Summary
Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.
Abstract
Biosensores estão se tornando cada vez mais importante e implementadas em várias áreas tais como detecção de agentes patogénicos, diagnóstico molecular, monitoramento ambiental e controle de segurança de alimentos. Neste contexto, usamos β-lactamases como enzimas repórter eficiente em vários estudos de interação da proteína-proteína. Além disso, sua capacidade de aceitar inserções de peptídeos ou proteínas/domínios estruturados fortemente incentiva o uso destas enzimas para gerar proteínas quiméricas. Em um estudo recente, inserimos um fragmento de anticorpo de domínio único para o β-lactamases de Bacillus licheniformis BlaP. Estes domínios pequenos, também chamados de nanobodies, são definidos como domínios de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia única de camelídeos. Como comum anticorpos de cadeia dupla, eles mostram afinidades altas e especificidades para seus alvos. Proteínas quiméricas resultantes exibiram uma afinidade elevada contra seu destino mantendo a atividade de β-lactamase. Isto sugere que as partes nanobody e β-lactamases permanecem funcionais. No presente trabalho, relatamos um protocolo detalhado que combina o nosso sistema de β-lactamases de híbrido para a tecnologia biosensor. A vinculação específica da nanobody ao seu alvo pode ser detectada graças a uma medição titulometria dos prótons liberados pela atividade catalítica da enzima.
Introduction
Biosensores são dispositivos analíticos que combinam uma interação bio-molecular com dispositivos de sinalização físicos ou químicos conhecido como transdutores1. Os sinais gravados podem ser interpretados e convertidos para monitorar as interações entre os parceiros de imobilizado e livre. A maioria dos biosensores envolve o uso de um anticorpo para detectar analitos tais como hormonas ou patógeno diferentes marcadores2. Sensor de diferentes formatos podem ser usados e incluem biosensores baseados em massa, magnéticos, ópticos ou eletroquímicos. O último está entre os mais comumente usados sensores e função, convertendo um evento de vinculação em um sinal elétrico. As performances e sensibilidades de todos os biossensores baseados em anticorpos são fortemente dependentes essencialmente de dois parâmetros: i) a qualidade do anticorpo e ii) e as propriedades do sistema usado para gerar o sinal2.
Os anticorpos são proteínas massa dimérica high-molecular (150 – 160 kDa) são compostos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A interação entre as cadeias leves e pesadas é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas, bem como uma ligação dissulfureto conservada. Cada cadeia inclui um domínio variável que interage com o antígeno essencialmente através de três regiões hipervariáveis chamado complementar determinando regiões (CDR1-2-3). Apesar dos inúmeros avanços no campo, a expressão em grande escala de anticorpos completos com sistemas de expressão de baixo custo (por exemplo, Escherichia coli), muitas vezes leva à produção de proteínas instáveis e agregadas. É por isso que vários fragmentos de anticorpos têm sido projetados tais como variável de cadeia única de fragmentos3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Eles consistem os domínios variáveis de respectivamente um pesado e um cadeias leves que são covalentemente ligados por uma sequência de aminoácidos sintéticos. No entanto, esses fragmentos frequentemente exibir uma pobre estabilidade e têm a tendência de agregar, uma vez que expõem uma grande parcela de suas regiões hidrofóbicas para o solvente4. Neste contexto, fragmentos de anticorpos camelid única cadeia, conhecidos como nanobodies ou VHHs, parecem ser excelentes alternativas para ScFvs. Estes domínios correspondem os domínios variáveis de anticorpos de cadeia única camelid. Em contraste com anticorpos convencionais, camelid anticorpos são desprovidas de cadeias leves e contenham apenas duas correntes pesadas5. Portanto, nanobodies são os menor monomérico fragmentos de anticorpos (12 kDa) podem ligar a um antígeno com afinidade semelhante de anticorpos convencional6. Além disso, eles apresentam melhor estabilidade e solubilidade em comparação com outros anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos. Finalmente, suas dimensões reduzidas e sua prolongada CDR3 loops que lhes permitam reconhecem epitopos crípticos e vincular a enzima sites ativos7,8. Hoje em dia, estes domínios estão recebendo atenção considerável e foram combinados com a tecnologia biosensor. Por exemplo, Huang et al. desenvolveram um biossensor baseado em nanobody para a detecção e quantificação de humano antígeno prostático específico (PSA)9.
Como mencionado acima, um parâmetro importante em ensaios de biosensor é a eficiência do sistema usado para gerar o sinal elétrico. Por esta razão, biosensores eletroquímicos enzimáticos têm atraído cada vez mais atenção e tem sido usados amplamente para várias aplicações tais como cuidados de saúde, segurança alimentar e monitoramento ambiental. Estes biosensores dependem a hidrólise catalítica de um substrato por uma enzima para gerar o sinal elétrico. Neste contexto, β-lactamases foram mostrados para ser mais específico, mais sensível e mais fácil de implementar do que muitas outras enzimas como a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano10experimentalmente. Β-lactamases são enzimas que são responsáveis pela resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos por hidrólise de-los. Eles são monoméricos, muito estável, eficiente e de tamanho pequeno. Além disso, inserções de domínio/peptídeo em β-lactamases geram proteínas quiméricas bi-funcionais que foram mostradas para ser instrumentos eficazes para estudar as interações proteína-ligante. De fato, estudos recentes têm mostrado essa inserção da variável fragmentos de anticorpos para os resultados de β-lactamase TEM1 em uma proteína quimérico que continua a ser capaz de ligar-se com alta afinidade ao seu antígeno alvo. Curiosamente, a ligação do antígeno foi mostrada para induzir alostérica de TEM1 atividade catalítica11,12. Além disso, mostramos em vários estudos que a inserção de domínio de proteína em um loop de permissiva do Bacillus licheniformis BlaP β-lactamases gera proteínas quiméricas funcionais que são adequadas para monitorar as interações proteína-ligante13 ,14. Recentemente, nós inserimos um nanobody, denominado cAb-Lys3, para este site de inserção permissiva do BlaP15. Este nanobody foi mostrado para vincular a galinha-de-ovo lisozima (HEWL) e para inibir a atividade enzimática de16. Nós mostramos que a proteína gerada híbrido, chamada BlaP-táxi-Lys3, manteve uma alta especificidade / afinidade contra HEWL enquanto a atividade de β-lactamase permaneceu inalterada. Então nós com sucesso combinado com a tecnologia de β-lactamases de híbrido de um biosensor eletroquímico e mostrou que a quantidade de sinal elétrico gerado era dependente da interação entre BlaP-táxi-Lys3 e HEWL imobilizada em um eletrodo. Com efeito, hidrólise da β-lactâmicos por BlaP induz uma liberação de prótons que pode ser convertida em um sinal elétrico quantitativo. Esta combinação da tecnologia híbrida de β-lactamase com um biosensor eletroquímico é rápido, quantitativo e permite a medição em tempo real do sinal gerado. Esta metodologia é descrita neste documento.
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Protocol
1. proteína preparação da amostra
- Produzir e purificar a proteína híbrida BlaP-táxi-Lys3 como relatado no nosso anterior estudo15. Armazenar a proteína em 50mm tampão fosfato pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 dissolvida em 800 mL de água destilada corrigir o pH da solução a 7,4 antes ajustando o volume final da solução a 1 L. Filter esterilizar a solução de proteína.
- Prepare uma solução stock de galinha ovo lisozima (HEWL). Dissolva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL adquirido comercialmente em 10 mL de solução salina de tampão fosfato (PBS ver passo 2.1.1). Esterilize a solução de proteína por filtração utilizando filtros com um corte de 0,22 μm.
2. biosensor ensaios
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Preparação de solução e buffer
- Prepare 50 milímetros PBS dissolvendo-se 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4e 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH 7,4 com 1 N HCl ou NaOH de N 1 antes de ajustar o volume da solução de 1 L. filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C.
- Preparar uma solução de saturação/bloqueio pela dissolução de 3 g de hidrolisado de caseína em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
- Preparar uma solução de ligação pela dissolução de 1 g de hidrolisado de caseína em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
- Preparar uma solução de lavagem (0.1% Tween - PBS) adicionando-se 100 μL de Tween 20 (100%) em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Loja a 4 ° C.
- Preparar uma solução de preparação do eléctrodo (1% Triton X-100-PBS), adicionando 1 mL de Triton X-100 (100%) em 100 mL de PBS preparado como descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Loja a 4 ° C.
- Preparar uma solução de regeneração do eletrodo (3,5 M KCl) dissolvendo-se 26 g de KCl em água destilada até um volume final 100 mL. Filtro esterilizado e em 4 ° C.
- Preparar uma solução de NaCl de 5 mM, dissolvendo 0,29 g de NaCl em água destilada até um volume final de 1 L. filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C. Em seguida, prepare uma solução de deteção (4mm benzilpenicilina) dissolvendo 26,7 mg de benzilpenicilina em 20 mL de solução de NaCl de 5 mM. Filtro de esterilizar e armazenar a-20 ° C.
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Regeneração e preparação de sensor
Nota: A polianilina revestido sensor fichas foram desenvolvidas e gentilmente cedidas pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof Y. Glupczynski (Católica Universidade de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). A descrição do sensor, bem como os protocolos de electro-polimerização de polianilina usados para sintetizar estes sensores estão detalhadas no seu anterior trabalho17. Brevemente, este sistema utiliza sensores reutilizáveis de oito fichas individuais que foram produzidos por técnicas de clássica de circuito impresso (PWB). Fichas individuais são compostas de três Eletrodo Redondo manchas. A de cima é o eletrodo de trabalho na qual polianilina foi electro-sintetizados. O meio é o eletrodo de referência e o eletrodo de fundo constitui o eletrodo contador. Tanto, a referência e os eletrodos de contador são acrescidos usando amálgama de Ag/AgCl sólida no topo da camada de carbono.- Executar 3 lavagens dos eletrodos, mergulhando as pontas poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução de preparação do eléctrodo (veja de 1% Triton X-100-PBS, passo 2.1.5.). Realize cada lavagem por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
- Lave os eletrodos por mergulhar as pontas nos poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de água destilada por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
- Regenerar os eléctrodos por mergulhar as pontas nos poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução de regeneração (3.5 M de KCl, consulte a etapa 2.1.6) durante a noite em 4 ° C ou 1 h à temperatura ambiente.
- Executar 3 lavagens dos eletrodos, mergulhando as pontas poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução salina tampão de fosfato (consulte a etapa 2.1.1.). Realize cada lavagem por 2 minutos com suave mistura à temperatura ambiente.
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Ligação do ensaio realizado no sensor
- Casaco HEWL na superfície do eléctrodo PANI (polianilina) depositando uma gota de 15 µ l de 40 µ g/mL HEWL preparado em PBS sobre a superfície do eletrodo. Incube durante a noite a 4 ° C ou 1 hora em temperatura ambiente.
- Realizar três lavagens dos eléctrodos com solução salina tampão de fosfato (ver passo 2.1.1) por mergulhando as peças eletrodo dos chips sensor poços de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l/poço de solução salina tampão de fosfato. Realize cada lavagem por 2 min com suave mistura à temperatura ambiente.
- Saturar os eléctrodos, adicionando uma gota de 50 µ l da solução de bloqueio (ver passo 2.1.2) sobre a superfície do eletrodo. Encube por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes, conforme descrito em anterior passo (veja etapa 2.3.2).
- Diluir a solução BlaP-táxi-Lys3 de 20 µ g/mL em solução de ligação (consulte a etapa 2.1.3) e aplicar uma gota de 15 µ l desta solução diluída para os eletrodos. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Depois da reação antígeno-nanobody, lave três vezes como descrito na etapa anterior, usando a solução de lavagem (ver passo 2.1.4). Em seguida enxaguar o eletrodo uma vez com PBS (consulte a etapa 2.1.1).
- Para a deteção, conecte o sensor chip através da parte de circuitos de cobre a um multímetro digital. Em seguida, iniciar a resposta do sensor aplicando uma gota de 50 µ l de solução de deteção (consulte a etapa 2.1.7) para os eletrodos positivos e aplicar uma gota de 50 µ l de solução de 5 mM de NaCl sobre os eletrodos negativos (consulte a etapa 2.1.7). Incube durante 30 min à temperatura ambiente. Monitore a condutância com um multímetro digital.
Nota: O multímetro foi fornecido pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof Y. Glupczynski (Católica Universidade de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Este potentiostat é controlado por computador através de uma porta USB e analisa os oito chips diferentes do sensor simultaneamente. O software criado por Yunus e colegas17 cria uma trama em tempo real que representa as medições da diferença condutância entre os eletrodos de referência e da amostra contra o tempo.
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Representative Results
Design e engenharia das proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3
A Figura 1 representa a inserção de táxi-Lys3 em um loop permissiva da BalP classe A β-lactamases de Bacillus licheniformis. A inserção foi realizada entre resíduos Asp198 e Lys199. Um local de clivagem de trombina foi introduzido em cada lado do táxi-Lys3. As células transformadas com um plasmídeo de expressão constitutiva codificação da proteína quimérico BlaP-táxi-Lys3 foram capazes de crescer na presença de uma pequena concentração de ampicilina. Este resultado indica que o híbrido β-lactamase é solúvel, dobrado corretamente e pode ser excretada com êxito para o espaço periplasmático das bactérias onde pode eficientemente fornecer resistência à ampicilina. Analisamos mais a bifunctionality de nossas proteínas quiméricas. Como relatado em estudos anteriores, nossos dados mostraram que o β-lactamase, bem como as metades de táxi-Lys3 das proteínas quiméricas mantiveram suas atividades biológicas de15.
Ensaio de titulometria biosensor
O sensor de fichas utilizadas para este teste é mostrado na Figura 2. Os sensores utilizados para estas experiências contêm 8 fichas. Cada chip inclui três eletrodos: um trabalho elétrodo, um Counter-e eletrodo de referência de um. Estes 8 chips são organizados como 4 pares no sensor. Para cada par, um dos chips rotulado "-" corresponde a um controle negativo, Considerando que o chip rotulado "+" corresponde à amostra testada.
A Figura 3 representa a descrição esquemática da instalação experimental utilizada neste trabalho que combina a tecnologia de β-lactamases de híbrido de um biossensor potenciométrico. Nesta configuração, são utilizados dois eletrodos: i) um eléctrodo de referência e ii) um eletrodo revestido de polianilina (PANI). HEWL é adsorvido sobre o eletrodo revestido da PANI, como relatado em outros estudos18,19. Após lavagens adequadas, BlaP-táxi-Lys3 (para "+" rotulado fichas) ou BlaP sem nanobody inserido (para "-" rotulado fichas) são aplicadas sobre os eletrodos. Após a adição de β-lactama (benzilpenicilina) nos eléctrodos, medem-se as alterações na condutância de eletrodo. Com efeito, β-lactama hidrólise por β-lactamases gera um lançamento de prótons; que foi mostrado para criar mudanças significativas na condutância de eletrodo com um tempo de resposta muito curto. Os ensaios de biosensor apresentados na Figura 4 indicam que a ligação do BlaP-táxi-lys3 para HEWL imobilizada em eléctrodo Pereira pode ser detectada e monitorizada medindo-se a libertação de protões resultantes da atividade de β-lactamase imobilizado. Em contraste, nenhuma diferença de condutância foi detectada quando o experimento foi realizado com BlaP sem qualquer nanobody inserido.
Figura 1: esquema representando as proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3 interagindo com HEWL. BlaP é mostrado em ciano, cAb-Lys3 na cor laranja e HEWL em azul. Este valor foi obtido combinando as estruturas tridimensionais de BlaP (PDB ID: 4BLM) e o complexo de táxi-Lys3/HEWL (PDB ID: 1MEL). O β-lactamase contém 2 domínios: o domínio α/β e o domínio α, se encontra o sítio catalítico na interface entre os dois domínios. O loop usado para a inserção é realçado em amarelo e localizado em um loop de solvente-expostos no domínio de α. As partes do N - e C-terminal de táxi-Lys3 são mostradas em vermelho. O loop CDR3 de táxi-Lys3 faz a maioria dos contatos com o sítio catalítico HEWL. A ligação do táxi-Lys3 para HEWL inibe sua atividade enzimática. Esta figura e os resultados aqui apresentados foram publicados em nosso anterior trabalho15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens do sensor usado no experimento. Cada sensor inclui um grupo de 8 fichas individuais. Em cada chip, existem três eletrodos: um eletrodo de referência, um eletrodo de trabalho e um eletrodo de íon do contador. A parte coberta de cobre é conectada a um multímetro digital conectado a um computador. As fichas individuais são organizadas como 4 pares onde o "-" chips etiquetados são eletrodos de controle negativo e o "+" etiquetados chips são os eletrodos de amostra. Esta configuração permite que diferentes réplicas experimentais ou HEWL / concentrações de β-lactamases para serem testados simultaneamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: representação esquemática da instalação experimental utilizada no nosso ensaio biosensor. HEWL estava imobilizado para um eletrodo revestido de Pereira (polianilina). As proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3 aplicou-se então para o eletrodo. A atividade de β-lactamase imobilizado, que é determinada medindo-se a liberação de prótons induzida pela hidrólise de benzilpenicilina, é diretamente proporcional à interação entre HEWL e as proteínas quiméricas. A liberação de prótons induz mudanças de condutância elétrica que são convertidas para um sinal de que pode ser interpretado pelo usuário. Evolução da condutância diferença observada entre o PANI revestido e o eletrodo de referência em função do tempo. Esta figura e os resultados aqui apresentados foram publicados em nosso anterior trabalho15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representação gráfica da titulometria medições mostrando a interação específica do BlaP-táxi-Lys3 para HEWL. A adição de benzilpenicilina é indicada por uma seta. Esta diferença de potencial resulta do lançamento do próton ocorrendo após hidrólise de antibiótico. As medições foram realizadas com a proteína híbrida BlaP-táxi-Lys3 (vermelho) e o β-lactamase nativo BlaP sem qualquer nanobody inserido (azul), como um controle negativo. As diferentes curvas representam medições independentes realizadas em chips diferentes. Esta figura e os resultados aqui apresentados foram publicados em nosso anterior trabalho15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho apresentamos um método para funcionalizar um nanobody usando o BlaP β-lactamase como uma proteína transportadora e mostramos que podemos implementar com êxito a proteína híbrida resultante em um ensaio de sensor potenciométrico. O aspecto principal inovação do nosso trabalho em comparação com outros ensaios biosensor é o acoplamento covalente da parte de anticorpo para a atividade enzimática que gera o sinal elétrico. Esta tecnologia de inserção de proteína chamada apresenta vantagens e limitações que serão o foco principal desta seção.
Vantagens da tecnologia híbrida de β-lactamase.
Β-lactamases são enzimas eficientes
Um dos parâmetros mais importantes que influenciam a sensibilidade e a relação sinal-ruído de um biossensor é a atividade enzimática, usada para gerar o sinal. Neste contexto, β-lactamases apresentam várias vantagens: são pequenos (≈29 kDa), monomérico, muito estável e mais importante, apresentam alta atividade específica e alta rotatividade em comparação com outras enzimas utilizadas em ensaios de sensor potenciométrico, como a glicose oxidase, urease, lipase, peroxidase ou fosfatase alcalina20. Por todas estas razões, β-lactamases são enzimas de escolha para vários ensaios biosensor.
Inserção direta no β-lactamase pode melhorar o rendimento de produção e estabilidade do domínio/proteína inserida.
Um dos aspectos limitantes de muitos immunosensor de ensaios é a qualidade (por exemplo, a estabilidade, a pureza) do anticorpo usado para detectar o analito2. Atualmente, sistemas de baixo custo de produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, Escherichia coli) permanecem um desafio e muitas vezes levam a proteínas agregadas com pobre solubilidade e estabilidade21. Nossa tecnologia de β-lactamase híbrida parece ser uma boa abordagem para superar estas dificuldades desde que mostramos anteriormente que esta estratégia melhora o rendimento de expressão e a estabilidade dos domínios da proteína inserida14. Em particular, no presente estudo, utilizando o nosso sistema de β-lactamases de híbrido, a proteína quimérico chamada BlaP-táxi-Lys3 foi com êxito expressa em e. coli com um rendimento muito bom (≈10 mg de proteína pura por litro de cultura) e purificada a homogeneidade.
Acoplamento covalente entre o anticorpo e metades enzimáticas faz ensaios de sensor mais barato e mais rápido
Em immunosensors convencional, a detecção do analito requer a utilização de anticorpos primários que são imobilizadas sobre o chip do sensor. Posteriormente, um anticorpo secundário que é acoplado a uma enzima ou uma sondas marcadas também é necessária para gerar um sinal mensurável. Esta abordagem envolve várias etapas de lavagem e a incubação do e, portanto, pode ser demorada. Além disso, este protocolo é caro, uma vez que vários anticorpos são necessários e acoplamento covalente entre o anticorpo secundário e uma enzima/sonda também é necessário. Em contraste, o nosso sistema utiliza apenas uma proteína híbrida para detectar e quantificar o analito e, portanto, permite monitoramento sem o uso de anticorpos secundários em tempo real.
Além disso, é importante observar essa inserção de domínio em classe que um β-lactamases foi mostrado para gerar proteínas híbrido exibindo comportamento alostérico interruptor22,23. Esses interruptores poderiam encontrar numerosas aplicações em ensaios baseados em biosensor.
Limitações da tecnologia híbrida de β-lactamase.
Limitações induzidas pela engenharia de proteínas.
Neste sistema, a principal dificuldade é projetar e obter uma proteína híbrida inserindo o moiety do anticorpo do β-lactamase. Esta proteína quimérico resultante deve ser bifuncional: o moiety enzimática deve permanecer capaz de eficientemente hydrolyse β-lactâmicos para gerar o sinal elétrico, Considerando que o moiety do anticorpo deve ligar para o analito alvo com alta afinidade e especificidade. Para obter proteínas quiméricas bifuncionais, vários parâmetros precisam ser considerados para evitar restrições de impedimento estéricos. O primeiro ponto crítico é a posição do local de inserção. Embora tenha sido demonstrado que vários pontos de inserção são possíveis24,25,26, inserção posições muitas vezes estão localizadas em solvente expostos loops de longe do sítio ativo da proteína transportadora. Isso minimiza possíveis alterações conformacionais ou estérico induzido pela proteína inserida. Pelas mesmas razões, também é recomendável que o sítio ativo da proteína inserida ser localizado longe do local da inserção para evitar alterações de sua atividade. Finalmente, inserção de proteínas que apresentam extremidades flexível ou vizinha N - e C-terminal será melhor tolerada. Com efeito, extremidades distantes e rígidas podem impor restrições estéricos sobre ambos os parceiros das proteínas quiméricas e, portanto, alterar suas respectivas atividades biológicas. Portanto, é importante mencionar que o tamanho da proteína inserida tem apenas pouco impacto sobre proteínas quiméricas resultantes. De fato, tem sido demonstrado que grandes domínios estruturados podem ser com êxito inseridos β-lactamases, contanto que suas extremidades N - e C-terminal são flexíveis ou perto um do outro13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. no presente estudo, o local de inserção em BlaP está localizado longe do seu sítio ativo e o nanobody inserido tem relativamente longas e flexíveis extremidades (não visíveis na estrutura de raios-x) que estão localizadas longe do paratope. Estas características específicas garantem que mínimo estéricos restrições sejam impostas as superfícies biologicamente ativas de ambos os parceiros da proteína híbrida. No entanto, quando a proteína inserida não apresenta os critérios recomendados para inserção em uma proteína transportadora, é possível engenheiro vinculador regiões a fim de reduzir potenciais restrições impedimento estéricos. Com efeito, a presença de um vinculador flexível (por exemplo, Gly-Ser repetições) para se conectar a transportadora e a proteína inserida foi mostrada para aumentar drasticamente a tolerância em relação a inserção de proteínas grandes e estruturadas em um portador de um30 ,12.
Limitações inerentes à eletroquímica biosensores.
Embora o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos/potenciométrica tornou-se um campo crescente, estes ensaios têm limitações importantes que precisam ser considerados ao projetar o experimento biosensor. Primeiro, todos os biossensores que envolvem a liberação de H+ ou absorção requerem o uso de soluções muito fracamente tamponadas (ou seja, < 5mm)31 para medir diferenças de potencial significativas. A variação de pH induzida após a libertação de H+ pode afetar as propriedades da proteína e a atividade enzimática, usado para gerar o sinal. Em segundo lugar, pH e força iônica em biofluids podem variar significativamente e, consequentemente, resultar em importantes variações na resposta e aumentar o ruído de fundo dos biossensores32. É por isso, vários grupos de investigação tentaram desenvolver nanotecnologias para diminuir o tamanho dos elementos do sensor eletroquímico para aumentar a relação sinal-ruído para os processos que ocorrem na interface do dispositivo33, 34 , 35. como consequência, também é possível desenvolver moléculas do anticorpo rotuladas com várias moléculas da mesma enzima para aumentar o sinal resultante a ligação de uma molécula para seu alvo32. No entanto, apesar dessas limitações, condutométricas/biosensores permanecem dispositivos altamente eficientes e sensíveis, com estimados limites de detecção (LODs) na faixa de 10-8 a 10-11 M36.
Neste estudo, mostramos que podemos inserir com êxito uma nanobody que tem como alvo HEWL em uma classe A β-lactamases chamado BlaP, e que a proteína híbrido gerado mantém ambas as atividades biológicas: i) firme vinculação da HEWL e ii) a capacidade para hydrolyse Β-lactâmicos. Este estudo constitui uma prova de conceito para inserção de vários fragmentos de nanobodies ou anticorpo em BlaP e a implementação desta tecnologia de proteína híbrida em ensaios de sensor potenciométrico. Esta tecnologia potencialmente poderia ser usada para detectar vários resumos de proteína e implementada em inúmeras ferramentas de diagnóstico. Com efeito, o desenvolvimento e o uso eficaz desses ensaios tornaram-se cruciais na nossa sociedade e são, essencialmente, impulsionado por necessidades sociais e económicas para o baixo custo e fácil de operar tecnologias em várias áreas tais como sistemas de alimentação e saúde, especialmente em países em desenvolvimento. Além disso, as nanotecnologias desempenham um papel crescente no desenvolvimento de tais sensores. Hoje em dia, tecnologias de processamento de sinal estão disponíveis em dispositivos portáteis como smartphones e tabletes e smartphone diferente aplicações já existem para o processamento de sinal37. Por exemplo, recentemente, um dispositivo de sensor potenciométrico foi integrado em um smartphone para permitir a concentração de glicose38de monitoramento. Os especialistas em saúde estão confiantes de que estes dispositivos tipo de inovador se tornará mais importantes soluções de saúde nos próximos anos39,40.
Em conclusão, este trabalho representa um exemplo que mostra o potencial e vantagens da nossa tecnologia de inserção de proteína. Esperamos que este trabalho contribuirá para desenvolver tecnologias inovadoras e úteis para fins de investigação e médicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Valão região da Bélgica, no âmbito dos projectos de investigação SENSOTEM e NANOTIC, bem como o nacional fundos para a investigação científica (F.R.S-F.N.R.S) pelo apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
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