Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/55440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

الببتيدات المشتقة من الفيروسية بالإضافة إلى جسم-يصرف (ACs) نهج تكتسب زخما بسبب إمكانية إيصال حمولات الجزيئية مع تراكم خلايا الورم زيادة. استخدام أساليب مشتركة لتقييم تصريف الببتيد والتيار المتردد وتراكم حمولة داخل الخلايا، واستهداف الورم، هذا البروتوكول يساعد الباحثين خلال مراحل التطوير الأولية الرئيسية.

Abstract

جسم-يصرف (ACs) تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروسات فئة قوية من ورم الخلية تسليم وكلاء لحمولات الجزيئية المستخدمة في علاج السرطان والتصوير بسبب زيادة تراكم الخلوية عبر الرابطة الحالية. خلال AC المبكر في المختبر تطوير تقنيات الأسفار والكلون تكفي لتحديد الترجمة داخل الخلايا، وكفاءة تراكم، وخصوصية الخلية المستهدفة. تجدر الإشارة إلى أن هناك حاليا، لا يوجد توافق في الآراء على أساليب موحدة لإعداد الخلايا لتقييم التراكم داخل الخلايا التيار المتردد والتعريب. الاختبار الأولى للرابطة تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروسات أمر بالغ الأهمية خاصة إذا تم تشييد العديد من المرشحين. تحديد تراكم داخل الخلايا بالأسفار يمكن أن تتأثر بالإشارات الخلفية من ACs على سطح الخلية وتعقيد تفسير تراكم. الكلون، الخلايا المعالجة عادة هي مجزأ وقياس النشاط الإشعاعي في المقصورات خلية مختلفة. ومع ذلك، تحلل الخلية يختلف من خلية إلى خلية والمقصورات غالباً النووية وهيولي ليست معزولة على نحو كاف. وهذا يمكن أن تنتج بيانات مضللة عن خصائص تسليم الحمولة. الحقن الوريدي المستمدة من الفيروسات المعدلة الببتيد الرابطة راديولابيليد في ورم تحمل الفئران تليها النويدات المشعة التصوير وسيلة قوية لتحديد خصائص التسليم لاستهداف وحمولة الورم في المرحلة في فيفو من التنمية. ومع ذلك، هذا هو النهوض حديثة نسبيا والمجموعات القليلة التي قيمت ACs المستمدة من الفيروس بتعديل الببتيد بهذه الطريقة. يصف لنا تجهيز الخلايا المعالجة لتقييم أكثر دقة تعديل الببتيد AC تراكم المستمدة من الفيروسات عند استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] والكلون. على وجه التحديد، طريقة للخلايا تريبسينيزينج لإزالة سطح الخلية ملزمة ACs. كما نقدم طريقة لتحسين وجود الهاتف الخلوي. وأخيراً، يوفر هذا البروتوكول أسلوب في فيفو استخدام التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) لتقييم الورم الأولى استهداف خصائص في الفئران الحاملة للورم. يمكننا استخدام النظائر المشعة 64Cu (t1/2 = ح 12.7) كحمولة مثال في هذا البروتوكول.

Introduction

جسم مضاد-يصرف (ACs) هي الأحيائية التي تنضج في فئة تحويلية من العقاقير الفعالة لتحسين علاج السرطان واكتشاف الأورام. يتألف من جسم [مونوكلونل] (ماب) مترافق لحمولات الجزيئية مثل النظائر المشعة، والجزيئات الصغيرة، والسموم البيولوجية، رابطة الدول الكاريبية قادرة على تسليم هذه الحمولات للخلايا السرطانية مع تقارب مستضد الهدف الرائع وخصوصية. وهكذا ACs لديها القدرة على تقليل سمية غير محدد إلى حد كبير وزيادة نشاط الحمولة في موقع الورم. علاجية، تمت الموافقة على ACs تنقل الجزيئات الصغيرة السامة للخلايا (يشار إليه كما يرتبط الضد-المخدرات) لعلاج المرضى المصابين بسرطان الثدي وسرطان الغدد اللمفاوية هودجكين الذين فشلت العلاجات التقليدية 1، 2-وبالإضافة إلى ذلك، النظائر المشعة نقل رابطة الدول الكاريبية (يشار إليه فيما يلي راديويمونوكونجوجاتيس) أيضا في التنمية. ميلان نقل النظائر المشعة لتصوير معتمد لتحديد سرطان البروستاتا ورم خبيث 3. مع العديد من الرابطة أكثر العلاجية المقدمة للموافقة على 4، مرتفع التفاؤل لمستقبل الرابطة لتحسين رعاية السرطان 5.

ومع ذلك، عند تقديم تشريعات أو النظائر المشعة، ACs يجدون صعوبة في فعالية تتراكم هذه الحمولات داخل الخلايا المستهدفة. هذا الجانب تسهم إلى حد كبير في كثير من الحالات في العجز الرابطة لتوفير البقاء فترة طويلة خالية من المرض أو الورم التباين العالي التصوير 6،7. بشكل عام، بمجرد ربط ACs على مستضد المستهدفة هي استيعابه من خلال عملية تعرف باسم الالتقام بوساطة مستقبلات. ACs ثم شرك داخل اندوسوميس والاتجار بهن إلى lysosomes للتدهور وحمولة الإصدار 8. هناك تحديات عملية الاتجار داخل الخلايا للرابطة لتحقيق خصوصية حمولة عالية وفعالية ضد الخلايا السرطانية المستهدفة. على سبيل المثال، العديد من المستضدات مثل Her2 (الهدف للتيار المتردد العلاجية تراستوزوماب-امتانسيني) يمكن إعادة تدوير يصل إلى 85% من الأجسام المضادة منضمة في ال 30 دقيقة الأولى 9. وعلاوة على ذلك، بمجرد حدوث تدهور تشريعات المفرج عنهم والنظائر المشعة يمكن بنشاط تصدير التعبير زيادة و/أو النشاط من غشاء المرتبطة النقل البروتينات 10،11. تدهور يحلول يعرقل أيضا تسليم الحمولات البيولوجية رواية مثل الإنزيمات العلاجية والنوكليوتيد التي يمكن إلغاء تنشيط 12،13. في جوهره، سرطان الخلية فعالة للغاية في نقض تراكم الحمولات التي تقدمها الرابطة الضرورية داخل الخلايا.

هذا البروتوكول وصف كيفية تطبيق مفهوم الرابطة-بالإضافة إلى الببتيدات المشتقة من الفيروس، على وجه التحديد للهروب من فخ دخلول وإضفاء الطابع المحلي على نواة الخلية. مع هذا التطور للتلاعب بنظم الخلية المضيفة، فإنه ليس من المستغرب أن تنمية الببتيدات والبروتينات المشتقة من الفيروس كصيدلية المحتملة طويلة لها جذور في الأبحاث العلاجية 14. لملايين السنين تطورت الفيروسات للحصول على مجموعة استثنائية من البروتينات قادرة على استغلال نظم خلية الثدييات فيزيولوجية طبيعية من أجل فعالية إدخال الخلايا المضيفة. للبحث عن الفيروسات التي يتم استيعابها عن طريق وساطة مستقبلات الالتقام، أنهم أيضا تحدي مع الإفلات من الاتجار إلى يحلول حيث يمكن أن تكون هجمة تركيز مترجمة من البروتياز إشكالية بالنسبة للبقاء على قيد الحياة. هو ببتيد الفيروسية مشتقة تتسم أيضا استخدامها في إيصال المخدرات للهروب من فخ دخلول ترانساكتيفاتور فيروس نقص المناعة البشرية من النسخ (تأت) البروتين 15. تأت غير قادرة على النجاة من فخ دخلول الاستشعار عن النقطة التي تحدث تغييرات conformational البروتين تأت مواتية لإدراج نفسها في وتعطيل غشاء اندوسومال 16على درجة الحموضة منخفضة. ينتج عن هذا يصرف تأت-حمولة قادرة على الوصول إلى السيتوبلازم. والعنصر الثاني التلاعب الفيروسية ذات الصلة بهذا البروتوكول هو النهج المستخدمة لتوصيل الجينات العلاجية والأدوية إلى نواة 17. وقد تطورت الفيروسات التلاعب بنجاح إليه الخلية المضيفة لتتقدم في الماضي الغشاء النووي التي تمر عبر المسام النووية المعقدة (مجلس الشعب). الجزيئات الخلوية تحتوي على (أو الربط بالبروتينات التي تحتوي على) إشارات التعريب النووية (نلس) اللازمة للربط النووية إلى نقل البروتينات (مثل كاريوفيرينس α و β)، التي توفر الحركات المطلوبة من خلال المجلس الوطني. وقد وضعت الفيروسات البروتينات تحتوي على تسلسلات NLS تزويدها بالقدرة على الاستفادة من البروتينات النقل الخلية المضيفة لجولات مكوكية إلى نواة 18.

سابقا تم فونكتيوناليزيد مع الببتيدات تأت NLS مشتقة-والرابطة العديدة واختبار لقدرتهم على تتراكم داخل الخلايا السرطانية واستهداف الأورام 19،،من2021،22 ،،من2324،25،26،27،28،،من2930 (الجدول 1). وقد أثبتت الدراسات تسليم الحمولات السامة للخلايا أن الرابطة تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروسات تكون قادرة على زيادة تراكم الخلوية، وسيتوتوكسيسيتي، وورم مما أسفر عن مصرع على مدى 22،ACs غير معدلة26. سمة مشتركة لهذه الفئة الجديدة من التيار المتردد هو البناء. عادة، تحتوي على الببتيدات سيستين المحطة طرفية توفير مجموعة سلفهيدريل مجاناً. وكان رد فعل مابس هي أولاً مع كروسلينكير بيفونكشونال نونكليفابل التي تحتوي على N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) ومجموعات ماليميدي على طرفي نقيض. استرات دائرة الصحة الوطنية التي تتفاعل مع الأمينات الأولية في ماب شكل سندات أميد. ثم رد فعل ماب ريكتيد مع المجموعات ماليميدي الحرة مع مجموعات سلفهيدريل على الببتيدات تشكيل سندات ثيويستير وهكذا يربط بين الببتيد والإنسان والمحيط الحيوي. على الرغم من أن كروسلينكيرس هوموبيفونكشونال قد تستخدم 28، crosslinker هيتيروبيفونكشونال أكثر شيوعاً في تشييد المستمدة من الفيروسات الببتيد-ACs 22،،من2326، 31،32. يستخدم هذا البروتوكول تحديداً سولفوسوكسينيميديل كروسلينكير 4-(ن-ماليميدوميثيل) الحلقي-1-كاربوكسيلات (سالفو-بين الموظفين) لسهولة الاستخدام، ونظرا لاستخدامه في جسم المعتمدة-المخدرات المتقارنة تراستوزوماب-امتانسيني، وفي كثير من الببتيد-ACs المستمدة من الفيروسات 8،22،23،26،،من3132. الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) هو الأسلوب الأساسي لتحديد كفاءة التصريف في البداية وشبه تحديد عدد الببتيدات للإنسان والمحيط الحيوي. [كنفوكل] مجهرية من جسم ثانوي المسمى فلوريسسينتلي محددة للإنسان والمحيط الحيوي استخدام أسلوباً عادة لتقييم خصائص التوزيع داخل الخلايا المستمدة من الفيروسات الرابطة تعديل الببتيد في البداية. وحتى الآن، هي النظائر المشعة حمولات الابتدائي ألقاه المستمدة من الفيروسات ACs تعديل الببتيد. النظائر المشعة مفيدة للنشاط الإشعاعي في الخلايا كمياً بسهولة عن طريق العد غاما. وبالإضافة إلى ذلك، توفر رابطة الدول الكاريبية التي يتم ترجمتها إلى نماذج الماوس من السرطانات البشرية الباحثين مع القدرة على تقييم استهداف الورم باستخدام طرائق التصوير الجزيئي مثل حسابها انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي والتصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) 23 , 32 , 33-وبصفة عامة، البناء، والتحقق من صحة اختبار الأساليب المستخدمة في المقام الأول من قبل الباحثين تقديم تقييم جيدة جداً للرابطة تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروسات أثناء مرحلة التطوير الأولى لفعالية إدخال وتسليم الحمولة داخل الخلايا المستهدفة، والأورام المستهدفة.

وقد تأت-NLS-تعديل ورابطة الدول الكاريبية مضيئة المجالات الرئيسية لزيادة تحسين إيصال حمولة داخل الخلايا السرطانية والأورام. فيما يتعلق بتعديل NLS ACs، الكفاءة في التراكم داخل الخلايا يمكن أن تكون متواضعة 23،،من3134. بسبب عدم كفاءة تراكم داخل الخلايا الفخ المتواصل اندوسومال. في فيفو استهداف الورم يمكن أيضا التقليل مع كلا تأت-NLS-تعديل ورابطة الدول الكاريبية. تسلسل النشطة التي تأت و NLS تحتوي على بقايا مشحونة بإيجابية عدة. عند إرفاق مابس، يمكن أن تكون التهمة الموجبة عموما إلى حد كبير زيادة 35. نتيجة لذلك، تأت-NLS-تعديل ورابطة الدول الكاريبية زادت الإقبال في الأنسجة السليمة وزيادة إزالة الدم السريع.

لدينا فريق تطوير مركب مركب يتكون من حمض الكوليك ترتبط NLS (تشاكنلس؛ الشكل 1). ACs بتعديل تشاكنلس قادرين على زيادة تراكم سلمت النظائر المشعة داخل الخلايا وتحسين استهداف الورم مقارنة بالتقليدية وتعديل NLS ACs 33،34. الآلية وراء حمض الكوليك مستوحاة من قدرة تحديد الفيروسات nonenveloped التي لا يمكن الاعتماد على غشاء الانصهار الاستفادة من حمض الكوليك لتحريك دخلول الهروب من خلال تشكيل السيراميد. على سبيل المثال، المجندين الفيروس المعوي الخنزير حمض الكوليك التي ينشط فيها سفينجوميليناسي، مما يحفز على أن التحلل سفينجوميلين إلى السيراميد 36،،من3738. وهذا يزعزع غشاء اندوسومال ويسمح للفيروسات الهروب. وهكذا، حمض الكوليك عنصرا آخر المستمدة من الفيروس الذي يكمل NLS.

هذا الحقل يتحرك إلى الأمام والمستقبل تحدث التقدم في تسليم الحمولة بالرابطة تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروس، وقت مناسب لتقديم المظاهرات البصرية من خصائصها البيوكيميائية والوظيفية أثناء التطوير الأولى. هنا، نحن تصف لدينا بروتوكول التقييم الأولية المستمدة من الفيروسات الرابطة تعديل الببتيد لتحديد تراكم داخل الخلايا، واستهداف الورم خلال المرحلة المبكرة بسيطة لكنها فعالة. نستخدم مابس المتاحة تجارياً 3 7 و A14 كمثال نموذج النظم. يصف الإجراء 1 استخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي كوسيلة تسمح للقرارات 'الذهاب/لا تذهب' للرابطة المشيدة. يصف الإجراء 2 طريقة استخدام تريبسينيزيشن السماح للتصور تحسين توزيع التيار المتردد داخل الخلايا وتراكم. يصف الإجراء 3 طريقة لتحسين وجود داخل الخلايا تحديد دقة الترجمة النووية. في هذا الإجراء علينا الاستفادة من حمولة 64Cu (t1/2 = ح 12.7) لأنها عرضه ل efflux الخلوية وهو باعث بوزيترون 10. وهكذا يصف الإجراء 4 في فيفو الورم تستهدف توصيف بالحيوانات الأليفة التصوير لتصور امتصاص الورم بالنسبة إلى الخلفية (أي nontarget الأنسجة السليمة) وتحديد ما إذا كان المثال التيار المتردد يمكن على وجه التحديد وفعالية الأورام المستهدفة. هذه الأساليب كافية للمحققين وضع الرابطة تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروسات لتحديد المرشحين لمزيد النهوض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت في فيفو الحيوانات التجارب الموصوفة وفقا بروتوكول المعتمد وفي إطار المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجنة الأخلاقيات المركز الاستشفائي الجامعي دي شيربروك "إجراء التجارب على الحيوانات".

1-جسم الببتيد الاقتران

ملاحظة: يمكن تجميعها في أي مصنع الببتيد التجارية أو منصة خدمات توليف الببتيد التابعة لجامعة تشاكنلس. يمكن الاطلاع على تجميع تشاكنلس في مرجع 34. للإجراءات 1 و 2 استخدام ماب 3 7، التي محددة اللوكيميا مستضد 3Rα إيل 39.

  1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل، تعد 10 ملغ/مل الحل (~ 1 ملغ إجمالي جسم) 3 7 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، درجة الحموضة 7.6.
  2. حل سالفو-بين الموظفين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) بتركيز 5-10 مم. فورتيكسينج الحل دقيق يعمل بشكل أفضل من أجل تحقيق حل كامل.
  3. إضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي على 3 7 الحل سالفو المذاب-بين الموظفين (عادة ما بين 5-20 ميكروليتر تبعاً لنسبة المولى من سالفو-بين الموظفين-إلى-7 3 المطلوب). من المستحسن اختبار نسب سالفو-بين الموظفين-إلى-7 3 10-، 25-، و 50 إلى 1. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  4. تنقية وتركيز 3 7 ديريفاتيزيد ماليميدي باستخدام تبادل المخزن المؤقت لجهاز أولترافيلتريشن في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.0. الطرد المركزي في 8,000 س ز لحوالي 5 دقيقة تجاهل التدفق من خلال والتعبئة مع برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.0 والطرد المركزي مرة أخرى.
    1. أداء هذا 7-8 مرات تماما تبادل المخزن المؤقت. استرجاع 3 7 تتركز البروتين عن طريق وضع جهاز تصفية رأسا على عقب في أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1,000 س زاي استرداد وحدة التخزين يجب أن تكون حوالي 0.3 مل
  5. في الأنبوب الذي يحتوي على 3 7 المنشط ماليميدي، إضافة فائض تشاكنلس المولى إضعاف مقارنة بنسبة سالفو-بين الموظفين-إلى-7 3 المستخدمة في الخطوة السابقة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. على سبيل المثال، إذا تم استخدام نسبة سولفو-بين الموظفين-إلى-7 3 10 إلى 1، ثم استخدام نسبة تشاكنلس-إلى-7 3 20 إلى 1. لا يجب تغيير الحجم الإجمالي إلى حد كبير.
    ملاحظة: على الرغم من أن تشاكنلس لا تتسبب في هطول الأمطار خلال عملية الاقتران هذا هو إمكانية التي يمكن أن تحدث مع الببتيدات الأخرى. مراقبة الأنبوب أثناء عملية التفاعل لعلامات لهطول الأمطار، الذي هو على الأرجح تسبب عند الببتيدات مسعور. وفي هذه الحالات قد يكون من المفيد إعادة النظر ببتيد اهتمام من أجل تصميم التغييرات لتوفير زيادة هيدروفيليسيتي.
  6. تركز ز 7 3-تشاكنلس باستخدام جهاز أولترافيلتريشن لتبادل التركيز والمخزن المؤقت المطلوب في برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 7.4 (راجع الخطوة 1، 4). ينبغي أن يكون العائد الانتعاش من مجموع البروتين ≥ 75% المواد البداية الأصلية.
  7. أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتقييم المرشحين 3-تشاكنلس ز 7 المشيدة باستخدام هلام polyacrylamide 12% (ينص الفصل يكفي تشاكنلس مترافق الثقيلة والخفيفة سلاسل من سلاسل نونكونجوجاتيد). المخزن المؤقت التي تحتوي على 2 ميكروليتر β-mercaptoethanol ميكروغرام 10 مزيج من ز 7 3-تشاكنلس في تحميل الصفحة وتحميل في البئر.
  8. تعيين الجهد المناسب (120 الخامس ح 1 لجل 12 في المائة) وتشغيلها التفريد. وقف التفريد عندما أخذ صبغة الجبهة تصل إلى الجزء السفلي من الجل.
    ملاحظة: لا تدع الجبهة صبغ أخذ تشغيل إيقاف الهلام.
  9. إزالة جل من جهاز التفريد وشطف مع ديستينينج محلول يحتوي على 10% v/v من الميثانول v/v حمض الخليك الجليدية ونسبة 20 في المائة.
  10. التقاط صورة للهلام والمسطرة وتدبير ترحيل المسافة (سم) للمعايير و 3 7 يصرف. حساب قيمة معامل (Rf) الاحتفاظ بحق، وهو المسافة التي هاجر مقسمة حسب طول هلام (من حيث يتم تحميل البروتين إلى الجبهة الهجرة أخذ). ارسم الوزن الجزيئي (ميغاواط) في سجل ضد قيم الترددات اللاسلكية من كل البروتين القياسية واستقراء حجم 3 7 يرتبط.
  11. حساب عدد الببتيدات كل جسم بقسمة الفرق بين 3 7 في ميغاواط يرتبط ومعدلة 3 7 من 1768.5 غ/مول (ميغاواط تشاكنلس).
  12. تأخذ الصور الرقمية من جل أخذ الملون وإجراء تحليل لقياس كثافة. عند هذه النقطة، أن اختيار مرشح الرائدة يمكن أن تستند إلى AC مع الحد الأقصى لعدد من الجزيئات تشاكنلس التي لا تحتوي على الأنواع التجميعية الهامة.

2-[كنفوكل] مجهرية لتقييم التراكم داخل الخلايا

ملاحظة: من المهم اختبار انتقاء الخلية داخل الخلايا تراكم مابس تعديل الببتيد قبل وضع صياغات مع حمولة من الفائدة. لأن تأت تبين أيضا لديها ميل لاختراق الخلية غير محدد، مما يستحق أول تحليل داخل الخلايا تراكم وخلية الانتقائية قبل اتخاذ خطوات التنمية مكلفة مع حمولات مكلفة. ولهذا السبب، ينبغي أيضا تعديل الإجراء 1 ايستب مابس محددة تحكم غير ذي صلة. لبقية البروتوكول سوف نعمل مع الرابطة تعديل مع جزيئات تشاكنلس 10 كل جسم. ويرد في الشكل 2تخطيطي بما في ذلك الخطوات الرئيسية لإجراءات 2 و 3.

تنبيه: هذه الخطوة من البروتوكول يشمل مناولة والتلاعب بارافورمالدهيد. يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة عند التعامل.

  1. علاج الخلايا الهدف TF-1a مع 200 نانومتر من 7 ز 3-تشاكنلس، بما في ذلك تعديل عنصر التحكم مابس. احتضان 5 × 106 خلايا مستضد إيجابي مع يصرف ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. بعد ح 1، إزالة المادة طافية وتغسل مع 1 مل x 3 في برنامج تلفزيوني المثلج. إضافة وسائط جديدة واحتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. وبعد ساعة إضافية، إزالة المادة طافية وتغسل 3 x في 1 مل المثلج برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% حمض التربسين والايثيلين (يدتا) عند 37 درجة مئوية لتصل 3 إلى 30 دقيقة.
    ملاحظة: أثناء الاختبار التجريبي الأولى ينصح أن لا تريبسينيزي الخلايا من أجل تحديد الاختلافات في التيار المتردد تراكم داخل الخلايا. ويشجع هذا البروتوكول استعمال التربسين ونظهر كيف يؤدي ذلك إلى تحسين تقييم كفاءة تراكم داخل الخلايا المختلفة AC المرشحين.
    1. اختبار في أوقات مختلفة للحضانة بالتحقق بصريا لكافة الخلايا ويجري فصل. وباﻹضافة إلى ذلك، احتضان الخلية مختبرين بصلاحية تلطيخ حلول وإجراء تحليل تدفق سيتوميتريك كما هو موضح سابقا 40.
    2. تحييد التربسين مع 1.5 مل من خلية ثقافة RPMI 1640 media/10% المصل الجنيني البقري. الطرد المركزي خلايا في ز 500 x لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية، وتغسل 3 x في برنامج تلفزيوني المثلج 0.5 مل.
  4. الخلايا خلايا الإصلاح في برنامج تلفزيوني 0.5 مل تحتوي على بارافورمالدهيد 1% والسكروز 1% على الجليد للغسيل 30 دقيقة x 3 في برنامج تلفزيوني المثلج 0.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 250 x g لأدنى 5 بيرميبيليزي الخلايا في 0.5 مل برنامج تلفزيوني يتضمن 0.15% X-100 تريتون لمدة 5 دقائق على الجليد. تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني المثلج وتكرار استخدام الطرد المركزي.
  5. تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 0.1 مل يحتوي على 2 ميكروغرام/مل (أو الشركة المصنعة لاوصي بالتركيز) للفئران المضادة (ايستب محددة) مترافق Fc الثانوي [بولكلونل] جسم إلى 647 اليكسافلور ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    1. الطرد المركزي في 250 g x لمدة 5 دقائق ويغسل خلايا x 3 في برنامج تلفزيوني المثلج 0.5 مل. تعليق الخلايا في 0.5 مل برنامج تلفزيوني.
      الإيقاف المؤقت: يمكن تخزين خلايا في الثلاجة.
      ملاحظة: من الضروري تحديد جسم ثانوي تسلم ايستب الصحيح من ماب الفائدة. يتم تحديد AF647 بسبب انبعاث كثير من الأشعة تحت الحمراء، التي لا تتداخل مع تلطيخ (PI) يوديد propidium نواة.
  6. إضافة PI إلى تركيز من 10 ميكروغرام/مل إلى الحاوية مع الخلايا. وبعد ذلك، جبل 1 × 105 خلايا على الشرائح الزجاج باستخدام تركيب وسائل الإعلام، وتغطي مع ساترة زجاج.
  7. فحص خلايا ذات هدف غمر نفط Apo خطة 60 X 1.42 نا على ليزر مقلوب المسح مجهر [كنفوكل]. كشف fluorescence PI استخدام الليزر الأرجون 488 نانومتر والمنشور المسح الطيفي 600-650 نانومتر. للأسفار AF647 استخدام ليزر الهيليوم نيون 633 نانومتر والمنشور المسح الطيفي 650-700 نانومتر. جمع الانبعاثات الأسفار من PI و AF647 تسلسلياً.
    ملاحظة: استخدام نفس الإعداد في جميع أنحاء تقييم ومقارنة الخلايا. ومع ذلك، سيكون لديك لضبط إعدادات للخلايا تريبسينيزيد مقارنة مع الخلايا غير تريبسينيزيد.
  8. استخدام مجهر البرمجيات للحصول على الصور. جمع الصور باستخدام المسلسل المقاطع الضوئية الأفقي 1,024 x 1,024 بكسل مع 2 X خط متوسط المتخذة على 0.5 ميكرومتر فترات من خلال سمك الخلية بأكملها. يقدم الصور مكدسة كما z-الإسقاطات من أربعة شرائح متتالية في حدة الأقصى الأسفار.
  9. تحليل الخلايا مع البرمجيات المجهر. سجل نمط التوزيع الخلوي يصرف. على وجه التحديد، تقييم ما إذا كان يتم تجميع الأسفار داخل الخلايا في السيتوبلاسما وقرب الخلية السطحية أو منتشر ومتجانسة. أيضا تقييم كثافة نسبية الأسفار كل خلية.

3-راديولابيليد البناء التيار المتردد وتجزئة الخلوية لتقييم كفاءة التسليم داخل الخلايا Cu 64

تحذير: الإجراءات 3 و 4 تنطوي على مناولة والتلاعب بالنشاط الإشعاعي. قبل القيام بهذه الخطوات، ينبغي أن يكون وافق الباحثين التدريب على السلامة والبروتوكولات المعتمدة من هيئة سلامة الإشعاع على المؤسسة الرئيسية.

ملاحظة: الإجراءات 3 و 4 نستخدم ماب A14، التي محددة لسرطان المثانة الغازية antigen إيل-5Rα41. أيضا، تجارب كل مرة حساسة نظراً لأن نصف العمر القصير من 64Cu. بشكل عام، من الأفضل عدم الانتظار في الماضي الأسبوع 1 القيام بتجارب في المختبر وليس أطول من 72 ساعة للدراسات في فيفو .

  1. في أنبوب 1.7 مل تعليق حمض 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (الملاحظة--دائرة الصحة الوطنية) في [دمس] لتركيز من 10 ملم.
  2. الرد 50-fold الزائدة المولى لدائرة الصحة الوطنية--الملاحظة مع A14 (2 مغ ابتداء من المواد) في بيكربونات الصوديوم 0.1 M في الأس الهيدروجيني 8.6 ح 1 في درجة حرارة الغرفة في ≤ حجم 0.5 مل (حجم الملاحظة--دائرة الصحة الوطنية النهائية ينبغي إلا تتجاوز 2% v/v من الحجم الإجمالي).
  3. تنقية والملاحظة-A14 exchange المخزن المؤقت باستخدام جهاز أولترافيلتريشن في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.6 (راجع الخطوة 1، 4).
  4. للحجز اللاحقة على تشاكنلس، اتبع الخطوات 1، 1، 2-6.
  5. الرد الملاحظة-A14-تشاكنلس (250 ميكروغرام دفعات) مع 100 ميجابيككويريل (مبق) 64كوكل2 في بيكربونات الصوديوم 0.1 M، الأس الهيدروجيني 5.5 ح 1 في 37 درجة مئوية أو أقل من 0.1 مليلتر. 64 وينتج الاتحاد الجمركي على سيكلوترون TR-الحيوانات الأليفة في CIMS 42.
  6. تركز 64Cu-A14-تشاكنلس في برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 استخدام جهاز أولترافيلتريشن للتركيز المطلوب (راجع الخطوة 1، 4).
  7. تحديد كفاءة راديولابيلينج شرائط 64Cu-A14-تشاكنلس بلحظة طبقة رقيقة اللوني (شروع) استخدام الفصل اللوني و 0.1 م، سترات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 (شروع الوينت) كمذيب. تطبيق 0.5 قاسمة ميكروليتر من الحل رد فعل إلى قطاع شروع. نفذ أوتوراديوجراف من قطاع غزة والحصول على صورة رقمية.
    1. إجراء قياس كثافة الحصول على نسبة محددة ومجانا 64الاتحاد الجمركي. إذا كانت مجانية 64محتوى Cu > 5 ٪، العودة إلى الخطوة السابقة والقيام بتنقية إضافية.
    2. وباﻹضافة إلى ذلك، نفذ الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ تلطيخ لتقييم المجموعات. أداء ثاني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة متبوعاً أوتوراديوجراف من الجل لتحديد ما إذا كان هناك راديولابيليد الأنواع التجميعية.
  8. تقارب ملزم نقطة تفتيش الجودة: احتضان يصرف 64A14 الاتحاد الجمركي إلى زيادة تركيزات (0-100 نانومتر) في تكرار مع الخلايا الهدف6 1 x 10 كل مل. لتقدير غير محدد ملزم، مزيج عينات مكررة من يصرف 64A14 الاتحاد الجمركي مع الخلايا حضور فائض المولى 100-fold A14 غير مسمى.
    1. بعد حضانة ح 1 على الجليد، يغسل خلايا والعد جسم منضم مجموع العينات وعينات مجموع جسم منضم غير محدد في عداد غاما. الرسم البياني ملزمة محددة (مجموع الأضداد ملزمة-غير محدد ملزمة جسم) ضد رد الفعل الحر 64Cu-A14 (nM) المستخدمة في مقايسة. تحديد ثابت التفكك (كد) بواسطة الانحدار غير الخطية باستخدام برامج الرسوم البيانية.
  9. دراسات تراكم الخلوية Cu 64: علاج الخلايا مع 100 نانومتر من 64A14 المسمى Cu يرتبط ل 1 ح، ح 6، و 24 ساعة عند 37 درجة مئوية كما تم وصفه سابقا33. تتضمن معلمات إضافية مثل معاملة حضور A14 غير معدلة لمواقع كتلة إيل-5Rα وعند 4 درجة مئوية لمنع استيعاب بوساطة مستقبلات.
  10. وفي الوقت المحدد نقاط، كما هو موضح سابقا في الخطوة 2، 3-2.3.2، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% التربسين ويدتا عند 37 درجة مئوية متبوعاً بتحييد والغسيل.
  11. احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل غشاء البلازما التي تحتوي على 1% التي أرستها-40، 10 مم تريس درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم على الجليد للحد الأدنى 10 MgCl2 المخزن المؤقت الطرد المركزي الخلايا تفكيك غشاء البلازما في 90 x ز لمدة 5 دقائق.
  12. إزالة المادة طافية ووضعه في أنابيب جديدة. وهذا يمثل الكسر هيولى. يغسل نوى 3 x في برنامج تلفزيوني المثلج وإضافة يغسل للكسر هيولى.
  13. ضمان مختومة قارورة تحتوي على كسور النووية وحشوية. ثم وضعها في غاما مضادة معايرة 64Cu بغية تحويل التهم الخام إلى مبق.
  14. تحديد نوعية العزل الأنوية بإجراء تحليل لطخة غربية لمكيف لمين وبروتين النووي مقيد Rab7، بروتين هيولى وفيرة في كل خلية الكسور ليستي والنووية هيولى.
    1. علاج 5 × 106 خلايا مع 500 ميكروليتر المخزن المؤقت للمقايسة (ريبا) إذاعة إيمونوبريسيبيتيشن والمخزن المؤقت تحلل غشاء البلازما في خطوة 3.12 تحتوي على 1% و 2% و 4% NP-40. وعلاوة على ذلك، تعامل الأنوية معزولة في 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمعهد الملكي للحصول على البروتينات النووية المعزولة.
    2. يعجل بالبروتينات معزولة النووية، هيولى وكل خلية باستخدام 4 × حجم العينة من الأسيتون البارد لمدة 60 دقيقة عند-20 درجة مئوية. الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية مع الحرص على عدم إزاحة بيليه البروتين. إضافة 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لإذابة البروتينات.
    3. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين في كل بئر من جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%. إجراء التفريد كما هو موضح في 1.7-1.9. إجراء نقل "لطخة الغربية" كما هو موضح سابقا في ريفيفيرينسي 43.
    4. تحديد سلم على علامات أفضل تناظر ميغاواط كاتشين ~ 40. قص الغشاء في نصف الساعة هذه العلامة. التحقيق وصمة عار تحتوي على بروتينات ميغاواط أعلى مع الأجسام المضادة لمين A/C-محددة. التحقيق الغشاء مع انخفاض البروتينات ميغاواط مع الأجسام المضادة الخاصة 7 Rab. لطخة غربية وهو أسلوب معروف ولا الموصوفة في هذا البروتوكول.

4-الحيوانات الأليفة التصوير التقييم لاستهداف الورم

ملاحظة: تقنيات زرع الخلايا السرطانية في الفئران لتوليد تكثيفها هيتيروتوبيك معروفة جيدا ومعظم المختبرات الداخلية بروتوكولات مصممة خصيصا لنظامهم الورم. وهكذا، وهذا لا يشمل في البروتوكول. وسيكون النموذج إكسينوجرافت نونوبيسي السكري/شديدة مجتمعة العوز (موافقة/مشمولان) الفئران تحمل أورام المثانة الغازية إيل-5Rα-إيجابية HT-1376 و HT-B9. الخلايا السرطانية في المثانة الغازية إيل-5Rα-إيجابية تشمل > 66% من مجموع الخلايا في إكسينوجرافت. في المقابل، وردت ~ 11 في المائة فقط من الخلايا إيل-5Rα-إيجابية HT-B9 في تكثيفها المتقدمة41. وهكذا يوفر هذا النموذج مثالاً ممتازا لتقييم AC استهداف الورم في اثنين من الأورام التي تمثل التغاير ورم المريض المنظور.

  1. في مجموعات تحتوي على ≥ حقن الفئران (موافقة/مشمولان) 4، 20-30 ميكروغرام (6-9 مبق) 64Cu-A14-تشاكنلس و 64Cu-A14-NLS 64Cu A14 الوريد الذيل.
  2. في اليوم نفسه مكان فانتوم أسطواني (24.8 مل) الذي يحتوي على مبق 5 من 64Cu لتحويل التهم المشعة في الثانية الواحدة إلى حقن جرعة جرام من الأنسجة (%ID/g).
  3. الانتظار 48 ساعة وثم تخدير الفئران بوضعها في دائرة للاستقراء مع 1.5 لتر في الدقيقة لتدفق الأوكسجين مع إيسوفلوراني 2%. تطبيق مرهم العيون العقيمة لعيون الفأر بعد الاستقراء وقبل إيداعه في الماسح الضوئي الحيوانات الأليفة.
  4. سرعة نقل الماوس إلى جدول الحيوانات الأليفة الماسح ضوئي في موقف المعرضة رءوسهم صبا مع مخروط الآنف إيسوفلوراني. ووصف الموقف التنفس والمسابير المستقيم ومراقبة معدل درجة الحرارة والتنفس ضمان الإبقاء على الظروف الفسيولوجية خلال التجربة كما سبق 44.
  5. ابدأ الحصول على البيانات الحيوانات الأليفة باستخدام إعداد وضع عينات عادية ونافذة بالطاقة من 250-650 كيلو إلكترون فولط. عادة ما يكون مسح ثابت 45 دقيقة كل الماوس كافية لتوفير الأحداث تزامنت كافية لإعادة الإعمار وإنتاج صور الحيوانات الأليفة ذات جودة عالية.
  6. بعد المسح 64Cu-التيار المتردد، إزالة الماوس من الماسح الضوئي ووضعه مرة أخرى في القفص. السماح للماوس لاستعادة بشكل كاف قبل العودة إلى مرفق الحيوان.
  7. الحصول على الصور أعيد بناؤها باستخدام تكرارات 20 من خوارزمية "تعظيم التوقعات احتمال الحد الأقصى" ثلاثي الأبعاد.
  8. أداء المنطقة لتحليل الفائدة (ROI) للورم وبصريا قابلاً الأجهزة باستخدام البرمجيات أميد.
    1. رسم رويس للحصول على البيانات الكمية %ID/g باستخدام إعداد أداة يدوية ثلاثية الأبعاد يدوياً وتحدد بعناية الأورام أو عضلة الفخذ المجاور. سيتم تحويل التهم كل بكسل في العائد على الاستثمار إلى %ID/g من الخطوة السابقة 4.2.
  9. قارن 64Cu-A14، 64Cu-A14-تشاكنلس، صور 64Cu-A14-NLS للورم التباين، والكمية دوروا % معرف/ز، ونسب الورم إلى الخلفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للإجراء 1، تعديل تشييد 3 7 مع تشاكنلس باستخدام سالفو-بين الموظفين كما كروسلينكير موثوق بها للغاية. عادة، عند تحميلها على جل 12% وتحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، هذه النتائج يمكن تمييزها زيادات متدرجة متناسبة مع زيادة نسب سالفو-بين الموظفين-إلى-7 3 ميغاواط في استخدامها ويسمح للسلاسل الثقيلة والخفيفة إلى تقييم فردي تشاكنلس الاقتران (الشكل 3). وكان رد فعل ز 7 3 10-، 20--، 25-ونسب سولفو-بين الموظفين-إلى-7 3 50 إلى 1 متبوعاً بقياس الترددات اللاسلكية ونتائج الاستقراء ميغاواط في 3 و 7 و 10، وجزيئات تشاكنلس 20 كل 3 7. بقياس كثافة، هي الأنواع مونومر المئوية > 90% 3 7 تعديل مع تشاكنلس 3-10. 3-تشاكنلس ز 720 هو الأنواع التجميعية 45%. وهذا يدل على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بسيطة بعد متزاوجة فعالة لتحديد ز 7 3-تشاكنلس لمزيد من التنمية. وعلى الرغم من تلطيخ طفيف مع سلاسل جسم يمكن أن تحدث الواجب glycosylation جسم هذا لا تتداخل مع تحديد الأنواع التجميعية.

للإجراء 2، يوضح بيانات تمثيلية الاختلافات بين استخدام التربسين ولا التربسين عند تقييم المستمدة من الفيروسات ACs تعديل الببتيد لتراكم الكفاءة داخل الخلايا. في هذا المثال، يمكن تقييم قدرة ز 7 3-تشاكنلس زيادة تراكمه داخل الخلايا في الخلايا تعامل مع أو بدون التربسين (الشكل 4). ومع ذلك، يتضح أهمية تريبسينيزيشن عند تفسير تراكم يصرف تستخدم للمقارنة لتحديد كفاءة التيار المتردد والانتقائية. تريبسينيزيشن يسمح لمستوى خط الأساس الأسفار داخل الخلايا ينشأ كما لاحظ مع غير معدلة 7 3. يمكن أحد بالتفصيل أن 3 7 يقتصر على السيتوبلازم في البؤر الصغيرة. وفي المقابل، الخلايا التي لم يتم تريبسينيزيد، الأسفار الخاصة 3 ز 7 يقتصر على سطح الخلية بسبب أوفيريكسبريشن لايل-3Rα على سطح الخلية. وهذا يجعل من الصعب على التحقيق في التراكم داخل الخلايا والتوزيع نظراً للأسفار في سطح الخلية يسيطر على وهكذا كتل الأسفار داخل الخلايا من يجري تصور. تريبسينيزينج الخلايا مهم أيضا عند تقييم خصوصية كدليل مع مفتش-تشاكنلس. يمكننا أن نرى أن هناك بعض الأسفار غير محددة من سطح الخلية ولكن لن يكون قادراً على تحديد مستوى تراكم داخل الخلايا الناجمة عن الببتيد إذا كانت لا تريبسينيزيد الخلايا. وأخيراً، دون تريبسينيزيشن واحدة يمكن زورا تفسير أن AC المطورة حديثا لا تتراكم داخل الخلايا المستهدفة. كما رأينا مع ز 7 3-NLS، الخلايا التي لا تريبسينيزيد معظم الأسفار هو مرة أخرى من سطح الخلية. وبعد تريبسينيزيشن، يستطيع المرء أن يلاحظ أن تتراكم ز 7 3-NLS، وأن كانت محدودة، داخل الخلايا المستهدفة.

للإجراء 3، يوضح بيانات تمثيلية مراقبة الجودة لكفاءة إيصال حمولة البناء، وتقارب، و في المختبر ، وخصوصية ل النظائر المشعة 64الاتحاد الجمركي مع A14-تشاكنلس. إجراء قياس كثافة في الصور الشعاعية التي اتخذت من 12% هلام polyacrylamide تحتوي على 64Cu-A14، 64Cu-A14-NLS، أو 64Cu-A14-تشاكنلس تبين أن يصرف راديولابيليد الأنواع مونومر 100% (الشكل 5A). 64 تشاكنلس-Cu-A14 يظهر تقارب nanomolar لايل-5Rα. وكشفت A14-تشاكنلس كدالة لزيادة تركيزات 64Cu-A14-تشاكنلس ملزمة محددة اقترب من التشبع بتركيزات من 3-5 نانومتر HT-1376 والخلايا HT B9 (الشكل 5 (ب)). د. ك 64Cu-A14-تشاكنلس على الخلايا HT B9 HT-1376 وكان 6.4 ± 1.7 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط ± 0.8 3.1، على التوالي. تصريف تشاكنلس تخفيض تقارب A14 تقريبا 2.5-fold لايل-5Rα HT-1376 والخلايا HT B9. غاما عد يكشف عن أن الزيادة في النشاط الإشعاعي في النواة والسيتوبلازم ألقاه 64Cu-A14-تشاكنلس محددة ويزيد على مر الزمن (الشكل 6). عد غاما عادة يوضح تقريبا > 6-fold زيادة في تراكم النووية وداخل الخلايا في الخلايا تعامل مع 64Cu-A14-تشاكنلس مقارنة بالمعاملة مع 64Cu-A14-تشاكنلس حضور الزائدة A14 غير معدلة أو عندما يتم إجراء دراسات العلاج في 4 درجات مئوية (الشكل 6A). هناك أيضا ≥ 3-fold زيادة في النووية واختبارها داخل الخلايا تراكم 64Cu النسبي للخلايا تعامل مع 64Cu A14 و 64تشاكنلس Cu مفتش في جميع النقاط الزمنية (الشكل 6B).

الرقم 7 يدل على أهمية البروتوكول تجزئة الخلية. كانت المحتضنة الخلايا HT-1376 و HT-B9 مع المخزن المؤقت لتحلل غشاء البلازما التي تحتوي على 1% أو 2%، أو 4% NP-40. حصرا يجب أن تحتوي على نواة معزولة لمين المكيفات. تبعاً لذلك ينبغي أن تكون الكسور هيولى الحصري ل Rab7. كعنصر تحكم، يجب أن تكون الخلايا كله تفكيك مع المخزن المؤقت للمعهد الملكي إيجابية بالنسبة "مكيف لمين" في كلا الكسور. ويبين هذا البروتوكول أنه عند تقييم الكسر النووية لتفكيك خلايا HT-1376، هناك لا Rab7 الحالية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك لا يوجد "مكيف لمين" موجودة في الكسر هيولى. ومع ذلك، هناك كمية أقل من Rab7 في السيتوبلازم مأخوذة من خلايا تفكيك مع 4% NP-40 (الشكل 7 أ). وهذا يوحي على الأرجح العازلة تحلل NP-40 4% هو إفساد الغشاء النووي بالإضافة إلى غشاء البلازما. وهذا يؤدي إلى خلط من البروتينات النووية مع البروتينات هيولى ومما يخفف تركيز Rab 7. وهذا ما يفسر انخفاض مقدار 7 Rab الحالية. خلايا HT-B9 حتى أكثر حساسية من الخلايا HT-1376. عند التعامل مع المخزن المؤقت لتحلل غشاء البلازما تحتوي على 4% NP-40، مكيف لمين ينظر بشكل واضح في الكسر هيولى (الشكل 7). وهناك انخفاض مقابل مبلغ "مكيف لمين" في الكسر النووية. كما تتحسس الخلايا HT B9 في المخزن المؤقت لتحلل NP-40 2% كما هو انخفاض كمية Rab7 في الكسر هيولى واضح بالنسبة إلى 1% NP-40. وهكذا، ينبغي أن أحد تحسين تجزئة الخلوية مع خلايا معينة من الفائدة حتى تكون النتائج الكمية من تراكم حمولة في الفضاء داخل الخلايا ونواة دقيقة. هذا أمر مهم لتقييم كفاءة النووية ترجمة رواية التيار المتردد.

4 الإجراء، يسمح تصوير الحيوانات الأليفة في حقن بعد ح 48 64Cu A14 أو 64Cu-A14-NLS، أو 64Cu-A14-تشاكنلس في الفئران التي تحمل HT-1376 وتكثيفها هيتيروتوبيك HT-B9 على عكس الخلفيتين لتصور ورم استهداف الممتلكات (الشكل 8). كما هو الحال في مثالنا، يكشف الفحص البصري للصور الحيوانات الأليفة HT-1376 والورم HT-B9 إمكانات الاستهداف 64Cu-A14-تشاكنلس و 64Cu A14 64Cu-A14-NLS (الشكل 8 أ). ومع ذلك، في الحالات التي يكون فيها الفحص البصري صعوبة مع الأورام HT-B9، يمكن استخدام تحليل العائد على الاستثمار لتحديد نسب الورم للعضلات (8B الشكل).

Figure 1
رقم 1: تعديل تشاكنلس مابس- NLS المخلفات من "كبير" SV-40 تي-مستضد (ككركف) هي تقع بين بقايا مباعدة توج سيستين الطرفي ن. ويقترن حمض الكوليك (قوس الخضراء) إلى سيستين كما هو موضح سابقا 34. بعد البناء وتنقية تشاكنلس، يتم استخدام مجموعة سلفهيدريل سيستين للتصريف عن طريق التنسيق سالفو (قوس أحمر؛ أظهرت الفعل تعلق الإنسان والمحيط الحيوي). ملاحظة: ماب (150 كاتشين) وتشاكنلس (1.8 كاتشين) هي ليست مقياس. تكييف وطبع بإذن من باكيت، يحسن تصريف حمض M. et al. NLS-الكوليك إلى جسم إيل-5Rαspecific تراكم الخلوية وخصائص المجراة في استهداف الورم في نموذج سرطان مثانة. الكيمياء بيوكونجوجاتي- doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).
-

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي نهج العلاج خلية التيار المتردد وتجهيزها للتحليل بالفحص المجهري [كنفوكل] وتحليل نوعية تجزئة الخلية. الأسهم الحمراء تتوافق مع الخطوات الأساسية 2.2 و 2.3 3.15 3.15.4. تكييف وطبع بإذن من بيدوان، س. تشاكنلس وآخرون، وتعديل رواية جسم-يصرف سمحت المستهدفة الخاصة بخلية اندوسومال هربا من، والتعريب إلى النواة، وتعزيز مجموع تراكم داخل الخلايا. الصيدﻻنيات الجزيئية. 13 (6)، عام 1915-1926، doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 3
رقم 3: تحليل لتعديل تشاكنلس مابس- خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-صفحة عرض سلم قيد التشغيل (L) مع الأوزان الجزيئية المقابلة في كيلودالتون (كاتشين) وغير معدلة 7 3 السلاسل الثقيلة والخفيفة كمراجع. الطرق التالية هي عصابات الهجرة من السلاسل الثقيلة والخفيفة من 3 7 تعديل مع 3، 7 و 10 و 20 تشاكنلس.

Figure 4
الشكل 4: تحليل ماب "التوزيع داخل الخلايا" وتراكم. صور مجهرية [كنفوكل] توضح 3 7 داخل الخلايا التوزيع وتراكم fluorescence النسبي في خلايا سرطان الدم إيل-3Rα-إيجابية تعامل مع 3 7، ز 7 3-تشاكنلس، مفتش، ومفتش-تشاكنلس. الخلايا تريبسينيزيد أو لا تريبسينيزيد قبل التثبيت. ملطخة الأنوية مع يوديد propidium (PI؛ الأحمر)، صبغ مكافحة AF647 Fc مورين (ماب؛ الأخضر)، ودمج PI/ماب. مقياس 50 ميكرومتر. داخل التربسين ولا توجد مجموعات التربسين، الصور تم الحصول عليها مع إعدادات أداة متطابقة بين ACs مختلفة تظهر. الجزء التربسين من الرقم 4 هو مقتبس من ريفيفينسي 34 مع الإذن. تكييف وطبع بإذن من بيدوان، س. et al. تشاكنلس، وتعديل رواية للأجسام المضادة-يصرف تسمح باستهداف خلية على حدة اندوسومال الهروب، الترجمة إلى النواة، وتعزيز مجموع تراكم داخل الخلايا. الصيدﻻنيات الجزيئية. 13 (6)، عام 1915-1926، doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 5
الشكل 5:64 Cu-A14-تشاكنلس النقاء وتقارب. A14-تشاكنلس (A) نقاء الكيمياء الإشعاعية من 64A14 المسمى الاتحاد الجمركي، A14-NLS، تم التحقق من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة متبوعاً أوتوراديوجرافي. (ب) منحنيات ملزمة محددة ل 64Cu A14 و 64Cu-A14-تشاكنلس على الخلايا HT-1376 و HT-B9. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري لأداء في تكرار التجربة. تكييف وطبع بإذن من باكيت، وآخرون. ويحسن تصريف حمض الكوليك NLS بجسم إيل-5Rα-خاصة بتراكم الخلوية وخصائص المجراة في استهداف الورم في نموذج سرطان مثانة. الكيمياء بيوكونجوجاتي- doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 6
الشكل 6:64 Cu النووية داخل الخلايا التكديس. مثال لعلاج الخلايا أداؤها في ثلاث نسخ (أشرطة الخطأ تدل على الانحراف المعياري) لبيان خصوصية (A) و (ب) تعزيز تراكم 64Cu-A14-تشاكنلس. ويرد التراكم % في نواة (لوحات الأيسر) وإجمالي المساحة داخل الخلايا (لوحات الحق) بالنسبة إلى المبلغ الإجمالي للنشاط الإشعاعي المستخدمة أثناء فترة علاج خلايا سرطان المثانة الغازية إيل-5Rα-إيجابية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري لأداء في تكرار التجربة. * يشير إلى ≤0.05 ف .

Figure 7
رقم 7: التحليل الداخلي وجود الخلية. لطخة غربية الكسور النووي (أ) و (ب) Cytoplasmic لمكيف لمين (البقع الأعلى؛ الأسهم الحمراء) و 7 Rab (البقع أسفل؛ السهام السوداء) التي تم الحصول عليها من معاملة HT-1376 والخلايا HT B9 في غشاء البلازما تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 1% أو 2%، أو 4 % NP-40. استخدمت الخلايا كله تفكيك مع المخزن المؤقت للمعهد الملكي كمراقبة إيجابية لمكيف لمين و Rab7 في كلا الكسور. معايير التشغيل (L) يصور فقط في البقع الأعلى. يتم عرض الأسهم الثلاثة "مكيف لمين" سبب لها isoforms متعددة. تكييف وطبع بإذن من باكيت, M. et al. ويحسن تصريف حمض الكوليك NLS بجسم إيل-5Rα-خاصة بتراكم الخلوية وخصائص المجراة في استهداف الورم في نموذج سرطان مثانة. الكيمياء بيوكونجوجاتي- doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 8
الشكل 8: في فيفو تحليل من استهداف الورم بتصوير الحيوانات الأليفة وتحليل العائد على الاستثمار. صور الحيوانات الأليفة (A) في ح 48 بعد حقن الفئران إيماءة/مشمولان واضعة HT-1376 (الأسهم الحمراء)، والأورام HT-B9 (الأسهم الزرقاء) حقن الوريد مع 64Cu A14 و 64Cu-A14-NLS 64Cu-A14-تشاكنلس. السهم الأخضر امتصاص الكبد. سيظهر مع دائرة أرجواني الرسم دوروا العضلات. (ب) "العائد على الاستثمار" HT-1376 و HT-B9 نسب الورم للعضلات للرابطة في 48 ساعة بعد الحقن. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري للتجربة في n = 10 رويس للماوس (n = 5). * يشير إلى p 0.05.

تأت
كجقفكفيتكالجيسيجركرقرربقجس 20
كفيتكالجيسيجركررقرربقجسقثقفسلسكق 30
كجيسيجركرقرر 29
جركرقرربقجيك 22,25
ترقارنرررروريرقرجك 26
NLS
كجيجبككركفج 21,23,24,27
حمض الكوليك-كجيجبككركفج 34

الجدول 1: قائمة تأت وكبير SV-40 تي-مستضد المستمدة الببتيدات المستخدمة في "التعديلات التيار المتردد".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأهداف الرئيسية لإيصال النظمية لعوامل مضادة للسرطان هي زيادة تراكم في موقع الورم، وامتصاص داخل خلايا السرطان، وتقليل الآثار الجانبية غير المرغوب فيها في الأنسجة السليمة. ميلان يستهدف إيصال حمولات الجزيئية للخلايا السرطانية نهج واعدة جداً لعلاج والكشف عن أورام. ومع ذلك، عدم كفاءة الناجمة عن فخ دخلول وأسفل تيار التدهور الليزوزومية يظل يشكل تحديا هاما. بينما يستخدم هذا البروتوكول الببتيد تشاكنلس كمثال لبناء الجيل القادم ACs، الإجراءات الموصوفة قابلة للتكيف للتيار المتردد الببتيد تعديل أي يجري تطويرها بهدف زيادة مقدار الحمولة المسلمة داخل الخلايا لاستهداف الخلايا السرطانية.

أن الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول: 1) تحديد وحصر ميغاواط عالية التجميعية الأنواع؛ 2) تريبسينيزيشن الخلايا قبل التحليل لتحديد تراكم داخل الخلايا؛ 3) أداء الجودة لإجراءات تجزئة الخلوية؛ و 4) أداء الحيوانات الأليفة التصوير لتقييم الورم الاستهداف في فيفو.

من المهم على تصريف الببتيدات المشتقة من الفيروس إلى مابس لا يؤدي ارتفاع الأنواع التجميعية ميغاواط ناجم على الأرجح عن crosslinking إينتراموليكولار بين مابس. هذا هو الشاغل الأول، وينبغي أن تعالج قبل مواصلة التقدم. المضي قدما مع الرابطة تعديل الببتيد تحتوي على مجاميع غير المرغوب فيها يمكن أن يعطي نتائج تقديم أدلة كاذبة بشأن جوانب مثل ملامح تسليم الحمولة داخل الخلايا و في فيفو . ماليميديس رد الفعل على مابس ما على الأرجح المسؤول عن تجميع التساهمي. حل واحد لخفض نسبة سالفو بين الموظفين إلى ماب. وثمة بديل آخر استخدام مشتقات الأحماض الأمينية مثل Cys، ليز، ن-أسيتيل له وسر، ومنتدى المجالس الرومانسية أثناء الاقتران الببتيد ل تنشيط ماليميدي ماب 45. سلاسل لتفاعلات الجانبية قادرون على تتفاعل مع مجموعة ماليميدي من بين الموظفين وتقليل كروسلينكينج داخل جسم. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الفاصل بحجم الاستبعاد اللوني بعد الاقتران لعزل مونومر الأنواع 45. يمكن أيضا إجراء تصريف الببتيد للأجسام المضادة الخاصة بالموقع. على سبيل المثال، يمكن تعديل جسم الكربوهيدرات للتصريف على الببتيدات، التي أظهرت أن كفاءة إنتاج مونومر الأنواع 24.

الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع 12% polyacrylamide الهلام طريقة رخيصة وفعالة للحصول على منظور واسع من اختلافات كبيرة الحجم في الأنواع التيار المتردد. إذا تم استخدام زيادة بولياكريلاميدي في المائة، سيكون من الصعب التمييز بين الفصل بين الأنواع إينتراموليكولار وسلاسل ثقيلة. على العكس من ذلك، إذا تم استخدام polyacrylamide % انخفاض، من المحتمل أن تشغيل إيقاف الهلام سلاسل خفيفة. وتوفر المواد الهلامية المتدرجة التي تحتوي على بولياكريلاميدي 4-20% أيضا تحولات الأداء الجيد للسلاسل الثقيلة والخفيفة في جل واحد. بين مختلف التقنيات التحليلية المتاحة لتحليل الجزيئية البيولوجية، كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء والشعرية التفريد-الحزب الديمقراطي الصربي متفوقة على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لفصل وتوصيف ACs 46. ومع ذلك، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أسلوب المبكر وغير مكلفة لتحليل بناء هذه العوامل الرواية الأولى وثم اتخاذ قرار بشأن مسار العمل التالي.

الحضانة للخلايا في محلول يحتوي على 0.25% التربسين (الخطوة 2، 3)، الذي يقوم بإزالة أكبر عدد ممكن من سطح الخلية البروتينات و ACs منضم مهم لأنه يسمح لتحسن التصور والزيادات النسبية في التراكم داخل الخلايا بين مرجع الأجسام المضادة. يتم تعيين المعلمات الكاميرا لالتقاط الصور بكثافة الأسفار كحد أقصى. وهذا بسبب التباين من خلية إلى مبلغ قدرة التيار المتردد التي تراكمت. وهكذا، التقاط الصور في أقصى شدتها يسمح للخلايا مع تراكم التيار المتردد أقل كما يجب تقييم. ومع ذلك، عادة أعرب المستضدات السرطان عاليا على الخلايا السرطانية. إذا لم تعرض الخلايا الهضم قبل التربسين، ثم fluorescence المنبثقة عن الرابطة في سطح الخلية سوف تهيمن على الصورة. وباﻹضافة إلى ذلك، دون تريبسينيزيشن يمكن أن تكون التنمية محدودة مع الرابطة مع خصائص خفية ولكنها كبيرة من تراكم داخل الخلايا.

ضمان وجود الخلوية ذات جودة عالية من المهم لتقييم دقة تراكم 64Cu في النواة مقابل السيتوبلازم. ويرجع قدرة تشاكنلس على زيادة تراكم داخل الخلايا التيار المتردد وحمولة التعريب النشطة إلى نواة 34. كما يتم تطوير الببتيدات الفيروس مستقبلا، قد ترجمة هذه الببتيدات أيضا إلى نواة كجزء من إليه لزيادة كفاءة حمولة داخل الخلايا. وبالتالي، من المهم وجود الهاتف الخلوي أن تكون ذات جودة عالية دقة تفاصيل هذه العملية. ويؤكد هذا البروتوكول أهمية تقييم الأنوية لعلامات هيولى والكسر هيولى لعلامات النووية أيضا. على سبيل المثال، هو جين تاو et al.، وضع التيار متردد تعديل مع تأت ببتيد واستكشاف النووية تراكم حمولة النظائر المشعة 24. تحليل لطخة غربية كالبين، بروتين هيولى وفيرة، كان حاضرا في الكسر النووية. وكان هذا على الأرجح لأن استخدمت مجموعات العزلة النووية التجارية. أظهر هذا البروتوكول أن HT-1376 و HT-B9 الخلايا المطلوبة تركيزات مختلفة من NP-40 بغية عزل نواة المخصب مع أغشية سالمة. عندما تم تفكيك الخلايا HT B9 مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على 4% NP-40، مكيف لمين كان حاضرا في كسر هيولى تشير إلى المعاملة تعطلت الأغشية النووية وسمحت "مكيف لمين" بالدخول السيتوبلازم. إذا لم تكن معزولة الكسور النووية وهيولي بعناية، يمكن صعوبة تحديد المساهمة للتعريب النووية إلى مجموع تراكم داخل الخلايا. وهناك تقارير الببتيدات البيولوجية ومصطنع-المشتقة التي تستهدف على وجه التحديد المقصورات الأخرى داخل الخلايا مثل هيولى، وجهاز غولجي، والميتوكوندريا 47،،من4849. وبالتالي، تزداد أهمية عزل المقصورات داخل الخلايا.

ينتهي هذا البروتوكول مع الوصف الخاص به من استهداف 64Cu-A14-تشاكنلس HT-1376 وأورام HT-B9. يتضح من الفحص البصري للصور الحيوانات الأليفة في الشكل 8، بزيادة إشارة الورم الحيوانات الأليفة بالنسبة المتاخمة خفضت المحيطة بخلفية 64Cu-A14-تشاكنلس قد تستهدف متفوقة الأورام السرطانية HT-1376 و HT-B9 (الشكل 8 أ ). كما يوضح تحليل العائد على الاستثمار في قدرتها على تقييم استهداف الورم. في المثال الخاص بنا، نحن نستخدم نسب العائد على الاستثمار الورم للعضلات للتحديد الكمي لاستهداف الورم وتثبت 64Cu-A14-تشاكنلس AC سوبيريور (الرقم 8B). تصوير الحيوانات الأليفة يسمح أيضا للتقييم لعزل التيار المتردد في أجهزة صحية. الكبد هو الجهاز الرئيسي الذي يؤيض الأجسام المضادة. يوضح الشكل 8 أ يماثل الإقبال في الكبد في الفئران حقن مع 64Cu-A14-تشاكنلس و 64Cu A14. وتقترح هذه البيانات في هذه المرحلة المبكرة من التنمية، تشاكنلس لا تتسبب في عزل غير المرغوب فيها. 64 وقد Cu نصف عمر ح 12.7، التي ليست مثالية للرابطة أن يكون نصف العمر لعدة أيام. كما هو موضح سابقا في البروتوكول البصرية زيجليس ولويس، يتم استخدام النظائر المشعة المعمرة الزركونيوم-89 (89Zr) حمولة نصف الحياة المادية التي هي مثالية مابس ويمكن تصويرها بالحيوانات الأليفة 50. وهكذا، لتقييم إنجاز الورم على مدى عدة أيام، 89Zr خيار مفضل. هذا مهم خاصة إذا كان العلاج هو هدف حيث امتصاص الورم عالية مواتية ويزيد على مر الزمن مع الأجسام المضادة 7. يجب أيضا إجراء بيوديستريبوشن لتحديد امتصاص الجهاز الفردي لمواصلة استكشاف استهداف أو عزل خصائص حديثا وضعت رابطة الدول الكاريبية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن بريدوسيد الفئران مع جسم محددة غير معدلة لحجب المواقع مستقبلات على الخلايا السرطانية لتقييم خصوصية الاستهداف. ومع ذلك، توفر 64الاتحاد الجمركي مع تصوير الحيوانات الأليفة وتحليل العائد على الاستثمار بما فيه الكفاية تقييما أولياً للورم خصائص التسليم للرابطة المتقدمة الواردة في هذا البروتوكول.

حتى الآن، اقتصرت ACs تعديل مع الببتيدات المشتقة من الفيروس إلى تسليم النظائر المشعة. وهذا يعزى جزئيا إلى أسباب تاريخية وأيضا للنظائر المشعة بسهولة كمياً خلال في المختبر و في فيفو الاختبار، ويمكن تصور استخدام طرائق التصوير موسع في كامل الجسم. وبطبيعة الحال، كما يوسع هذا الحقل إلى النقل وتسليم الحمولات خلاف النظائر المشعة، مثل تشريعات والأنزيمات النوكليوتيد، التعديلات على الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول سيكون توضع. على سبيل المثال، سيتعين الرواية أساليب تقييم تراكم داخل الخلايا من حمولات بديلة توضع. وباﻹضافة إلى ذلك، تعديلات في فيفو التقييم سوف نحلة ضرورية لا يمكن تصويرها بسهولة هذه الحمولات ولذلك سيكون من الصعب تقييم كفاءة امتصاص بيوديستريبوشن، وخصوصية، والورم. لهذه الأسباب، ينبغي أن تظل الحمولات النويدات المشعة حمولات مركب للتنمية في المستقبل مع الشحنات البديلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من جمعية أبحاث السرطان (كندا) وفي CIMS. يشكر المؤلفون الدكتور سامية آيت-مهند وجان-فرانسوا Beaudoin للحصول على المساعدة. الدكتور أنخيل لوبيز (جامعة جنوب أستراليا) للإنسان والمحيط الحيوي A14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 133، المستمدة من الفيروسية الببتيدات، جسم-يصرف، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، مجهرية [كنفوكل]، وتجزئة الخلوية، النحاس-64، وتصوير الحيوانات الأليفة
تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaudoin, S., Paquette, M.,… More

Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter