Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Brug af en β-lactamase-baseret Conductimetric Biosensor Assay til påvisning Biomolekylær interaktioner

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/55414
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 4
1Life Science Department, University of Liège, 2Institute of Condensed Matter and Nanoscience, Catholic University of Louvain, 3Laboratory of Clinical Microbiology, Catholic University of Louvain, 4Biotechnology Department, CER Group
* These authors contributed equally

Summary

I dette arbejde rapportere vi en ny metode til at undersøge protein-protein interaktioner ved hjælp af en conductimetric biosensor baseret på β-lactamase Hybridteknologien. Denne metode bygger på frigivelse af protoner ved hydrolyse af β-lactamer.

Abstract

Biosensorer bliver stadig vigtigere og mere gennemført i forskellige felter som patogen detektion, Molekylær diagnose, miljøovervågning og mad sikkerhed kontrol. I denne sammenhæng brugte vi β-lactamaser som effektiv reporter enzymer i flere protein-protein interaktion undersøgelser. Derudover opfordrer deres evne til at acceptere indsætninger af peptider eller struktureret proteiner/domæner kraftigt til brug af disse enzymer til at generere kimære proteiner. I en nylig undersøgelse indsat vi et enkelt domæne antistof fragment i Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Disse små domæner, også kaldet nanobodies, er defineret som de antigen-bindende domæner af enkelt kæde antistoffer fra camelids. Som fælles dobbelt kæde antistoffer viser de høje tilhørsforhold og særlige forhold til deres mål. Den resulterende kimære protein udstillet en høj affinitet mod sit mål samtidig bevare β-lactamase aktivitet. Dette tyder på, at nanobody og β-lactamase fraspaltning forbliver funktionel. I det foreliggende arbejde rapporterer vi en detaljeret protokol, der kombinerer vores hybrid β-lactamase system til biosensor teknologi. Specifikke bindingen af nanobody til sit mål kan blive opdaget takket være en conductimetric måling af protoner frigivet ved den katalytiske aktivitet af enzymet.

Introduction

Biosensorer er analytiske enheder, der kombinerer en bio-Molekylær interaktion med fysiske eller kemiske signaling enheder kaldes transducere1. Optaget-signaler kan derefter fortolkes og konverteres til at overvåge interaktioner mellem immobiliserede og gratis partnere. De fleste af biosensorer indebærer brug af et antistof til at opdage analysander såsom hormoner eller forskellige patogen markører2. Forskellige sensor-formater kan bruges og omfatter masse-baseret, magnetisk, optisk eller elektrokemiske biosensorer. Sidstnævnte er blandt de mest almindeligt anvendte sensorer, og fungerer ved at konvertere en bindende begivenhed til et elektrisk signal. Forestillinger og følsomhed af alle antistof-baserede biosensorer er stærkt afhængige af hovedsagelig to parametre: i) kvaliteten af antistoffet og ii) systemet bruges til at generere signal2egenskaber.

Antistoffer er høj-molekylære masse dimerisk proteiner (150-160 kDa), der består af to tunge kæder og to lys kæder. Samspillet mellem de lette og tunge kæder er for det meste stabiliseret med hydrofobe interaktioner samt en bevaret disulfid obligation. Hver kæde omfatter en variabel domæne, der interagerer med antigen hovedsagelig via tre hypervariable regioner opkaldt supplerende bestemmelse af regioner (CDR1-2-3). Trods mange fremskridt inden for feltet, de storstilede udtryk for fuld længde antistoffer med low-cost udtrykket systemer (fx E. coli) ofte fører til produktion af ustabile og aggregerede proteiner. Det er derfor forskellige antistof fragmenter er blevet udviklet som single-kæde variabel fragmenter3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består af de variable domæner i henholdsvis en tung og en lys kæder, der er kovalent forbundet af en syntetisk aminosyresekvens. Men disse fragmenter ofte vise en dårlig stabilitet og har tendens til at sammenlægge, eftersom de udsætter en stor del af deres hydrofobe regioner til solvent4. I denne forbindelse synes enkelt kæde camelid antistof fragmenter, kaldet nanobodies eller VHHs, at være gode alternativer til ScFvs. Disse domæner svarer til de variable domæner i camelid single-kæde antistoffer. I modsætning til konventionelle antistoffer, camelid antistoffer er blottet for lys kæder og kun indeholde to tunge kæder5. Derfor, nanobodies er de mindste monomere antistof fragmenter (12 kDa) stand til at binde sig til antigen, en affinitet svarer til konventionelle antistoffer6. Derudover nuværende de forbedret stabilitet og Opløselighed i forhold til andre fuld længde antistoffer eller antistof fragmenter. Endelig, deres små størrelser og deres udvidede CDR3 sløjfer tillade dem at genkende kryptiske epitoper og binde til enzymet aktive steder7,8. I dag er disse domæner får stor opmærksomhed og har været kombineret til biosensor teknologi. For eksempel, Huang mfl. har udviklet en nanobody-baseret biosensor for påvisningen og kvantificeringen af humane prostata-specifikt antigen (PSA)9.

Som nævnt-ovenfor er en vigtig parameter i biosensor assays effektiviteten af systemet bruges til at generere det elektriske signal. Af denne grund, enzym-baserede elektrokemiske biosensorer har tiltrukket stadig større opmærksomhed og har været udbredt til forskellige applikationer såsom sundhedspleje, fødevaresikkerhed og miljøovervågning. Disse biosensorer stole på katalytiske hydrolyse af et underlag af et enzym til at generere det elektriske signal. I denne sammenhæng viste β-lactamaser sig at være mere specifik, mere følsomme og lettere at gennemføre eksperimentelt end mange andre enzymer såsom basisk fosfatase eller peberrodsperoxidase10. Β-lactamaser er enzymer, der er ansvarlig for bakteriel resistens over for β-lactam antibiotika af hydrolyzing dem. De er monomere, meget stabile, effektive, og af ringe størrelse. Derudover generere domæne/peptid indsættelser i β-lactamaser bi-funktionelle kimære proteiner, der viste sig at være effektive redskaber til at undersøge protein-ligand interaktioner. Ja, nyere undersøgelser har vist at indsættelse af antistof variable fragmenter i TEM1 β-lactamase resultater i en kimære protein, der fortsat er stand til at binde med høj affinitet til dens mål antigen. Interessant, blev antigen-bindende vist sig at fremkalde allosteriske regulering af TEM1 katalytiske aktivitet11,12. Endvidere viste vi i flere undersøgelser at protein domæne indsættelse i en eftergivende loop af Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genererer funktionelle kimære proteiner, der er velegnet til at overvåge protein-ligand interaktioner13 ,14. Vi har for nylig indsat en nanobody, opkaldt cAb-Lys3, i denne eftergivende indsættelsesstedet BlaP15. Denne nanobody blev vist til at binde til høne-æggehvide lysozym (HEWL) og til at hæmme dets enzymatiske aktivitet16. Vi viste at det genererede hybrid protein, opkaldt BlaP-cAb-Lys3, bevaret en høj specificitet / affinitet mod HEWL mens β-lactamase aktivitet forblev uændret. Så vi med held kombinerede bastard β-lactamase teknologi til en elektrokemisk biosensor og viste, at mængden af genererede elektrisk signal var afhængig af samspillet mellem BlaP-cAb-Lys3 og HEWL immobiliseret på en elektrode. Faktisk, hydrolyse af β-lactam antibiotika ved BlaP inducerer en proton udgivelse, der kan omdannes til en kvantitativ elektrisk signal. Denne kombination af β-lactamase Hybridteknologien med en elektrokemisk biosensor er hurtig, følsomme, kvantitative, og giver mulighed for real-time måling af den genererede signal. Denne metode er beskrevet heri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein prøveforberedelse

  1. Producere og rense hybrid protein BlaP-cAb-Lys3 som rapporteret i vores tidligere undersøgelse15. Gemme protein i 50 mM fosfat buffer pH 7,4 med følgende sammensætning: 8 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 opløst i 800 mL destilleret vand lave pH af løsningen på 7,4 før justering af det endelige rumfang af opløsning til 1 sterilisere L. Filter protein løsning.
  2. Forberede en høne æggehvide lysozym (HEWL) stamopløsning. Opløs 100 mg (40.000 enheder/mg) af kommercielt købte HEWL i 10 mL af fosfat buffer saltvand (PBS se trin 2.1.1). Sterilisere protein løsning ved filtrering ved hjælp af filtre med en 0,22 μm cutoff.

2. biosensor Assays

  1. Løsning og buffer forberedelse
    1. Forberede 50 mM PBS ved at opløse 8 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 i 800 mL destilleret vand. Justere pH 7,4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH før justering af lydstyrke af løsning 1 L. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forberede en mætning/blokering løsning ved at opløse 3 g af kasein hydrolysat i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (Se trin 2.1.1). Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
    3. Forberede en bindende løsning ved at opløse 1 g af kasein hydrolysat i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (Se trin 2.1.1). Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
    4. Udarbejde en vask løsning (0,1% Tween - PBS) ved at tilføje 100 μL af Tween 20 (100%) i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (Se trin 2.1.1). Opbevares ved 4 ° C.
    5. Forberede en elektrode forberedelse løsning (1% Triton X-100-PBS) ved tilsætning af 1 mL af Triton X-100 (100%) i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (Se trin 2.1.1). Opbevares ved 4 ° C.
    6. Forberede en elektrode regenerering løsning (3,5 M KCl) ved at opløse 26 g af KCl i destilleret vand til en endelige rumfang 100 mL. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
    7. Forbered en 5 mM NaCl løsning ved at opløse 0,29 g NaCl i destilleret vand til en endelige mængden af 1 L. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C. Derefter, forberede en påvisning løsning (4 mM benzylpenicillin) ved at opløse 26.7 mg af benzylpenicillin i 20 mL 5 mm NaCl løsning. Filter steriliseres og opbevares ved-20 ° C.
  2. Sensor forberedelse og regenerering
    Bemærk: Polyaniline belagt sensor chips blev udviklet og venligst leveret af Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus og Prof. Y. Glupczynski (katolske universitet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Beskrivelse af sensoren såvel som de polyaniline electro-polymerisering protokoller bruges til at syntetisere disse sensorer er nærmere beskrevet i deres tidligere arbejde17. Kort, dette system bruger genbrugelige sensorer af otte individuelle chips, der blev fremstillet af klassisk printed circuit board (PCB) teknikker. Enkelte chips er sammensat af tre elektrode runde steder. Øverst er den arbejdende elektrode på hvilke polyaniline blev electro-syntetiseret. Den midterste er reference elektroden og bunden elektrode udgør counter elektrode. Både referencen og counter elektroderne er functionalized ved hjælp af solid Ag/AgCl amalgam på toppen af kulstof lag.
    1. Udføre 3 vasker af elektroderne ved dypning tips i wells af en 96-brønd plade der indeholder 300 µL/brønd af elektrode forberedelse løsning (1% Triton X-100-PBS, se trin 2.1.5.). Udføre hver vask i 2 min. med blide blanding ved stuetemperatur.
    2. Skyl elektroderne ved at dyppe spidsen ind i huller i en 96-brønd pladen som indeholder 300 µL/brønd af destilleret vand i 2 min. med blide blanding ved stuetemperatur.
    3. Regenerere elektroderne ved at dyppe spidsen ind i huller i en 96-brønd pladen som indeholder 300 µL/brønd af regenerering løsning (3,5 M KCl, se trin 2.1.6) natten over ved 4 ° C eller 1 time ved stuetemperatur.
    4. Udføre 3 vasker af elektroderne ved dypning tips i wells af en 96-brønd plade der indeholder 300 µL/brønd af fosfat buffer saltvand (Se trin 2.1.1.). Udføre hver vask 2 minutter med blide blanding ved stuetemperatur.
  3. Bindende analysen udføres på sensoren
    1. Frakke HEWL PANI (polyaniline) overfladen af elektroden ved at deponere en 15 µL dråbe 40 µg/mL HEWL udarbejdet i PBS overfladen, elektrode. Der inkuberes natten over ved 4 ° C eller 1 time ved stuetemperatur.
    2. Udføre tre vasker af elektroder med fosfat buffer saltvand (Se trin 2.1.1) ved at dyppe elektrode dele af sensor chips i wells af en 96-brønd plade der indeholder 300 µL/brønd af fosfat buffer saltvand. Udføre hver vask i 2 min. med blide blanding ved stuetemperatur.
    3. Mætte elektroderne ved at tilføje en 50 µL dråbe den blokerende løsning (Se trin 2.1.2) elektrode overfladen. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Derefter vaskes tre gange som beskrevet i det foregående trin (Se trin 2.3.2).
    4. Fortynd BlaP-cAb-Lys3 løsning til 20 µg/mL i bindende løsning (Se trin 2.1.3) og anvende en 15 µL dråbe af denne fortyndede opløsning på elektroderne. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Efter antigen-nanobody reaktion, vaskes tre gange som beskrevet i det forrige trin ved hjælp af Vaskeopløsningen (Se trin 2.1.4). Skyl derefter elektroden en gang med PBS (Se trin 2.1.1).
    5. Til påvisning, stik sensor chippen via den kobber-kredsløb del til en digital multimeter. Derefter indlede sensor svar ved at anvende en 50 µL dråbe påvisning løsning (Se trin 2.1.7) på de positive elektroder og anvende en 50 µL dråbe af NaCl 5 mM løsning på de negative elektroder (Se trin 2.1.7). Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur. Overvåge ledningsevne med et digital multimeter.
      Bemærk: Multimeter blev leveret af Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus og Prof. Y. Glupczynski (katolske universitet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Denne potentiostat er computer-kontrolleret via en USB-port og analyserer i otte forskellige chips af sensoren samtidigt. Softwaren lavet af Yunus og kolleger17 skaber en real-time plot, der repræsenterer målinger af ledningsevne forskellen mellem reference- og prøveopløsningerne elektroderne mod tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design og konstruktion af den kimære protein BlaP-cAb-Lys3

Figur 1 repræsenterer indsættelse af cAb-Lys3 i en eftergivende loop af BalP klasse A β-lactamase fra Bacillus licheniformis. Indsættelse blev udført mellem rester Asp198 og Lys199. En thrombin kavalergang websted blev indført på hver side af førerhuset-Lys3. Celler forvandlet med en konstitutiv udtryk plasmid kodning BlaP-cAb-Lys3 kimære protein var i stand til at vokse ved tilstedeværelse af en lille koncentration af ampicillin. Dette resultat angiver, at hybrid β-lactamase er opløselige, korrekt foldet og med held kan udskilles i den periplasmic plads af bakterier, hvor det kan effektivt give modstand mod ampicillin. Yderligere analyserede vi bifunctionality vores kimære protein. Som rapporteret i vores tidligere undersøgelser, viste vores data, at β-lactamase samt cAb-Lys3 fraspaltning af kimære protein beholdt deres biologiske aktiviteter15.

Conductimetric biosensor assay

Sensoren chips anvendes til denne analyse er vist i figur 2. Sensorer bruges til disse eksperimenter indeholder 8 chips. Hver chip omfatter tre elektroder: en arbejder elektrode, én Counter elektrode og en referenceelektrode. Disse 8 chips er organiseret som 4 par i sensoren. For hvert par, en af chipsene mærket "-" svarer til en negativ kontrol, mens chippen mærket "+" svarer til den analyserede prøve.

Figur 3 repræsenterer den skematiske beskrivelse af opsætningen af eksperimenterende bruges i dette arbejde, der kombinerer hybrid β-lactamase teknologi til en potentiometrisk biosensor. I denne opsætning, to elektroder anvendes: i) en referenceelektrode og ii) en polyaniline (PANI) belagt elektrode. HEWL er adsorberet på PANI belagt elektrode, som rapporteret i andre undersøgelser18,19. Efter passende vasker, BlaP-cAb-Lys3 (for "+" mærket chips) eller BlaP uden indsatte nanobody (for "-" mærket chips) anvendes på elektroderne. Efter tilsætning af β-lactam (benzylpenicillin) på elektroderne måles ændringer i elektrode ledningsevne. Faktisk, β-lactam hydrolyse af β-lactamaser genererer en frigivelse af protoner; der var vist sig at skabe betydelige ændringer i elektrode konduktans med en meget kort svartid. Biosensor assays præsenteret i figur 4 viser, at bindingen af BlaP-cAb-lys3 til HEWL immobiliseret på PANI elektrode kan registreres og overvåges ved at måle den proton udgivelse som følge af immobiliserede β-lactamase aktivitet. Derimod var ingen ledningsevne forskel opdaget Når eksperimentet blev udført med BlaP uden nogen indsatte nanobody.

Figure 1
Figur 1: ordningen repræsenterer kimære protein BlaP-cAb-Lys3 interagerer med HEWL. BlaP er vist i cyan, cAb-Lys3 i orange og HEWL i blå. Dette tal blev opnået ved at kombinere BlaP tridimensional strukturer (FBF-ID: 4BLM) og cAb-Lys3/HEWL-komplekset (FBF-ID: 1MEL). Β-lactamase indeholder 2 domæner: domænet α/β og α-domæne, det katalytiske site er placeret på grænsefladen mellem både domæner. Løkken bruges til indsættelsen er fremhævet med gult og placeret i et opløsningsmiddel-eksponerede loop i domænet α. N - og C-terminale dele af cAb-Lys3 er vist med rødt. CDR3 loop af cAb-Lys3 gør de fleste af kontakter med HEWL katalytiske site. Bindingen af cAB-Lys3 at HEWL hæmmer den enzymatiske aktivitet. Denne figur og resultaterne præsenteres heri er blevet offentliggjort i vores tidligere arbejde15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: billede af den sensor, der anvendes i forsøget. Hver sensor omfatter en gruppe af 8 individuelle chips. På hver chip, der er tre elektroder: en arbejder elektrode, en referenceelektrode og en counter ion elektrode. Den kobbertækkede del er sluttet til en digital multimeter tilsluttet en computer. De enkelte chips er organiseret som 4 par hvor den "-" mærket chips er negativ kontrol elektroder og den "+" mærket chips er prøven elektroder. Denne konfiguration giver mulighed for forskellige eksperimentelle replikater eller HEWL / β-lactamase koncentrationer skal testes samtidigt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk fremstilling af eksperimentel opsætning bruges i vores biosensor assay. HEWL var usejldygtigt på en PANI (polyaniline)-coatede elektrode. Den kimære protein BlaP-cAb-Lys3 blev derefter påføres på elektroden. Immobiliseret β-lactamase aktivitet, som bestemmes ved at måle udgivelsen af protoner induceret ved hydrolyse af benzylpenicillin, er direkte proportional med samspillet mellem HEWL og de kimære protein. Proton release inducerer elektrisk konduktans ændringer, der er konverteret til et signal, der kan fortolkes af brugeren. Udviklingen af den ledningsevne forskellen mellem PANI belagt og referenceelektrode som funktion af tiden. Denne figur og resultaterne præsenteres heri er blevet offentliggjort i vores tidligere arbejde15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: grafisk repræsentation af den conductimetric målinger viser et specifikt samspil mellem BlaP-cAb-Lys3 til HEWL. Tilsætning af benzylpenicillin er angivet med en pil. Denne potentielle forskel resultater fra proton frigivelse indtræder efter antibiotika hydrolyse. Målingerne blev udført med hybrid protein BlaP-cAb-Lys3 (rød) og indfødte β-lactamase BlaP uden nogen indsatte nanobody (blå), som en negativ kontrol. De forskellige kurver repræsenterer uafhængige målinger udført på forskellige chips. Denne figur og resultaterne præsenteres heri er blevet offentliggjort i vores tidligere arbejde15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde præsenterer vi en metode til at functionalize en nanobody ved hjælp af BlaP β-lactamase som en transportør protein og vi viser, at vi med succes kan gennemføre de resulterende hybrid protein i en potentiometrisk sensor assay. Den vigtigste nyskabelse aspekt af vores arbejde i forhold til andre biosensor assays er den kovalente kobling af antistof del til den enzymatiske aktivitet, der genererer det elektriske signal. Denne såkaldte protein indsættelse teknologi præsenterer fordele og begrænsninger, der vil være det vigtigste fokus i dette afsnit.

Fordele ved hybrid β-lactamase teknologi.

Β-lactamaser er effektive enzymer
En af de vigtigste parametre, der påvirker følsomheden og signal / støj-forhold af en biosensor er den enzymatiske aktivitet bruges til at generere signal. I denne sammenhæng, β-lactamaser præsentere flere fordele: de er små (≈29 kDa), monomere, meget stabil, og mere vigtigere, udstiller høj specifik aktivitet og høj omsætning i forhold til andre enzymer, der anvendes i potentiometrisk sensor assays såsom glucose oxidase, urease, lipase, peroxidase eller alkalisk fosfatase20. Af alle disse grunde er β-lactamaser enzymer valg for forskellige biosensor assays.

Direkte indsættelse i β-lactamase kan forbedre produktionen udbytte og stabilitet af de indsatte protein/domæne.
En af de begrænsende aspekter af mange immunosensor assays er kvalitet (f.eks. stabilitet, renhed) af antistoffet anvendes til at påvise analysanden2. I øjeblikket, lave omkostninger produktionssystemer af antistoffer eller antistof fragmenter (fx E. coli) forbliver udfordrende og fører ofte til aggregerede proteiner med dårlig opløselighed og stabilitet21. Vores hybrid β-lactamase teknologi synes at være en god metode til at overvinde disse vanskeligheder, da vi tidligere viste, at denne strategi forbedrer udtryk udbytte og stabiliteten af de indsatte protein domæner14. Især i den nuværende undersøgelse, ved hjælp af vores hybridsystem β-lactamase var kimære proteinet opkaldt BlaP-cAb-Lys3 med held udtrykt i E. coli med et godt udbytte (≈10 mg ren protein pr. liter kultur) og renset til ensartethed.

Kovalente kobling mellem antistof og enzymatiske fraspaltning gør billigere og hurtigere sensor assays
I konventionelle immunosensors kræver påvisning af analysanden, der udnyttelsen af primære antistoffer, der er immobiliseret på sensor-chip. Senere, er en sekundær antistof, der er koblet til et enzym eller en mærket sonde også forpligtet til at generere en målbar signal. Denne fremgangsmåde indebærer flere inkubationer og vask skridt og derfor kan være tidskrævende. Denne protokol er derudover dyrt, da flere antistoffer er påkrævet og kovalente kobling mellem den sekundær antistof og en enzym/sonden er også nødvendige. I modsætning hertil vores system kun bruger en hybrid protein til at detektere og kvantificere analysanden, og giver derfor mulighed for real-time overvågning uden brug af sekundære antistoffer.

Derudover er det vigtigt at bemærke, at domænet indsættelse i klassen en β-lactamaser blev vist til at generere hybrid proteiner udviser allosteriske switch-lignende opførsel22,23. Sådanne kontakter kunne finde talrige anvendelsesmuligheder i biosensor-baserede assays.

Begrænsninger af β-lactamase Hybridteknologien.

Begrænsninger induceret af protein engineering.
I dette system er den største vanskelighed at designe og få en hybrid protein ved at indsætte antistof gruppe i β-lactamase. Denne resulterende kimære protein skal være bifunctional: den enzymatiske gruppe skal forblive købedygtig effektivt hydrolyserer β-lactam antibiotika for at generere det elektriske signal, der henviser til, at antistof gruppe skal binde til målrettede analysanden med høj affinitet og specificitet. For at opnå bifunctional kimære proteiner, skal forskellige parametre overvejes for at undgå sterisk begrænsninger. Den første kritiske punkt er placeringen af indsættelsesstedet. Selv om det har vist sig at flere indsættelse punkter er muligt24,25,udsat26, indsættelse positioner er ofte placeret i opløsningsmiddel sløjfer langt væk fra det aktive sted hos luftfartsselskabet protein. Dette minimerer potentielle konformationelle ændringer eller sterisk hindring induceret af den indsatte protein. Af samme årsager anbefales det også at det aktive sted hos den indsatte protein placeres langt væk fra indsættelsesstedet for at forhindre ændringer af sin aktivitet. Endelig, indsættelse af proteiner, der præsenterer fleksibel eller tilgrænsende N - og C-terminale ekstremiteter vil være bedre tolereret. Faktisk kan fjernt og stive ekstremiteter pålægge sterisk begrænsninger på begge partnere af den kimære protein, og dermed ændre deres respektive biologiske aktiviteter. Derfor er det vigtigt at nævne, at størrelsen af den indsatte protein har kun ringe indflydelse på det resulterende kimære protein. Ja, det har vist sig at store struktureret domæner kan være indsat korrekt i β-laktamaser, så længe deres N - og C-terminale ekstremiteter er fleksible eller tæt på hinanden13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. i den foreliggende undersøgelse, indsættelsesstedet i BlaP ligger langt væk fra dets aktive site og de indsatte nanobody har forholdsvis lange og fleksible ekstremiteter (ikke synlig i en X-ray struktur), der ligger langt væk fra paratope. Disse specifikke funktioner sikrer, at minimal sterisk begrænsninger er pålagt de biologisk aktive overflader af begge partnere hybrid protein. Men når den indsatte protein ikke udgør de anbefalede kriterier for optimal indsættelse i et luftfartsselskab protein, det er muligt at ingeniør linker regioner for at sænke potentielle sterisk begrænsninger. Faktisk var tilstedeværelsen af en fleksibel linker (fx Gly-Ser gentagelser) til at forbinde luftfartsselskabet og de indsatte protein vist dramatisk øge tolerance over for indsættelse af store og struktureret proteiner i et luftfartsselskab, en30 ,12.

Begrænsningerne for elektrokemiske biosensorer.
Selv om udviklingen af elektrokemiske/potentiometrisk biosensorer er blevet en stadigt voksende område, har disse assays vigtige begrænsninger, der skal overvejes, når du udformer biosensor eksperiment. Første, alle biosensorer, der involverer H+ frigivelse eller optagelse kræver brug af meget svagt bufferet løsninger (dvs. < 5 mM)31 for at måle signifikante potentielle forskelle. PH variation induceret ved H+ udgivelse kan påvirke protein egenskaber og enzymatisk aktivitet bruges til at generere signal. For det andet, pH og ioniske styrke i biofluids kan variere betydeligt og derfor resultere i store forskelle i reaktion og øge baggrundsstøj af biosensorer32. Dette er grunden, forskellige forskergrupper har forsøgt at udvikle nanoteknologi for at formindske størrelsen af elektrokemisk sensor elementer for at øge signal-støj-forholdet for de processer, der forekommer på grænsefladen af enheden33, 34 , 35. som følge heraf er det også muligt at udvikle antistof molekyler mærket med flere molekyler af samme enzym til at øge signalet som følge af binding af et molekyle til dens mål32. Men på trods af disse begrænsninger, conductometric/biosensorer fortsat yderst effektive og følsomme enheder med anslåede påvisningsgrænser (LODs) i rækken af 10-8 -10-11 M36.

I denne undersøgelse, har vi vist at vi med succes kan indsætte en nanobody, der er rettet mod HEWL i en klasse A β-lactamase opkaldt BlaP, og at den genererede hybrid protein bevarer både biologiske aktiviteter: i) tight bindende HEWL og ii) kapacitet til hydrolyserer Β-lactam antibiotika. Denne undersøgelse udgør en proof of concept for indsættelse af forskellige nanobodies eller antistof fragmenter ind BlaP og gennemførelsen af denne hybrid protein teknologi i potentiometrisk sensor assays. Denne teknologi kan potentielt bruges til at registrere forskellige protein epitoper og implementeret i talrige diagnostiske værktøjer. Faktisk udvikling og effektiv anvendelse af disse analyser er blevet afgørende for vores samfund og er hovedsagelig drevet af sociale og økonomiske behov for billig og nem at betjene teknologier på forskellige områder som fødevarer og sundhedssystemerne, især i udviklingslandene. Derudover spiller nanoteknologi en stigende rolle i udvikling af disse sensorer. Signal behandling teknologier er i dag tilgængelig på bærbare enheder såsom smartphones og tabletter og forskellige smartphone programmer allerede findes for signalbehandling37. For eksempel for nylig, er en potentiometrisk sensor enhed blevet integreret i en smartphone at give glukose koncentration overvågning38. Sundhedseksperter er overbeviste om, at disse slags innovative enheder vil blive vigtigere sundhed løsninger i de kommende år39,40.

Afslutningsvis, repræsenterer dette arbejde et eksempel, der viser potentiale og fordelene ved vores protein indsættelse teknologi. Vi håber, at dette arbejde vil bidrage til at udvikle innovative og nyttige teknologier til forskning og medicinske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender det vallonske Region i Belgien inden for rammerne af forskningsprojekterne, SENSOTEM og NANOTIC samt den nationale midler For den videnskabelige forskning (F.R.S.-F.N.R.S) for deres finansielle støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
KH2PO4 Sigma-Aldricht V000225 
K2HPO4 Sigma-Aldricht 1551128
NaCl Sigma-Aldricht S7653
Tris–HCl Roche 10812846001
EDTA  Sigma-Aldricht E9884
KCl Sigma-Aldricht P9541
Na2HPO4  Sigma-Aldricht NIST2186II
2-mercaptoethanol Sigma-Aldricht M6250
alanine Sigma-Aldricht A7627
HClO4 Fluka 34288 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate Sigma-Aldricht 22090
benzylpenicillin sodium Sigma-Aldricht B0900000
hen egg white lysozyme Roche 10837059001
heptane Sigma-Aldricht 246654
methanol Sigma-Aldricht 322415
ammonium hydroxide solution Sigma-Aldricht 380539 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate  Greiner Bio-One 657165 CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter WTW 1AA110 Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration system Nalgene NALG300-4100 Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chips manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab Metrohm Autolab discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22M Gossen Metrawatt discontinued, successor Metrahit Base

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
  2. Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
  3. Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
  4. Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
  5. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  6. Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
  7. Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
  8. Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
  9. Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
  10. Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
  11. Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
  12. Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
  13. Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
  14. Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
  15. Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
  16. Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
  17. Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
  18. Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
  19. Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
  20. Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
  21. Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
  22. Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
  23. Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
  24. Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
  25. Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
  26. Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
  27. Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
  28. Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
  29. Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
  30. Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
  31. Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
  32. D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
  33. Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
  34. Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
  35. Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
  36. Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
  37. Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
  38. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
  39. Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
  40. Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).

Tags

Bioteknologi sag 132 β-lactamase hybrid protein teknologi (BHP) conductimetric biosensor nanobodies molekylære interaktioner Lysozym
Brug af en β-lactamase-baseret Conductimetric Biosensor Assay til påvisning Biomolekylær interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vandevenne, M., Dondelinger, M.,… More

Vandevenne, M., Dondelinger, M., Yunus, S., Freischels, A., Freischels, R., Crasson, O., Rhazi, N., Bogaerts, P., Galleni, M., Filée, P. The Use of a β-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions. J. Vis. Exp. (132), e55414, doi:10.3791/55414 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter