Summary
I detta arbete rapporterar vi en ny metod att studera protein-protein interaktioner med hjälp av en conductimetric biosensor baserat på β-laktamas hybridtekniken. Denna metod förlitar sig på release av protons vid hydrolys av β-laktamer.
Abstract
Biosensorer blir alltmer viktigt och genomförs inom olika områden såsom upptäckt av patogen, Molekylärbiologisk diagnostik, miljöövervakning och säkerhet livsmedelskontroll. I detta sammanhang använde vi β-laktamaser som effektiv reporter enzymer i flera protein-protein interaktionsstudier. Dessutom, deras förmåga att acceptera införanden av peptider eller strukturerad proteiner/domäner starkt uppmuntrar användningen av dessa enzymer att generera chimära proteiner. I en färsk studie, vi förde in en enskild domän antikropp fragment i den Bacillus licheniformis BlaP β-laktamas. Dessa små domäner, även kallad nanobodies, definieras som antigen-bindande domänerna av enda kedja antikroppar från kameldjur. Som vanligt dubbel kedja antikroppar visar de hög tillhörighet och särdrag för sina mål. Det resulterande chimära proteinet uppvisade en hög affinitet mot sitt mål bibehållen aktiviteten β-laktamas. Detta tyder på att nanobody och β-laktamas beståndsdelarna förblir funktionella. I detta arbete rapporterar vi ett detaljerat protokoll som kombinerar vår β-laktamas hybridsystem biosensor-tekniken. Den specifika bindningen av nanobody till sitt mål kan upptäckas tack vare en conductimetric mätning av protonsna utgivet den katalytiska aktiviteten av enzymet.
Introduction
Biosensorer är analytiska enheter som kombinerar en bio-molekylär interaktion med fysikalisk eller kemisk signalering enheter avses som givare1. De inspelade signalerna kan sedan tolkas och konverteras för att övervaka samspelet mellan de immobiliserade och fri partnerna. De flesta av biosensorer innebär användning av en antikropp att upptäcka analyter såsom hormoner eller annan patogen markörer2. Olika sensorformat kan användas och inkluderar massa-baserade, magnetiska, optisk eller elektrokemisk biosensorer. Den senare är bland de vanligaste används sensorer, och fungerar genom att omvandla en bindande händelse till en elektrisk signal. Framföranden och känslighet för alla antikroppsbaserade biosensorer är starkt beroende av i huvudsak två parametrar: i) kvaliteten på antikroppen och ii) det system som används för att generera den signal2egenskaper.
Antikroppar är högmolekylära massa dimeriskt proteiner (150 – 160 kDa) som består av två tunga kedjor och två lätta kedjor. Samspelet mellan lätta och tunga kedjorna är mestadels stabiliseras av hydrofoba interaktioner samt en bevarade disulfide bond. Varje kedja innehåller en variabel domän som interagerar med antigenet i huvudsak via tre hypervariabel regioner heter kompletterande regioner (CDR1-2-3). Trots många framsteg inom fältet, storskaliga uttrycket av fullängds antikroppar med låg kostnad uttryck system (t.ex., E. coli) leder ofta till produktionen av instabil och aggregerade proteiner. Det är därför olika antikroppsfragment har konstruerats som singel-kedjan variabel fragment3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består av de variabla domänerna i respektive en tung och en lätta kedjor som är kovalent länkade med en syntetisk aminosyrasekvens. Men dessa fragment ofta visa en dålig stabilitet och har en tendens att aggregera eftersom de utsätter en stor del av sina hydrofoba regioner med lösningsmedel4. I detta sammanhang verkar enda kedja-kameldjur antikroppsfragment, kallad nanobodies eller VHHs, vara utmärkt alternativ till ScFvs. Dessa domäner motsvarar de variabla domänerna av kameldjur singel-kedjan antikroppar. Till skillnad från konventionella antikroppar, kameldjur antikroppar saknar lätta kedjor och endast innehålla två tunga kedjor5. Nanobodies är därför de minsta monomer antikroppsfragment (12 kDa) kan binda till antigen med en affinitet som liknar konventionella antikroppar6. De presenterar dessutom förbättrad stabilitet och löslighet jämfört med andra fullängds antikroppar eller antikroppsfragment. Slutligen, deras små storlekar och deras utökade CDR3 loopar tillåta dem att erkänna kryptiska epitoper och binder till enzymet aktiva platser7,8. Numera kan dessa domäner får stor uppmärksamhet och har kombinerats till biosensor tekniken. Till exempel Huang et al. har utvecklat en nanobody-baserade biosensor för påvisande och kvantifiering av humant prostataspecifikt antigen (PSA)9.
Som nämnts ovan är en viktig parameter i biosensor analyser effektiviteten i de system som används för att generera en elektrisk signal. Av denna anledning enzym-baserade elektrokemiska biosensorer har uppmärksammats alltmer och har använts allmänt för olika applikationer såsom hälsovård, livsmedelssäkerhet och miljöövervakning. Dessa biosensorer lita på katalytisk hydrolys av ett substrat av ett enzym att generera en elektrisk signal. I detta sammanhang visade β-laktamaser sig vara mer specifik, känslig och lättare att genomföra experimentellt än många andra enzymer såsom alkaliskt fosfatas eller pepparrotperoxidas10. Β-laktamaser är enzymer som ansvarar för bakteriell resistens mot β-laktamantibiotika av screening dem. De är monomer, mycket stabil, effektiv, och för liten storlek. Dessutom genererar domän/peptid infogningar i β-laktamaser bi-funktionella chimära proteiner som visade sig vara effektiva verktyg att studera protein-ligand interaktioner. Faktiskt, nya studier har visat att införandet av variabel antikroppsfragment i TEM1 β-laktamas resultaten i en chimär protein som återstår kan binda med hög affinitet till dess målet antigen. Intressant, visades antigen bindningen att inducera Alloster reglering av TEM1 katalytisk aktivitet11,12. Dessutom visade vi i flera studier att protein domän införande i en tillåtande loop av Bacillus licheniformis BlaP β-laktamas genererar funktionella chimära proteiner som är väl lämpade att övervaka protein-ligand interaktioner13 ,14. Vi har nyligen in en nanobody, heter cAb-Lys3, i denna tillåtande insticksstället BlaP15. Denna nanobody visades att binda till höna-ägg-vit lysozym (HEWL) och hämma dess enzymatiska aktivitet16. Vi visade att proteinet genererade hybrid, heter BlaP-cAb-Lys3, behöll en hög specificitet / affinitet mot HEWL medan aktiviteten β-laktamas förblev oförändrad. Sedan vi framgångsrikt kombinerat β-laktamas hybridtekniken till en elektrokemisk biosensor och visade att mängden genererat elektrisk signal var beroende av samspelet mellan BlaP-cAb-Lys3 och HEWL orörlig på en elektrod. Faktiskt, hydrolys av β-laktamantibiotika av BlaP inducerar en proton release som kan omvandlas till en kvantitativ elektrisk signal. Denna kombination av β-laktamas hybridtekniken med en elektrokemisk biosensor är kvantitativa, snabb, känslig, och tillåter realtid mätning av den genererade signalen. Denna metod beskrivs häri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein provberedning
- Producera och rena hybrid proteinet som rapporterats i vår tidigare studie15BlaP-cAb-Lys3. Lagra proteinet i 50 mM fosfatbuffert pH 7,4 med följande sammansättning: 8 g NaCl, 0,2 g av KCl, 1,44 g av Na2HPO4 och 0.24 g KH2PO4 upplöst i 800 mL destillerat vatten fixa pH i lösningen på 7,4 innan anpassa den slutliga volymen av lösningen till 1 sterilisera L. Filter protein lösningen.
- Bered en höna äggvita lysozym (HEWL) lager. Lös 100 mg (40 000 enheter/mg) kommersiellt tillgängliga HEWL i 10 mL av fosfat buffert saltlösning (PBS se steg 2.1.1). Sterilisera protein lösningen genom filtrering med filter med en 0,22 μm cutoff.
2. biosensor analyser
-
Lösning och buffert förberedelse
- Förbereda 50 mM PBS genom upplösning 8 g NaCl, 0,2 g av KCl, 1,44 g av Na2HPO4och 0.24 g KH2PO4 i 800 mL destillerat vatten. Justera till pH 7,4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH innan du justerar volymen av lösningen till 1 L. Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C.
- Bered en mättnad/blockering genom att lösa upp 3 g kasein hydrolysat i 100 mL PBS som beretts enligt anvisningarna ovan (se steg 2.1.1). Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C.
- Bered en bindande genom upplösning 1 g kasein hydrolysat i 100 mL PBS som beretts enligt anvisningarna ovan (se steg 2.1.1). Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C.
- Bered en tvätt (0,1% Tween - PBS) genom att tillsätta 100 μL av Tween-20 (100%) i 100 mL PBS som beretts enligt anvisningarna ovan (se steg 2.1.1). Förvaras vid 4 ° C.
- Bered en elektrod förberedelse (1% Triton x-100-PBS) genom att tillsätta 1 mL Triton x-100 (100%) i 100 mL PBS som beretts enligt anvisningarna ovan (se steg 2.1.1). Förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda en elektrod regenerering lösning (3,5 M KCl) genom upplösning 26 g av KCl i destillerat vatten till en slutlig volym 100 mL. Filter som steriliseras och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda en 5 mM NaCl-lösning genom att lösa 0,29 g NaCl i destillerat vatten till en slutlig volym av 1 L. Filter sterilisera och förvara vid 4 ° C. Sedan, Bered en upptäckt (4 mM bensylpenicillin) genom att lösa upp 26,7 mg bensylpenicillin i 20 mL 5 mM NaCl-lösning. Filter sterilisera och förvara vid-20 ° C.
-
Sensor förberedelse och förnyelse
Obs: Polyaniline belagd sensorn chips utvecklades och vänligen tillhandahållen av Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus och Prof. Y. Glupczynski's (katolska universitetet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Beskrivningen av sensorn samt protokollen polyaniline electro-polymerisation används att syntetisera dessa sensorer är detaljerad i sin tidigare arbete17. Kort, använder detta system re-usable sensorer av åtta enskilda marker som tillverkades av klassiskt printed circuit board (PCB) tekniker. Enskilda marker består av tre elektrod runda fläckar. Överst är arbetselektroden på vilka polyaniline var electro-syntetiseras. Mittersta är referenselektroden och botten elektroden utgör counter elektroden. Både, referens och counter elektroderna är functionalized använder solid Ag/Granulatfyllda amalgam ovanpå det kol lagret.- Utför 3 tvättar av elektroder genom att doppa spetsarna i brunnar i en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL per brunn elektrod förberedelse lösning (1% Triton x-100-PBS, se steg 2.1.5.). Utför varje tvätt för 2 min med mild blandning vid rumstemperatur.
- Skölj elektroderna genom att doppa spetsarna i brunnar i en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL per brunn destillerat vatten i 2 min med mild blandning vid rumstemperatur.
- Regenerera elektroderna genom att doppa spetsarna i brunnar i en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL per brunn regenerering lösning (3.5 M KCl, se steg 2.1.6) övernattning på 4 ° C eller 1 h i rumstemperatur.
- Utför 3 tvättar av elektroder genom att doppa spetsarna i brunnar i en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL per brunn fosfat buffert koksaltlösning (se steg 2.1.1.). Utför varje tvätt i 2 minuter med mild blandning vid rumstemperatur.
-
Bindande assay utförs på sensorn
- Kappa HEWL på PANI (polyaniline) ytan av elektroden genom att deponera en 15 µL droppe 40 µg/mL HEWL beredd i PBS på elektrod ytan. Inkubera över natten vid 4 ° C eller 1 timme vid rumstemperatur.
- Utföra tre tvättar av elektroderna med fosfat buffert saltlösning (se steg 2.1.1) genom att doppa de elektrod delarna av sensorn chips i brunnar i en plattan med 96 brunnar innehållande 300 µL per brunn fosfat buffert koksaltlösning. Utför varje tvätt för 2 min med mild blandning vid rumstemperatur.
- Mätta elektroderna genom att lägga till en droppe 50 µL blockerande lösningen (se steg 2.1.2) på elektrod ytan. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Sedan tvätta tre gånger som beskrivs i föregående steg (se steg 2.3.2).
- Späd BlaP-cAb-Lys3 lösningen till 20 µg/mL i bindande lösning (se steg 2.1.3) och applicera en droppe 15 µL utspädda lösningen på elektroderna. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter antigen-nanobody reaktion, tvätta tre gånger som beskrivs i föregående steg med tvättlösningen (se steg 2.1.4). Skölj sedan elektroden en gång med PBS (se steg 2.1.1).
- För detektering, Anslut sensorn chip via koppar-kretsar delen till en digital multimeter. Sedan initiera sensor svaret genom att tillämpa en 50 µL droppe upptäckt lösning (se steg 2.1.7) på de positiva elektroderna och tillämpa en 50 µL droppe NaCl 5 mM lösning på negativa elektroderna (se steg 2.1.7). Inkubera i 30 min i rumstemperatur. Övervaka konduktans med en digital multimeter.
Obs: Multimeterns tillhandahölls av Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus och Prof. Y. Glupczynski's (katolska universitetet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Detta potentiostat är datorstyrda via en USB-port och analyserar i åtta olika flisor av sensorn samtidigt. Den programvara som skapats av Yunus och kollegor17 skapar en realtid tomt som representerar mätningar av konduktans skillnaden mellan referens och prov elektroderna mot tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design och konstruktion av proteinet chimära BlaP-cAb-Lys3
Figur 1 representerar införandet av cAb-Lys3 i en tillåtande slinga av BalP klass A β-laktamas från Bacillus licheniformis. Insättningspunkten utfördes mellan rester Asp198 och Lys199. En trombin klyvning webbplats introducerades på varje sida av cAb-Lys3. Celler omvandlas med en konstitutiva uttryck plasmid kodning BlaP-cAb-Lys3 chimära proteinet kunde växa i närvaro av en liten koncentration av ampicillin. Detta resultat visar att den hybrid β-laktamas är lösliga, korrekt hopfälld och kan framgångsrikt utsöndras in i periplasmic av bakterier där det effektivt kan ge resistens mot ampicillin. Vi analyserade vidare bifunctionality av våra chimära protein. Som rapporterats i våra tidigare studier, visade våra data att de β-laktamas samt de cAb-Lys3 beståndsdelarna av proteinet chimära behållit deras biologiska aktiviteter15.
Conductimetric biosensor assay
Sensorn chips som används för denna analys visas i figur 2. Sensorerna används för dessa experiment innehålla 8 marker. Varje chip innehåller tre elektroder: en arbetselektroden, en Counter elektrod och en referenselektrod. Dessa 8 marker är organiserade som 4 par i sensorn. För varje par, en av markerna märkt ”-” motsvarar en negativ kontroll, medan chip märkt ”+” motsvarar testade provet.
Figur 3 representerar en Schematisk beskrivning av de experiment som används i detta arbete som kombinerar β-laktamas hybridtekniken till en potentiometrisk biosensor. I den här installationen används två elektroder: i) en referenselektrod och ii) en polyaniline (PANI) belagd elektrod. HEWL är adsorberat på PANI belagda elektroden som rapporterats i andra studier18,19. Efter adekvat tvättar, BlaP-cAb-Lys3 (för ”+” märkt marker) eller BlaP utan infogade nanobody (för ”-” märkt marker) tillämpas på elektroderna. Efter tillägg av β-laktam (bensylpenicillin) på elektroderna, förändringar i elektroden konduktans mäts. Faktiskt, β-laktam hydrolys av β-laktamaser genererar en release av protons; där visades att skapa betydande förändringar i elektroden konduktans med en mycket kort svarstid. Biosensor analyserna presenteras i figur 4 visar att bindningen av BlaP-cAb-lys3 till HEWL orörlig på PANI elektroden kan identifieras och övervakas genom att mäta proton utsläpp som härrör från aktiviteten immobiliserade β-laktamas. Däremot upptäcktes ingen konduktans skillnad när experimentet utfördes med BlaP utan någon insatt nanobody.
Figur 1: system som representerar den chimära protein BlaP-cAb-Lys3 interagerar med HEWL. BlaP visas i cyan, cAb-Lys3 i orange och HEWL i blått. Denna siffra har erhållits genom att kombinera BlaP tredimensionella strukturer (PDB-ID: 4BLM) och cAb-Lys3/HEWL-komplexet (PDB-ID: 1MEL). De β-laktamas innehåller 2 domäner: α/β domänen och domänen som α, katalytisk platsen ligger i gränssnittet mellan båda domänerna. Loopen används för införande är gulmarkerat och ligger i en vätska-exponerade slinga i domänen α. N - och C-terminal delarna av cAb-Lys3 visas i rött. CDR3 slingan av cAb-Lys3 gör de flesta av kontakterna med HEWL katalytiska site. Bindningen av cAB-Lys3 till HEWL hämmar dess enzymatiska aktivitet. Denna siffra och de resultat som presenteras häri har publicerats i vårt tidigare arbete15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bilden av sensorn som används i experimentet. Varje sensor ingår en grupp 8 enskilda marker. På varje chip, finns det tre elektroder: en arbetselektroden, en referenselektrod och en counter ion elektrod. Den koppar täckta delen är ansluten till en digital multimeter som ansluten till en dator. De enskilda markerna är organiserade som 4 par där de ”-” märkt flisen negativ kontroll elektroder och ”+” märkt flisen prov elektroderna. Denna inställning tillåter olika experimentella replikat eller HEWL / β-laktamas koncentrationer skall provas samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk bild av de experiment som används i våra biosensor assay. HEWL var orörlig på en PANI (polyaniline) belagd elektrod. Chimära proteinet BlaP-cAb-Lys3 tillämpades sedan på elektroden. Immobiliserade β-laktamas aktiviteten, som bestäms genom att mäta utsläpp av protoner som induceras genom hydrolys av bensylpenicillin, är direkt proportionell mot samspelet mellan HEWL och chimära proteinet. Proton utgivningen inducerar elektrisk konduktans förändringar som konverteras till en signal som kan tolkas av användaren. Utvecklingen av skillnaden mellan den PANI belagda och referenselektroden konduktans som funktion av tiden. Denna siffra och de resultat som presenteras häri har publicerats i vårt tidigare arbete15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: grafisk representation av den conductimetric mätningar visar specifik växelverkan av BlaP-cAb-Lys3 till HEWL. Tillägg av bensylpenicillin indikeras av en pil. Denna potentiella skillnad resulterar från proton release inträffar vid antibiotika hydrolys. Mätningarna utfördes med proteinet hybrid BlaP-cAb-Lys3 (röd) och infödda β-laktamas BlaP utan någon insatt nanobody (blå), som en negativ kontroll. De olika kurvorna representerar oberoende mätningar utförs på olika marker. Denna siffra och de resultat som presenteras häri har publicerats i vårt tidigare arbete15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete vi presenterar en metod för att functionalize en nanobody med den BlaP β-laktamas som ett carrier protein och vi visar att vi framgångsrikt kan genomföra det resulterande hybrid proteinet i en potentiometrisk sensor-analys. Den viktigaste nyheten aspekten av vårt arbete jämfört med andra biosensor analyser är kovalent kopplingen å antikropp till enzymatisk aktivitet som genererar elektriska signalen. Denna så kallade protein införande teknik presenterar fördelar och begränsningar som kommer att vara i fokus för detta avsnitt.
Fördelar med β-laktamas hybridtekniken.
Β-laktamaser är effektiv enzymer
En av de viktigaste parametrarna som påverkar känslighet och signal-brus-förhållande av en biosensor är den enzymatiska aktiviteten används för att generera signalen. I detta sammanhang β-laktamaser presentera flera fördelar: de är små (≈29 kDa), monomer, mycket stabil och mer viktigt, uppvisar hög specifik aktivitet och hög omsättning jämfört med andra enzymer som används i potentiometrisk sensor analyser såsom glukos oxidas, ureas, lipas, peroxidas eller alkaliskt fosfatas20. Av alla dessa skäl är β-laktamaser enzymer av val för olika biosensor analyser.
Direkt insättning i de β-laktamas kan förbättra produktion kapacitet och stabilitet på den Infoga protein/domänen.
En av de begränsande aspekterna av många immunosensor analyser är kvaliteten (stabilitet, renhet) av antikropp används för att upptäcka den analyt2. För närvarande, låg kostnad produktionssystem av antikroppar eller antikroppsfragment (t.ex. E. coli) förblir utmanande och ofta leder till aggregerade proteiner med dålig löslighet och stabilitet21. Vår hybridteknik för β-laktamas verkar vara en bra strategi för att övervinna dessa svårigheter eftersom vi tidigare visade att denna strategi förbättrar uttryck avkastningen och stabiliteten i den Infoga protein domäner14. I synnerhet i den aktuella studien, använda våra hybridsystem β-laktamas chimära proteinet heter BlaP-cAb-Lys3 framgångsrikt uttryckt i E. coli med en mycket bra avkastning (≈10 mg rent protein per liter kultur) och renas till homogenitet.
Kovalent koppling mellan antikroppar och enzymatisk beståndsdelarna gör billigare och snabbare sensor analyser
I konventionella immunosensors kräver påvisande av analyten utilizationen av primära antikroppar som är orörlig på sensorn chip. Därefter krävs en sekundär antikropp som är kopplat till ett enzym eller en sond med märkta också för att generera en mätbar signal. Detta tillvägagångssätt innebär flera inkubationer och tvätt steg och därför kan vara tidskrävande. Detta protokoll är dessutom dyra eftersom flera antikroppar krävs och kovalenta koppling mellan den sekundära antikroppen och ett enzym/sond är också nödvändigt. Däremot vårt system använder bara ett hybrid-protein för att påvisa och kvantifiera analyten och därför tillåter realtid övervakning utan användning av sekundära antikroppar.
Dessutom är det viktigt att notera att domänen införande i klass en β-laktamaser visades att generera hybrid proteiner uppvisar Alloster switch-liknande beteende22,23. Sådana växlar kunde hitta många tillämpningar i biosensor-baserade analyser.
Begränsningar av β-laktamas hybridtekniken.
Begränsningar som induceras av proteinteknik.
I detta system är den största svårigheten att utforma och få en hybrid protein genom att infoga den antikropp biexponentiellt i de β-laktamas. Detta resulterande chimära protein måste vara bifunktionell: den enzymatiska biexponentiellt måste förbli kunna effektivt hydrolysera β-laktamantibiotika för att generera den elektriska signalen, medan den antikropp biexponentiellt måste binda till riktade analyten med hög affinitet och specificitet. För att erhålla bifunktionell chimära proteiner, måste olika parametrar övervägas för att undvika sterisk begränsningar. Den första kritiska punkten är placera av insticksstället. Trots det har visats att flera inmatningspunkterna är möjligt24,25,utsätts26, införande positioner ligger ofta i lösningsmedel slingor långt bort från den aktiva platsen av carrier protein. Detta minimerar potentiella konfirmerande förändringar eller sterisk hinder induceras av proteinet infogade. Av samma skäl rekommenderas det också att den aktiva platsen av infogade protein vara ligger långt bort från insticksstället för att förhindra förändringar av verksamheten. Införande av proteiner som presenterar flexibel eller angränsande N - och C-terminal extremiteter kommer slutligen tolereras bättre. Avlägsen och styva extremiteter kan faktiskt medför sterisk begränsningar för båda parter av proteinet chimär och därmed förändra deras respektive biologiska aktiviteter. Därför är det viktigt att nämna att storleken på det infogade proteinet har endast liten effekt på det resulterande chimära proteinet. Det har faktiskt visat att stora strukturerade domäner framgångsrikt kan infogas i β-laktamaser, så länge deras N - och C-terminal extremiteter är flexibla eller nära varandra13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. i den aktuella studien, insticksstället i BlaP ligger långt från dess aktiva platsen och den infogade nanobody har relativt lång och flexibel extremiteter (syns inte i strukturen röntgen) som är belägna långt från paratope. Dessa specifika funktioner säkerställa att minimal sterisk begränsningar åläggs de biologiskt aktiva ytorna av båda partners av proteinet hybrid. Dock när det infoga proteinet inte utgör de rekommendera kriterierna för optimal insättning i ett carrier protein, är det möjligt att ingenjör linker regioner för att minska potentiella sterisk begränsningar. Faktiskt, förekomsten av en flexibel länkare (e.g. Gly-Ser upprepningar) att ansluta transportören och infogade protein visades att dramatiskt öka toleransen mot införandet av stora och strukturerad proteiner i en bärare en30 ,12.
Inneboende till elektrokemiska begränsningarna biosensorer.
Även om utvecklingen av elektrokemisk/potentiometrisk biosensorer har blivit ett växande fält, har dessa analyser viktiga begränsningar som måste beaktas när man utformar biosensor experimentet. Första, alla biosensorer som involverar H+ release eller upptaget kräver användning av mycket svagt buffrade lösningar (dvs. < 5 mM)31 för att mäta betydande potentiella skillnader. PH variationen inducerad H+ med lanseringen kan påverka protein egenskaper och den enzymatiska aktiviteten används för att generera signalen. För det andra, pH och jonstyrka i kroppsvätskor kan variera kraftigt och följaktligen resultera i viktiga variationer i svaret och öka bakgrundsljud av biosensorer32. Det är därför, olika forskargrupper har försökt att utveckla nanoteknik för att minska storleken på elektrokemisk sensor element för att öka signal-brus-förhållandet för de processer som inträffar vid gränssnittet för den enheten33, 34 , 35. Följaktligen är det också möjligt att utveckla antikroppar molekyler märkta med flera molekyler av samma enzym att öka signalen som härrör från bindningen av en molekyl till dess mål32. Men trots dessa begränsningar förblir conductometric/biosensorer mycket effektiv och känsliga enheter med uppskattade gränsen för upptäckt (LODs) i intervallet 10-8 till 10-11 M36.
I denna studie har vi visat att vi framgångsrikt kan sätta in en nanobody som riktar sig mot HEWL i en klass A β-laktamas heter BlaP, och att proteinet genererade hybrid behåller båda biologiska aktiviteter: i) tight bindning av HEWL och ii) kapacitet att hydrolysera Β-laktamantibiotika. Denna studie utgör ett proof of concept för införande av olika nanobodies eller antikropp fragment i BlaP och genomförandet av detta protein hybridteknik potentiometrisk sensor analyser. Denna teknik kan potentiellt vara används för att upptäcka olika protein epitoper och implementerats i många diagnosverktyg. Faktiskt, utveckling och effektiv användning av sådana analyser har blivit avgörande i vårt samhälle och är i huvudsak driven av sociala och ekonomiska behov för billig och lätt att använda teknik i olika fält såsom mat- och hälsa, särskilt i utvecklingsländerna. Nanoteknik spelar dessutom en allt större roll i utvecklingen av sådana sensorer. Numera är signal processing teknik tillgänglig på bärbara enheter såsom smartphones och surfplattor och olika smartphone program redan finns för signalbehandling37. Till exempel nyligen, har en potentiometrisk sensor-enheten integrerats i en smartphone att tillåta glukos koncentration övervakning38. Hälsa experterna är övertygade om att dessa typ av innovativa enheter blir viktigare hälsolösningar i kommande år39,40.
Avslutningsvis utgör detta arbete ett exempel som visar potential och fördelarna med vår teknik för införande av protein. Vi hoppas att detta arbete kommer att bidra till att utveckla innovativa och användbara tekniker för forskning och medicinska ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Belgiens vallonska regionen inom ramen för de SENSOTEM och NANOTIC forskningsprojekt samt nationella medel för den vetenskapliga forskningen (F.R.S.-F.N.R.S) för deras ekonomiska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
