinnützige hat relativ lange, flexible Extremitäten (nicht sichtbar in der Röntgen-Struktur), die sich weit weg von der Paratope befinden. Diese Besonderheiten sicherstellen, dass die biologisch aktiven Oberflächen beider Partner des Hybrid-Proteins minimalste sterische Einschränkungen auferlegt werden. Jedoch wenn das eingefügte Protein nicht die empfohlenen Kriterien für optimale Einfügung in ein Trägerprotein präsentieren, ist es möglich, Ingenieur Linker Regionen um potenzielle sterische Zwänge zu senken. In der Tat zeigte die Anwesenheit von eine flexible Linker (z.B. Gly-Ser Wiederholungen), die Träger zu verbinden und die eingefügten Protein drastisch erhöhen die Toleranz gegenüber das Einführen des großen und strukturierte Proteine in einem Träger eines30 ,12.
Einschränkungen für elektrochemische Biosensoren.
Obwohl die Entwicklung von elektrochemischen/potentiometrische Biosensoren eine immer größer werdende Feld geworden ist, haben diese Tests wichtige Einschränkungen, die bei der Gestaltung der Biosensor-Experiment berücksichtigt werden müssen. Erstens, alle Biosensoren, die H+ Veröffentlichung oder Verbreitung erfordern den Einsatz von sehr schwach gepufferten Lösungen (d. h. < 5 mM)31 um mögliche Unterschiede zu messen. Die pH-Variante induziert nach H+ Freigabe kann der Protein-Eigenschaften und die enzymatische Aktivität verwendet, um das Signal zu erzeugen auswirken. Zweitens können pH und der Ionenstärke in auszahlt erheblich variieren und somit wichtige Unterschiede in der Reaktion zur Folge und erhöhen die Geräuschkulisse der Biosensoren32. Deshalb, verschiedene Forschergruppen haben versucht zu entwickeln Nanotechnologien um die Größen der elektrochemischen Sensorelemente zu verringern, um das Signal-Rausch-Verhältnis für die Prozesse zu erhöhen, die an der Schnittstelle zwischen Gerät33, auftreten 34 , 35. Folglich ist es auch möglich, Antikörpermoleküle beschriftet mit mehreren Molekülen des gleichen Enzyms, das Signal durch die Bindung von einem Molekül auf der Ziel-32zu erhöhen zu entwickeln. Trotz dieser Einschränkungen bleiben jedoch Conductometric/Biosensoren hocheffizient und empfindliche Geräte mit geschätzten Grenzen der Erkennung (DGS) im Bereich von 10-8 bis 10-11 M36.
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass wir erfolgreich eine gemeinnützige einfügen können, die in einer Klasse A β-Lactamase genannt BlaP HEWL abzielt und das generierte Hybrid-Protein behält sich beide biologischen Aktivitäten: i) enge Bindung von HEWL und (Ii) die Fähigkeit, hydrolyse Β-Lactam-Antibiotika. Diese Studie bildet eine Proof of Concept für die Einfügung von verschiedenen Nanobodies oder Antikörper-Fragmenten in BlaP und die Umsetzung dieses Protein Hybridtechnologie in potentiometrische Sensor-Assays. Diese Technologie könnte potenziell verwendet, um verschiedene Protein Epitope erkennen und in zahlreichen Diagnose-Tools implementiert. In der Tat, die Entwicklung und die effektive Nutzung von solchen Assays sind wichtig in unserer Gesellschaft geworden und sind im wesentlichen getrieben von sozialen und wirtschaftlichen Bedürfnissen für kostengünstige und einfach zu bedienen Technologien in den Bereichen Ernährung und Gesundheit Systeme, vor allem in in Entwicklungsländern. Darüber hinaus spielen Nanotechnologie eine immer größere Rolle bei der Entwicklung solcher Sensoren. Heutzutage sind Signal Verarbeitungstechnologien auf tragbaren Geräten wie Smartphones und Tablets und andere Smartphone Anwendungen gibt es bereits für Signalverarbeitung37zur Verfügung. Zum Beispiel hat vor kurzem eine potentiometrische Sensoreinrichtung ein Smartphone Glukosekonzentration38Überwachung ermöglichen integriert. Die Gesundheits-Experten sind überzeugt, dass diese Art von innovativen Geräten wichtiger Lösungen für das Gesundheitswesen in den kommenden Jahren39,40werden.
Diese Arbeit stellt abschließend ein Beispiel, das zeigt das Potenzial und die Vorteile unserer Technologie Protein einsetzen. Wir hoffen, dass diese Arbeit dazu beitragen, um innovative und nützliche Technologien für Forschung und medizinische Zwecke zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen der wallonischen Region Belgiens im Rahmen der SENSOTEM und NANOTIC Forschungsprojekte sowie die nationalen Fonds für die wissenschaftliche Forschung (F.R.S.-F.N.R.S) für ihre finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
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